廉佳，王瑩，林楊楊，李欽峰

（天津市兒童醫(yī)院，天津 300074）

大皰性表皮松解癥（Epidermolysis bullosa，EB）是一組以摩擦后起皰為臨床特點的單基因遺傳病，根據透射電鏡下水皰的位置分為單純型、交界型、營養(yǎng)不良型和Kindler綜合征。營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥（DEB）由編碼Ⅶ型膠原的COL7A1基因發(fā)生突變所致，目前共發(fā)現基因突變位點841個，通常有種族和家族特異性，僅個別為復發(fā)性突變[1]。DEB根據遺傳方式分為常染色體顯性DEB（DDEB，OMIM 131750）和常染色體隱性 DEB（RDEB，OMIM 226600），兩型臨床表現相似，均以皮膚黏膜受輕微摩擦后出現水皰、大皰，愈后形成瘢痕為主要特點，相同分型有泛發(fā)型、脛前型、癢疹型和新生兒EB四型[2]。脛前型 DEB（Pretibial dystrophic epidermolysis bullosa，DEB-Pt，OMIM 131850） 的臨床特點是脛前區(qū)為主的瘙癢性水皰和萎縮性瘢痕，是DEB的一種罕見亞型，母子同患脛前型DEB更為罕見，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒男，7歲，因雙下肢摩擦后反復出現水皰、破潰、瘢痕，伴瘙癢7年，就診于我院。患兒自生后雙側足踝摩擦、搔抓或磕碰后出現水皰，水皰易破；膝部、手指伸側關節(jié)處摩擦后出現水皰，水皰破潰愈合后留有瘢痕；皮疹范圍逐漸擴展至小腿、膝部、腰背部等，以足踝及膝部為重，皮疹瘙癢明顯，部分指（趾）甲變形。體格檢查：發(fā)育正常，營養(yǎng)中等，各系統(tǒng)檢查未見異常。輔助檢查：血尿便常規(guī)、肝腎功能、電解質未見異常；心電圖、胸片、腹部B超未見明顯異常；甲真菌鏡檢陰性。皮膚科檢查：腰背部、膝部、足踝部淡紅色增生性瘢痕，瘢痕中間和邊緣可見散在粟丘疹；手指伸側關節(jié)處大小不等的紫紅色丘疹、萎縮性瘢痕；部分水皰破潰后出現糜爛、結痂；指（趾）甲甲板表面凹凸不平，部分甲板增厚、變形，呈黑褐色，見圖1?？谇火つの匆姰惓?，牙齒無明顯異常。患兒父母非近親結婚，其父及姐姐表型正常，其母有類似病史。先證者母親臨床表現與先證者類似，自幼雙下肢反復出現水皰、破潰，愈后形成瘢痕，現雙下肢伸側自膝關節(jié)至足背彌漫暗紅色斑片，脛前皮膚萎縮如羊皮紙樣，足踝部、腰部、右肘部瘢痕部分融合呈斑塊，趾甲增厚；皮疹上有較多米粒至指甲蓋大糜爛面，部分結血痂，見圖2。

圖1 先證者臨床圖片

圖2 先證者母親臨床圖片

1.2 家系調查 先證者家族中無近親婚配史，5代28名家庭成員中10例發(fā)病，男女各5例，無性別差異，家系圖見圖3；家系中每代均有發(fā)病，發(fā)病患者雙親必有一方是患者，未患本病者與正常人結婚后其子代不發(fā)病，符合常染色體顯性遺傳特點。

圖3 先證者家系圖

1.3 基因檢測方法 經患者及家屬簽署知情同意書后，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管抽取患兒及其父母和姐姐外周靜脈血2 mL，采用QIAampDNA提取試劑盒（GIAGEN公司）提取基因組DNA，并測量其吸光度值及濃度（基因檢測由廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司完成）。

1.3.1 第二代高通量測序技術進行醫(yī)學全外顯子組檢測 提取的DNA用DNA酶片段化后用磁珠法進行純化，純化后的產物按照Illumina測序說明書進行文庫構建，構建好的文庫在Nexseq500測序儀（Illumina Inc，USA）上進行測序。

