門(mén) 雪, 吳成新, 陳明麗, 王建華

(東北大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系分析科學(xué)研究中心, 遼寧 沈陽(yáng) 110819)

谷胱甘肽(GSH)是一種人體內(nèi)較豐富的含巰基的三肽化合物,在人體代謝中發(fā)揮重要的作用,如解毒作用和抗氧化作用等[1-5]。砷(As)和鉻(Cr)是工業(yè)上常用的兩種重金屬[6,7],其中As(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)毒性較強(qiáng)且會(huì)通過(guò)呼吸道、消化道等方式進(jìn)入人體而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),從而引起人體內(nèi)GSH的變化[8,9]。人體內(nèi)GSH的水平變化與多種疾病密切相關(guān)[10],如糖尿病、帕金森氏癥和阿爾茨海默氏癥等,研究發(fā)現(xiàn),腦谷胱甘肽是輕度認(rèn)知障礙和阿爾茨海默氏癥的一種新的生物標(biāo)志物[11]。現(xiàn)在臨床上常用的GSH分析檢測(cè)方法包括電化學(xué)法[12]、熒光法[13]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[14,15]、酶分析法[16,17]等。

毛細(xì)管電泳(CE)是一種具有納升級(jí)樣品量和較高分辨率等優(yōu)點(diǎn)的現(xiàn)代分離分析技術(shù),在生物樣品尤其是細(xì)胞檢測(cè)中具有極大的優(yōu)勢(shì)。激光誘導(dǎo)熒光法(LIF)是一種靈敏度極高的檢測(cè)器,因激光易于聚焦,具有高強(qiáng)度和單色性等特點(diǎn),尤其適合與樣品量極少的毛細(xì)管電泳聯(lián)用。CE-LIF聯(lián)用法具有靈敏度高、樣品量小和設(shè)備簡(jiǎn)單易造等特點(diǎn),尤其適合細(xì)胞內(nèi)GSH的定量分析[18]。然而,上述方法中使用了乙腈等有機(jī)溶劑,有機(jī)溶劑的揮發(fā)會(huì)導(dǎo)致方法的穩(wěn)定性較差。

本文構(gòu)建了毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng),優(yōu)化了緩沖溶液的成分和其他實(shí)驗(yàn)條件,建立了一種穩(wěn)定且靈敏的GSH檢測(cè)方法。研究了肝癌細(xì)胞(HepG2)內(nèi)GSH含量與金屬形態(tài)和濃度之間的關(guān)系,從結(jié)果可以看出,細(xì)胞內(nèi)GSH水平的變化,在一定程度上可以用來(lái)評(píng)估細(xì)胞毒性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

構(gòu)建毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng),如圖1所示,其中,未修飾的熔融石英毛細(xì)管(內(nèi)徑50 μm,外徑360 μm,總長(zhǎng)度29.5 cm,有效長(zhǎng)度25.5 cm,河北永年銳灃色譜器件有限公司)作為分離毛細(xì)管。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器為實(shí)驗(yàn)室基于共聚焦模式自主搭建[19],其主要參數(shù)如下:473 nm激光(20 mW,遠(yuǎn)明激光,寧波)作為光源,激發(fā)光濾光片為470 nm的帶通濾光片(匯博光學(xué),沈陽(yáng)),二向色鏡截止波長(zhǎng)為500 nm(匯博光學(xué)),聚焦物鏡為40 X平場(chǎng)物鏡(型號(hào)NA. 0.6,工作距離3.98 mm,大悅維佳,北京),發(fā)射光濾光片為535 nm的帶通濾光片(匯博光學(xué)),采光針孔孔徑為0.4 mm,以光電倍增管(H10722-20,濱松,日本)作為光電探測(cè)器進(jìn)行光信號(hào)采集和轉(zhuǎn)換,以數(shù)據(jù)采集卡(USB-6009, National Instruments,美國(guó))及實(shí)驗(yàn)室在LabVIEW平臺(tái)編寫(xiě)的相關(guān)軟件進(jìn)行儀器控制及數(shù)據(jù)采集。Allegra高速冷凍離心機(jī)和HERA Cell 150細(xì)胞培養(yǎng)箱分別購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司和美國(guó)Thermo Scientific公司。SynergyH1酶標(biāo)儀和BX53M正置顯微鏡購(gòu)自美國(guó)BioTek公司和日本Olympus公司。KQ-100DB超聲波清洗器和08-Ⅲ非接觸式超聲波細(xì)胞破碎儀分別購(gòu)自江蘇昆山市超聲儀器有限公司和寧波新芝生物科技股份有限公司。XPE105DR分析天平購(gòu)自上海梅特勒-托利多國(guó)際有限公司。

