靳玲兵，高天健，李一杰，趙昕馳，彭少兵*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.陜西省核桃工程技術(shù)研究中心，陜西 楊陵 712100)

核桃(Juglansregia)是核桃屬(Juglans)一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值顯著的木本糧油樹種，核桃屬有20多個(gè)種，中國是核桃起源地之一，至今已有2 000多a的栽培歷史[1]，在長期栽培過程中，我國選育出的核桃品種及類型超過500多個(gè)[2]，可供遺傳改良的核桃種質(zhì)資源日漸豐富。陜西核桃種植面積已超過6.67×105hm2，是中國核桃主產(chǎn)大省之一，隨著核桃種植面積快速擴(kuò)大，引入和培育的核桃種質(zhì)資源也越來越豐富，不同地區(qū)之間相互傳播和本地自然雜交形成遺傳多樣、變異復(fù)雜的品種和類型，導(dǎo)致全省核桃品種繁多混雜，難以區(qū)分。同時(shí)，種植面積廣泛卻單產(chǎn)低、良種利用率不高、品種混雜成為制約當(dāng)?shù)睾颂耶a(chǎn)業(yè)發(fā)展中的重要問題之一[3-4]。因此，建立一套準(zhǔn)確高效的核桃品種資源鑒別方法，對核桃良種的生產(chǎn)推廣、品種登記和產(chǎn)權(quán)保護(hù)等具有重要意義。

分子標(biāo)記是一種可以在DNA水平上直接體現(xiàn)多態(tài)性的高效遺傳標(biāo)記。因檢測方法準(zhǔn)確，周期短，材料不受生長發(fā)育時(shí)期、來源部位及環(huán)境條件限制，近年來得到了快速推廣應(yīng)用[5]。目前SSR(微衛(wèi)星標(biāo)記)和SNP(單核苷酸多態(tài)性技術(shù))分子標(biāo)記是公認(rèn)構(gòu)建指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的優(yōu)良標(biāo)記方法。這2種標(biāo)記方法各有優(yōu)勢,SNP數(shù)量多，分布廣泛，適用于快速、規(guī)?；Y查，相對成本高。SSR具有多態(tài)性豐富、共顯性、擴(kuò)增穩(wěn)定、獲取的信息含量高、簡單便捷等優(yōu)點(diǎn)[6-8]，且SSR分子標(biāo)記引物數(shù)量少，適合少量樣本檢測，所要求的實(shí)驗(yàn)平臺條件較低，已被廣泛應(yīng)用于枸杞[9]、楊樹[10]、榛子[11]、棗[12]、蘋果[13-14]等植物指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析等方面。

近些年來，國內(nèi)關(guān)于核桃資源的SSR研究日益增多。敬丹等[15]利用SSR標(biāo)記對分散于全國的78份核桃農(nóng)家品種及部分栽培種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)農(nóng)家品種與栽培種以及不同地理來源的核桃品種界限不明顯；吳濤等[16]以基于SSR標(biāo)記分析的云南省核桃資源的遺傳多樣性數(shù)據(jù)，構(gòu)建了云南省核桃種質(zhì)資源的核心種質(zhì)；周貝貝等[17]采用SSR分型技術(shù)建立了核桃親子鑒定方法，為核桃育種中解決親本不清問題提供了新的參考手段；彭少兵等[18]利用SSR技術(shù)分析了安康串狀核桃的起源及親緣關(guān)系。本研究選用陜西省栽培面積較多的本土培育核桃品種21個(gè)，綜合考慮檢測成本和高效準(zhǔn)確兩方面的因素，在利用傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳初步篩選SSR引物之后，再使用毛細(xì)管電泳檢測方法，采用熒光SSR分子標(biāo)記進(jìn)行核桃品種資源鑒別，分析不同供試核桃材料間的遺傳多樣性，使檢測結(jié)果更加精準(zhǔn)、高效，利用所獲得的可以區(qū)分供試核桃品種的SSR標(biāo)記構(gòu)建核桃品種指紋圖譜，以期為核桃品種的快速、準(zhǔn)確鑒定和地方核桃品種產(chǎn)權(quán)保護(hù)、生產(chǎn)應(yīng)用以及下一步進(jìn)行雜交育種提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的21份核桃材料(表1)均采自西北農(nóng)林科技大學(xué)山陽核桃試驗(yàn)示范站，是陜西核桃栽培和利用的主要品種，于2020年夏季采集各個(gè)核桃品種新抽生的較嫩葉片，裝入自封袋中及時(shí)用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，編號后置于-80 ℃冰箱中保存。