1.3.2 數據分析 所有數據用Burrow-Wheeler Aligner（BWA）算法比對到參考序列（UCSC hg19），采用儀器默認設置，使用文獻報道方法對數據進行注釋。經篩選流程篩選，并結合患兒臨床資料和生物信息學軟件（PolyPhen2、LRT、Mutation Taster等）預測結果，對各個基因的功能、變異情況以及遺傳模式進行分析，得到可疑候選突變。

1.3.3 Sanger測序驗證 對可以候選突變的位點設計PCR引物進行擴增及進行Sanger測序驗證，對患兒父母和姐姐相應位點進行檢測。

2 結果

2.1 目標基因捕獲和高通量測序結果 測序結果對擴增的PCR產物直接測序進行分析，先證者COL7A1基因攜帶2個雜合變異，均位于74號外顯子上。第6 181-1位點至6 197位點發(fā)生重復突變，預計使編碼蛋白質的2 061位氨基酸Lys至2 066位氨基酸Glu發(fā)生重復，見圖4；同時第6 199位點發(fā)生甘氨酸（Gly）替換突變，鳥嘌呤（G）變?yōu)橄汆堰剩ˋ），使得三螺旋區(qū)第2 067位密碼子由GCT變成ACT，預計編碼蛋白質第2 067位氨基酸由Gly變?yōu)榫彼幔ˋrg），見圖5。

圖4 先證者及母COL7A1基因第74號外顯子上c.6181-1_6197dup雜合突變

圖5 先證者及母COL7A1基因第74號外顯子上c.6199G＞A雜合突變

2.2 Sanger測序驗證結果 先證者攜帶COL7A1基因第74號外顯子上c.6181-1_6197dup和c.6199G＞A 2個雜合突變。先證者母親攜帶COL7A1基因第74號外顯子上這個雙雜合變突變，其父親未檢測到相關突變，先證者的突變全部來源于其母，結合家系調查，該家系遺傳方式符合常染色體顯性遺傳。

2.3 結果分析 c.6199G＞A為點突變，c.6181-1_6197dup為內含子和外顯子交界處的重復突變，這2個雜合突變均位于COL7A1基因74號外顯子上。先證者和其母同時存在這2個雜合突變，先證者父親和姐姐及100名無關正常對照者未檢測到此突變。查閱人類基因組突變數據庫（Human Genome Mutation Database）、dbSNP147數據庫、千人基因組等數據庫，僅有文獻報道c.6199G＞A；未報道c.6181-1_6197dup突變；也未報道c.6181-1_6197dup與c.6199G＞A同時出現雜合突變。先證者及其母突變位點相同，結合相似的臨床表現，推斷c.6181-1_6197dup與c.6199G＞A這個雙雜合突變可能是引起該患者家系臨床表型的特異突變。

2.4 診斷 本例患者根據病史、臨床表現、家系圖分析，結合基因結果，可以診斷為脛前型顯性DEB。

3 討論

目前DEB基因型-表型相關性尚未完全闡明，COL7A1突變的性質及其位置被認為與DEB表型的嚴重程度有關[3]。COL7A1基因是錨纖維的主要成分，含118個外顯子，是迄今為止所發(fā)現的含有最多外顯子的基因，其每一個功能區(qū)（三螺旋區(qū)、鉸鏈區(qū)、啟動子區(qū)、剪接位點、增強子區(qū)等）均可發(fā)生突變。Ⅶ型膠原中央為特征性Gly-X-Y重復序列構成的三螺旋區(qū)，其中包含39個氨基酸組成的較大片段（被稱為鉸鏈區(qū)）。既往研究表明RDEB的基因突變多為終止密碼的提前出現，可由錯義突變、無義突變、小片段缺失、剪切位點突變等導致，突變集中于外顯子72-74，靠近Ⅶ型膠原的“鉸鏈”區(qū)；DDEB多為Gly替代錯義突變導致，簇集發(fā)生于G1982W至G2079E范圍內，緊靠“鉸鏈”區(qū)下游[4]，RDEB和DDEB的基因突變均集中在此范圍，提示“鉸鏈”區(qū)可能是維持三螺旋結構穩(wěn)定的重要區(qū)域。