圖 1 毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of capillary electrophoresis-laser induced fluorescence detection device

硼砂(borate)、氫氧化鈉(NaOH)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、β-環(huán)糊精(β-CD)、亞砷酸鈉、砷酸氫二鈉、氯化鉻和重鉻酸鉀均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,2,3-萘二甲醛(NDA)、谷胱甘肽、十二烷基硫酸鈉(SDS)、曲拉通X100(Triton X100)、二甲基亞砜(DMSO)、鹽酸(HCl)、乙腈(色譜級(jí))和甲醇(色譜級(jí))購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。三羥甲基氨基甲烷(Tris)、達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)(DMEM)培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購(gòu)自美侖生物技術(shù)有限公司,胎牛血清、抗生素(鏈霉素和青霉素)分別購(gòu)自美國(guó)Clark和HyClone公司。HepG2細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。實(shí)驗(yàn)室用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制備。除標(biāo)有純度的試劑外,以上試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量GSH固體,溶于超純水中,配制成10.00 mmol/L的GSH溶液備用,4 ℃避光保存。取適量GSH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用超純水稀釋成濃度分別為0.01、0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、20.00 μmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品預(yù)處理

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2培養(yǎng)基由50 mL胎牛血清(10%, v/v)、5 mL抗生素(青霉素100 U/mL,鏈霉素100 μg/mL)加入到450 mL DMEM高糖培養(yǎng)基中混合而成。HepG2細(xì)胞于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2細(xì)胞活力的測(cè)定

將HepG2細(xì)胞接種在96孔板中貼壁生長(zhǎng),然后加入As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)溶液(0、2、5、10、20、50和100 mg/L)孵育6 h。用PBS清洗兩次,加入100 μL含有0.05 mg/mL噻唑藍(lán)(MTT)的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育4 h。隨后,除去培養(yǎng)基,并在每個(gè)孔里加入150 μL DMSO(溶解甲瓚晶體),使用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)量每孔的吸光度。

1.3.3砷和鉻孵育的細(xì)胞樣品制備

將HepG2細(xì)胞分別接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中以貼壁生長(zhǎng),再加入As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)溶液(2和5 mg/L)孵育6 h,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。用PBS清洗3次后,收集細(xì)胞,凍干后,加入100 μL背景緩沖溶液,超聲裂解后進(jìn)行超速離心(12 000 r/min, 15 min),收集細(xì)胞裂解液并存放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4GSH的標(biāo)記和胞內(nèi)成像

標(biāo)記GSH:采用文獻(xiàn)報(bào)道的GSH標(biāo)記方法[20],并對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化。在背景緩沖溶液(20 mmol/L硼砂和2 mmol/Lβ-CD, pH 9.2)中加入1 μL GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μmol/L)和細(xì)胞裂解液,然后加入100 μmol/L的NDA溶液,反應(yīng)5 min后,樣品注入分離毛細(xì)管。

胞內(nèi)GSH成像:將HepG2細(xì)胞分別接種在96孔板中貼壁生長(zhǎng),再加入5 mg/L As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)溶液孵育6 h。經(jīng)PBS清洗2次后,每個(gè)孔里加入200 μL 1 mmol/L的NDA溶液,室溫下避光孵育10 min。經(jīng)PBS清洗3次以終止染色。最后,在每個(gè)孔里加入500 μL PBS,在正置顯微鏡下觀察和記錄,放大倍數(shù)為10倍。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件與數(shù)據(jù)處理