表1 供試材料

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 使用植物DNA提取試劑盒(TaKaRa)提取供試核桃葉片DNA，經(jīng)1%瓊脂糖電泳和NanoDrop 2000核酸測定儀檢測質(zhì)量后，將DNA濃度稀釋至25 ng·μL-1，用0.5 mL離心管分裝后放入-20 ℃冰箱，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)備用[19]。

1.2.2 SSR引物篩選 根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)[23]選擇20對SSR引物，委托西安擎科生物公司合成。PCR反應(yīng)體系總共20 μL，其中含有10 μL Taqmix(TIANGEN)，上游引物、下游引物各1 μL，模版DNA 2 μL，加ddH2O 6 μL補(bǔ)足。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。隨機(jī)選擇部分核桃品種為模板，吸取2 μL PCR 產(chǎn)物，采用8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行引物初篩。使用210 V穩(wěn)壓電泳2～2.5 h，在藍(lán)色指示劑距離底端1 cm時(shí)停止電泳。電泳結(jié)束之后在65 r·s-1的水平搖床上銀染顯色，過程如下：將帶有凝膠一面的玻璃板依次放入固定液(蒸餾水∶無水乙醇∶冰乙酸=280∶20∶1)和0.1%的AgNO3溶液中各10 min；最后放入顯影液(1.5%的NaOH溶液，4 ℃冰箱預(yù)冷，使用前加入2 mL甲醛)輕晃至條帶清晰出現(xiàn)時(shí)，停止顯色并拍照[18]。最終篩選出6對多態(tài)性豐富、擴(kuò)增效率好的SSR引物(表2)。

表2 SSR引物信息

1.2.3 毛細(xì)管電泳熒光檢測 對篩選出的6對SSR引物的正向5′端用6-FAM熒光集團(tuán)進(jìn)行修飾，SSR-PCR反應(yīng)體系共25 μL，其中包括模板DNA 1 μL(25 ng·μL-1)，上游引物0.5 μL(10 μmol·L-1)，下游引物0.5 μL(10 mmol·L-1)，dNTP 0.5 μL(10 mmol·L-1)，10×Taq Buffer(MgCl2)2.5 μL，Taq酶0.2 μL(5 U·μL-1)，加 ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃修復(fù)延伸10 min。電泳體系中包含PCR產(chǎn)物1 μL、分子量內(nèi)標(biāo)(LIZ 500)0.1 μL和去離子甲酰胺9.9 μL。98 ℃變性5 min，冷卻離心后使用ABI 3730XL型 DNA分析儀進(jìn)行檢測。引物標(biāo)記與電泳檢測均由上海生工生物技術(shù)公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Genemapper軟件讀取SSR片段數(shù)據(jù)并錄入Excel 2010，運(yùn)用DateFormater將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成相關(guān)軟件可以識別的格式，利用PopGen32軟件計(jì)算觀測等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne、Shannon信息指數(shù)I等遺傳多樣性相關(guān)指標(biāo)。同時(shí)利用NTSYSpc2.10軟件計(jì)算21個(gè)核桃品種間的遺傳相似系數(shù)，最后繪制UPGMA聚類[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

提取的DNA經(jīng)檢測(圖1)，顯示其DNA條帶清晰、無拖帶、無降解彌散，OD260/280在1.8～2.0，表明DNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

注：M.標(biāo)記基因DL 2 000 DNAladder；編號1～21同表1。

2.2 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

從20對引物進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)篩選出6對多態(tài)性豐富、擴(kuò)增效率好的SSR引物，檢測結(jié)果表明(表3)，6對核心引物在21份核桃品種中共擴(kuò)增出54個(gè)等位變異，擴(kuò)增范圍為7～11個(gè)，平均各對引物檢測位點(diǎn)9個(gè)；引物WJR031、WJR265、WJR281、WGA032、WGA321、和WGA331檢測出清晰的等位基因數(shù)分別為9、10、7、11、9個(gè)和8個(gè)，其中，引物WGA032擴(kuò)增出的等位基因數(shù)最多，引物WJR265次之，引物WJR281擴(kuò)增出的等位基因數(shù)最少。有效等位變異(Ne)變化范圍為3.737 3～5.690 3，平均為4.459 9；Shannon’s信息指數(shù)(I)變化范圍1.628 7～1.871 5，平均為1.790 1；說明供試核桃品種間具有較為豐富遺傳多樣性，選用的6個(gè)SSR標(biāo)記在參試核桃品種間多態(tài)性較高。