脛前型DEB（DEB-Pt）的突變包括錯義突變（73.68%）、缺失突變（10.53%）和剪接突變（15.79%）等[5]。本患兒74號外顯子上同時出現2個突變c.6181-1_6197dup與c.6199G＞A。這2個雜合突變均位于同一等位基因上，c.6181-1_6197dup位于外顯子和內含子交界部位，重復出現了c.6181-1_6197這一段氨基酸片段，緊鄰的位點6199鳥嘌呤（G）變?yōu)橄汆堰剩ˋ），即2 061位氨基酸Lys至2 066位氨基酸Glu發(fā)生重復的同時2 067位氨基酸由Gly變?yōu)锳rg發(fā)生Gly錯義突變，這2個連續(xù)的突變靠近維持三螺旋結構穩(wěn)定的鉸鏈區(qū)，導致三螺旋結構不穩(wěn)定，從而干擾Ⅶ膠原結構異常而致病。先證者與其母基因突變位點一致，在家族正常人及正常對照中均未檢測到，故推測c.6181-1_6197dup與c.6199G＞A這個雙雜合突變?yōu)楸炯蚁档奶禺愅蛔儭?/p>

先證者母親與先證者臨床表現類似，下肢皮膚摩擦或磕碰后出現水皰，愈合后留有萎縮性瘢痕，伴明顯瘙癢，家系調查中5代均有發(fā)病遺傳，符合常染色體顯性遺傳模式，結合COL7A1基因突變結果，診斷脛前型顯性DEB。DEB-Pt與癢疹型DEB部分臨床表現有重疊，故需鑒別；二者均為DEB的特殊類型，且皮疹以脛前為主，但癢疹型DEB臨床表現為紫紅色丘疹或結節(jié)，極難發(fā)現水皰，皮損范圍較DEB-Pt更為廣泛，且瘙癢更為劇烈。同時本病還需與其他EB亞型及扁平苔蘚、結節(jié)性癢疹等有相似臨床表現的疾病鑒別[4，6]。

DEB-Pt既往報道顯性占2/3，隱性占1/3，臨床以雙腿反復出現水皰、潰瘍、瘢痕且伴明顯瘙癢為特征，但皮疹范圍不局限在脛前區(qū)[7]，同一家系中臨床表型輕重差異也可很大。顯性皮損出現比隱性晚[8]，嬰幼兒期少見，常于兒童期發(fā)病，病情呈慢性進行性發(fā)展，進入青春期臨床癥狀加重。先證者及其母出生后即出現皮疹，發(fā)病年齡早于典型顯性脛前型DEB，且腰背部等非脛前區(qū)也出現相似皮疹，皮損面積較典型顯性脛前型DEB大。推測可能是脛前型DEB以單一雜合突變?yōu)橹鳎狙芯恐邢茸C者及其母在同一等位基因上連續(xù)出現2個不同類型的雜合突變，這一特異性雙雜合突變造成其臨床表現的特異性。

現先證者9歲，日常注意護理，保護易受摩擦部位，防止水皰發(fā)生，對于伴有滲出性傷口使用新型非黏連性硅膠敷料，減輕局部皮膚的摩擦，保持一個適當的傷口愈合環(huán)境，阻止?jié)B液浸漬傷口周圍皮膚。目前對于DEB的治療尚無有效方法，也無法治愈。DEB-Pt的治療方法同其他類型DEB，主要是止癢、減少創(chuàng)傷、預防繼發(fā)感染等對癥治療[9]。Chen等[10]認為口服鹽酸奧洛他定配合局部外用維生素E等傳統(tǒng)的治療方法可有效控制局部瘙癢。近年來新的治療方法以補充Ⅶ型膠原蛋白，從而恢復真表皮的正常黏附功能為研究方向，同時高濃度的皮內骨髓間充質干細胞注射，異體成纖維細胞、間充質基質細胞移植等其他細胞療法也是研究熱點[11]。筆者研究擴展了COL7A1基因突變數據庫，為遺傳咨詢、產前診斷、進一步的靶向治療等提供了依據。