1.4.1CE-LIF條件

毛細(xì)管在使用前依次用甲醇、超純水、0.1 mol/L NaOH、超純水、0.1 mol/L HCl、超純水各沖洗10 min。每次進(jìn)樣前,用0.1 mol/L NaOH、超純水和背景緩沖溶液沖洗1 min。重力進(jìn)樣,抬高10 cm,進(jìn)樣10 s,室溫20 ℃下,陽(yáng)極進(jìn)樣,陰極檢測(cè),電壓為14 kV,激發(fā)波長(zhǎng)為473 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm。背景緩沖溶液、GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液和細(xì)胞裂解液在電泳之前需經(jīng)0.22 μm微孔濾膜(水系)過(guò)濾,并超聲脫氣5 min。

1.4.2數(shù)據(jù)處理

GSH的定量數(shù)據(jù)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的電泳分析軟件計(jì)算峰面積后,再用Excel和GraphPad Prism進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)分析。電泳圖直接由Origin Pro2016繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳條件優(yōu)化

2.1.1緩沖溶液種類(lèi)和pH值的影響

電泳緩沖溶液對(duì)標(biāo)記反應(yīng)和電泳性能起著至關(guān)重要的作用。為了選擇合適的緩沖溶液,使用酶標(biāo)儀考察了在20 mmol/L的硼砂和Tris兩種緩沖溶液(Tris pH 7.4和pH 9.2,硼砂pH 9.2)下GSH(10.00 μmol/L)與NDA(100 μmol/L)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。每個(gè)條件運(yùn)行時(shí)間30 min,時(shí)間間隔1 min,激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為473 nm,發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)為528 nm,檢測(cè)高度為4.4 mm。結(jié)果如圖2所示,在硼砂緩沖液中(pH 9.2), NDA自身不發(fā)熒光,當(dāng)加入GSH后,NDA衍生GSH產(chǎn)生熒光產(chǎn)物[20],在5 min內(nèi)達(dá)到反應(yīng)平衡且在30 min內(nèi)保持穩(wěn)定,而在Tris緩沖液中(pH 9.2), GSH與NDA反應(yīng)在25 min達(dá)到平衡,平衡時(shí)NDA-GSH的熒光強(qiáng)度也弱于在硼砂緩沖液(pH 9.2)中的熒光強(qiáng)度。在pH為7.4的Tris緩沖液中,反應(yīng)平衡時(shí)間相較于在pH為9.2的Tris緩沖液中縮短10 min,但熒光強(qiáng)度較弱?？紤]到反應(yīng)時(shí)間和熒光強(qiáng)度,選擇pH為9.2的硼砂緩沖液作為GSH電泳分析的緩沖液。

圖 2 背景緩沖液對(duì)GSH與NDA反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響(n=3)Fig. 2 Effect of background buffers on reaction kinetics of NDA-GSH (n=3) NDA: 2,3-naphthalenedicarboxaldehyde; GSH: glutathione; Tris: tris(hydroxymethyl)aminomethane.