2.3 品種鑒定與指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)6對SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)不同標(biāo)記間相互組合，只需選取3對引物即可區(qū)分出21份供試核桃材料。第1步使用引物WJR265，可直接區(qū)分出供試材料中的10個(gè)核桃品種，剩余11個(gè)品種分為3組；第2步使用引物WGA331，可直接將‘遼核1、3、4號’、‘中林5號’和‘土奈爾’組，‘香玲’和‘清香’這2組材料分別逐一區(qū)分，另一組‘巨豐’、‘西林2號’、‘西扶1號’和‘西扶2號’這4個(gè)材料中，僅不能區(qū)分‘西扶1號’和‘西扶2號’2個(gè)品種；第3步使用WJR031、WJR281、WGA321或WGA032中的任何一個(gè)引物，即可區(qū)分最后2個(gè)品種，有4種不同組合。21個(gè)核桃品種具有各自特定的SSR指紋圖譜(表4)，圖2為標(biāo)記WJR265對部分核桃品種的毛細(xì)管電泳熒光檢測結(jié)果，在生產(chǎn)應(yīng)用中為核桃品種鑒定提供重要依據(jù)。

圖2 標(biāo)記WJR265對部分核桃品種的檢測結(jié)果

表3 SSR多態(tài)引物相關(guān)指標(biāo)

2.4 品種間遺傳關(guān)系聚類分析

統(tǒng)計(jì)6對引物對21個(gè)核桃品種的SSR檢測結(jié)果，采用DateFormater將Excel數(shù)據(jù)保存為NTSYSpc2.10軟件可以識別的格式，計(jì)算不同品種之間的遺傳相似系數(shù)(表5)。從表5可知，21份核桃品種的GS值為0.59～0.93。其中，‘遼核1號’和‘遼核3號’間的GS值最大，為0.93，表明這2個(gè)核桃品種之間的遺傳差異最小，親緣關(guān)系最近；‘契可’和‘西林2號’之間的GS值最小，為0.59，表明二者的遺傳多樣性相對較廣，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

用21個(gè)品種相似系數(shù)數(shù)據(jù)，選擇NTSYSpc 2.10軟件clustering菜單下的SAHN選項(xiàng)計(jì)算相關(guān)作圖數(shù)據(jù)，最后點(diǎn)擊graphics菜單下的tree plot選項(xiàng)，繪制出21個(gè)品種樹狀聚類圖(圖3)。聚類結(jié)果可知，約以GS值0.745為閾值，21份核桃材料被分為3個(gè)類群(SSR groups,Sg)，SgⅠ類群的5個(gè)品種中除‘遼核4號’以外，其余均為美國引進(jìn)的主栽品種，占供試材料總數(shù)的24%。SgⅡ類包括15個(gè)品種，占供試材料總數(shù)的71%。SgⅢ類只有紫仁1個(gè)品種，占供試材料總數(shù)的5%。約以GS值0.776為基準(zhǔn)，可以將SgⅡ類群分為SgⅡ-1、SgⅡ-2和SgⅡ-3這3個(gè)亞群，SgⅡ-1包括‘西扶1號’、‘西扶2號’、‘串狀核桃’、‘西洛2號’、‘香玲’、‘西林3號’、‘中林5號’、‘溫185’和‘元豐’9個(gè)核桃品種；SgⅡ-2類群中，‘清香’為日本引進(jìn)的晚實(shí)核桃品種，‘遼核1號’和‘遼核3號’親本相同，且親本中具有晚實(shí)品種；SgⅡ-3包括‘巨豐’和‘西林2號’，均為新疆核桃實(shí)生后代。聚類結(jié)果與供試材料的遺傳來源較為符合。

表4 21個(gè)核桃品種的SSR指紋圖譜

表5 21份供試樣本間的遺傳相似系數(shù)

圖3 基于6對SSR引物的核桃種質(zhì)資源聚類分析

3 結(jié)論與討論

在利用SSR標(biāo)記鑒定核桃品種時(shí)，將6對引物采用4種不同的引物組合方法，每3對一組對21個(gè)陜西主栽核桃品種進(jìn)行了品種鑒別和指紋圖譜構(gòu)建研究，說明了SSR熒光標(biāo)記技術(shù)可以有效地用于核桃品種資源指紋圖譜構(gòu)建及遺傳關(guān)系研究，并在其基礎(chǔ)上簡單分析了供試材料的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目前這些核桃主栽品種之間的遺傳相似度較高。

隨著核桃種質(zhì)資源的不斷豐富，品種日益增多，進(jìn)行品種區(qū)分和鑒定對于核桃良種選育、增產(chǎn)增收十分重要。陜西核桃種植面積大，栽培集中，品種繁多混雜，缺乏經(jīng)驗(yàn)者往往難以通過果形、枝條、葉片等傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定核桃品種，更因受環(huán)境、物候期、時(shí)間等因素影響難以及時(shí)得到準(zhǔn)確鑒定結(jié)果。在不同群體間，由于基因組中簡單重復(fù)序列的大小和拷貝數(shù)不同，SSR標(biāo)記可以通過不同長度多態(tài)性片段來區(qū)分近緣種間關(guān)系，在植物品種資源鑒別和DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建上具有獨(dú)特的優(yōu)越性。

利用SSR標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定，篩選引物至關(guān)重要。毛細(xì)管電泳技術(shù)具有高效、精確、污染少、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，能更好地減少試驗(yàn)過程中的人為和系統(tǒng)誤差。周于波等[4]利用SSR毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)對四川地區(qū)29個(gè)核桃良種進(jìn)行分析，11對引物共檢測到80個(gè)等位基因121個(gè)基因型,各引物等位基因數(shù)為5～12，篩選出的高多態(tài)性引物運(yùn)用于四川核桃遺傳多樣性研究。但對多對引物進(jìn)行熒光標(biāo)記則引物成本較高，影響實(shí)際應(yīng)用，為了篩選出多態(tài)性高的SSR引物，本研究首先隨機(jī)選取部分核桃品種利用8%PAGE檢測進(jìn)行引物初篩，將從20對引物中篩選出的6對多態(tài)性高的SSR引物用熒光染料標(biāo)記，再利用毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)區(qū)分核桃品種數(shù)最少的引物WJR031，也可將供試材料分為9組，充分體現(xiàn)了SSR標(biāo)記用于核桃品種鑒定的高效性。理論上講，使用的標(biāo)記數(shù)量越多，聚類分析出來的結(jié)果越準(zhǔn)確。本試驗(yàn)選用的6對引物共檢測到54個(gè)等位基因，各引物等位基因數(shù)為7～11，平均每對引物檢測位點(diǎn)9個(gè)，能很好地用于對21份供試核桃材料的鑒定，與史麗會等[2]、楊本蕓等[3]關(guān)于核桃微衛(wèi)星標(biāo)記的研究相比，本研究所用引物鑒別能力更強(qiáng)，輔以熒光標(biāo)記檢測法，只需3對引物即可鑒別全部供試材料，效率高、成本低，可進(jìn)一步為核桃種質(zhì)資源鑒定提供參考。

陜西是我國核桃種植大省，在種質(zhì)資源的管理、保存、交換和利用等過程中，因品種混雜、純度降低造成的低產(chǎn)減產(chǎn)、良種利用效率低下的情況不在少數(shù)，明確優(yōu)良核桃品種真實(shí)性，對種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳關(guān)系和身份鑒定是一個(gè)較為繁瑣的工作[21]，DNA指紋技術(shù)是對植物品種進(jìn)行鑒定和分類的重要依據(jù)。本研究在肖志娟等[22]、陳凌娜等[23]基于ISSR和SSR技術(shù)分析核桃資源遺傳多樣性的基礎(chǔ)上，用篩選出6對高效的SSR引物加以熒光修飾，選用其中3對引物快速鑒定供試核桃品種資源后，構(gòu)建了陜西地方核桃品種指紋圖譜，成本低，方法簡便易行，獲得的分子圖譜可以作為核桃品種鑒定的依據(jù)，補(bǔ)充核桃指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，并為后續(xù)科研工作提供參考，為核桃品種的分類和利用進(jìn)一步提供了分子依據(jù)。