2.1.2添加劑的選擇和條件優(yōu)化

為了在保證電泳穩(wěn)定性的同時(shí)提高NDA-GSH的靈敏度,使用酶標(biāo)儀考察了在20 mmol/L硼砂緩沖液中加入10 mmol/L SDS、5 mmol/L CTAB、5 mmol/L Triton X100和10 mmol/Lβ-CD時(shí)NDA-GSH的靈敏度。圖3a和3b中,反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的參數(shù)設(shè)置與2.1.1節(jié)相同，NDA-GSH的發(fā)射光譜是NDA與GSH衍生5 min后,在激發(fā)波長(zhǎng)為473 nm下獲得的。結(jié)果表明,在硼砂緩沖液中加入以上4種添加劑后,NDA-GSH的靈敏度都有所提高,NDA-GSH的發(fā)光特性沒(méi)有明顯改變,發(fā)射波長(zhǎng)保持在528 nm左右。當(dāng)CTAB和β-CD加入后,NDA-GSH的靈敏度明顯提高。SDS和Triton X100的加入也對(duì)提高NDA-GSH的靈敏度有所幫助,但是平衡時(shí)間在10 min內(nèi)。綜合考慮反應(yīng)時(shí)間和靈敏度,進(jìn)一步在緩沖液中加入CTAB和β-CD進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。如圖3c所示,當(dāng)加入CTAB后,沒(méi)有樣品峰出現(xiàn),可能是CTAB作為一種陽(yáng)離子型表面活性劑,改變了電滲流的方向。當(dāng)加入β-CD后,NDA-GSH的信號(hào)明顯增強(qiáng),遷移時(shí)間也縮短至3 min內(nèi)。于是,進(jìn)一步考察了β-CD的濃度對(duì)NDA-GSH靈敏度的影響。隨著β-CD濃度的增加,NDA-GSH的遷移時(shí)間縮短,其信號(hào)強(qiáng)度先增大后減小,在β-CD濃度為2 mmol/L時(shí),NDA-GSH的信號(hào)最強(qiáng)(見(jiàn)圖3c)。因此,最終使用的背景緩沖溶液組成為20 mmol/L硼砂和2 mmol/Lβ-CD的混合溶液。

圖 3 硼砂緩沖液中的添加劑對(duì)NDA-GSH靈敏度的影響Fig. 3 Influence of additives in borate buffer on the sensitivity of NDA-GSH a. reaction kinetics of GSH with NDA (n=3); b. emission spectra of NDA-GSH; c. electrophoretograms of NDA-GSH. SDS: sodium dodecyl sulfate; CTAB: cetyl trimethyl ammonium bromide; β-CD: β-cyclodextrin. Peak identification: ※ NDA-GSH.

2.2 方法性能

2.2.1分析性能

采用1.2節(jié)的方法,制備0.01、0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、20.00 μmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化的條件下,每份溶液平行3次,用實(shí)驗(yàn)室的電泳分析軟件對(duì)峰面積積分,以峰面積為縱坐標(biāo)(y), GSH的濃度為橫坐標(biāo)(x, μmol/L),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,GSH在0.01～20.00 μmol/L范圍內(nèi),與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0.21x+0.000 4,相關(guān)系數(shù)為0.999 3。以信噪比為3(S/N=3)和10(S/N=10)確定GSH的檢出限和定量限,分別為0.006 μmol/L和0.020 μmol/L。與現(xiàn)有的文獻(xiàn)[20]相比,該方法GSH的檢測(cè)靈敏度提高了約40倍。

2.2.2準(zhǔn)確度和精密度

以稀釋200倍的空白細(xì)胞裂解液為基質(zhì)進(jìn)行低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)濃度分別為0.10、1.00、10.00 μmol/L,在優(yōu)化的條件下,每個(gè)水平平行測(cè)定3次。結(jié)果如表1所示,GSH的回收率為95.7%～112.6%,精密度為3.8%～5.0%,表明該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好,證明了其在細(xì)胞內(nèi)GSH分析中的可靠性。

表 1 GSH在細(xì)胞裂解液中的加標(biāo)回收率和精密度(n=3)Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of GSH in cell lysate (n=3)

2.3 砷和鉻對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平的影響

2.3.1細(xì)胞活性和形態(tài)

為了研究砷和鉻對(duì)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的毒性大小與細(xì)胞內(nèi)GSH含量的關(guān)系,首先考察了不同價(jià)態(tài)的砷和鉻對(duì)細(xì)胞的活性影響(見(jiàn)圖4)。從圖4可知,在研究的濃度范圍內(nèi),As(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)對(duì)細(xì)胞的毒性隨濃度的增加逐漸增大,而As(Ⅴ)和Cr(Ⅲ)沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞有明顯的毒性。質(zhì)量濃度為5 mg/L的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)對(duì)細(xì)胞刺激后的細(xì)胞活性分別為96%、98%、96%和89%。4種元素形態(tài)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性大小順序?yàn)?Cr(Ⅵ)>As(Ⅲ)≈Cr(Ⅲ)>As(Ⅴ)。考察了2 mg/L(低劑量)和5 mg/L(高劑量)的4種元素形態(tài)對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響。根據(jù)文獻(xiàn)[21]報(bào)道,細(xì)胞內(nèi)GSH的含量隨著暴露金屬濃度的增加而減少。因此,考察了高劑量的4種元素刺激細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞成像效果。如圖4所示,以高劑量刺激細(xì)胞仍然可以檢測(cè)到NDA-GSH的熒光信號(hào),表明以高劑量刺激細(xì)胞確保了細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)的GSH,并且不會(huì)影響細(xì)胞的形態(tài)。另外,通過(guò)Image J軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度分析,5 mg/L的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)對(duì)細(xì)胞刺激后的胞內(nèi)NDA-GSH的平均熒光強(qiáng)度值依次為69.9、54.1、62.6、54.7和48.5。平均熒光強(qiáng)度值越大,說(shuō)明GSH含量越高。Cr(Ⅵ)刺激后胞內(nèi)的NDA-GSH熒光強(qiáng)度最低,說(shuō)明胞內(nèi)GSH含量最低,并且Cr(Ⅵ)的細(xì)胞毒性最強(qiáng)。初步表明細(xì)胞毒性越強(qiáng),其胞內(nèi)GSH含量越低。

圖 4 (a)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性(n=4)和(b)胞內(nèi)GSH成像Fig. 4 (a) Cell viability (n=4) and (b) intracellular GSH imaging of HepG2 cells HepG2 cells were stimulated with As(Ⅲ), As(Ⅴ), Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) for 6 h.

2.3.2砷和鉻的形態(tài)和濃度對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響

用構(gòu)建的毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光系統(tǒng)研究了砷和鉻的形態(tài)和濃度對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響。以低劑量和高劑量As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)刺激HepG2細(xì)胞6 h后,在優(yōu)化的電泳條件下,胞內(nèi)的GSH含量和細(xì)胞裂解液電泳結(jié)果如圖5所示,通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品電泳譜圖的遷移時(shí)間比對(duì)和標(biāo)準(zhǔn)加入法來(lái)鑒別細(xì)胞裂解液中的GSH。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,相比對(duì)照組,以低劑量和高劑量的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和Cr(Ⅲ)刺激細(xì)胞,胞內(nèi)GSH的含量變化沒(méi)有顯著差異。然而,相比對(duì)照組,以高劑量Cr(Ⅵ)刺激細(xì)胞,胞內(nèi)GSH的含量顯著降低(P<0.01),并且胞內(nèi)GSH的含量與以高劑量Cr(Ⅲ)刺激細(xì)胞時(shí)具有明顯差異(P<0.05)。這進(jìn)一步表明了細(xì)胞毒性越大,胞內(nèi)GSH的含量越低。

圖 5 (a)HepG2細(xì)胞內(nèi)的GSH含量的統(tǒng)計(jì)分析(n=3)和(b)細(xì)胞裂解液的電泳圖Fig. 5 (a) Statistical analysis of GSH content in HepG2 cells (n=3) and (b) electrophoretograms of the cell lysate a. HepG2 cells were stimulated by As(Ⅲ), As(Ⅴ), Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) for 6 h (n=3, t-test, **P<0.01, * P<0.05, comparison of differences between the two groups).

3 結(jié)論

本研究建立了一種毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)HepG2細(xì)胞中GSH含量的方法。通過(guò)該方法研究了砷和鉻的形態(tài)和濃度對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響,以毒性較強(qiáng)的高劑量Cr(Ⅵ)刺激細(xì)胞導(dǎo)致胞內(nèi)GSH含量顯著降低,表明胞內(nèi)GSH含量與細(xì)胞毒性相關(guān),即細(xì)胞毒性越大,胞內(nèi)GSH的含量越低。該方法靈敏度高,穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度高,為重金屬的濃度監(jiān)測(cè)和評(píng)估重金屬對(duì)細(xì)胞的毒性影響提供了新的手段。