卞淼 逄利

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，病情危重、救治難度大、死亡率高。重癥肺炎是導(dǎo)致膿毒癥的常見病因，早期識別可能發(fā)展為膿毒癥的重癥肺炎患者并進(jìn)行干預(yù)有助于降低膿毒癥發(fā)生率、改善預(yù)后[1-2]。炎癥反應(yīng)激活是重癥肺炎及膿毒癥發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)，微小RNA(microRNA，miR)是一類在體內(nèi)分布廣泛的小分子RNA，肺內(nèi)多種miRs參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控，不僅可以作為防治肺部感染及肺損傷的靶點(diǎn)，還能作為評價(jià)病情及預(yù)后的外周血標(biāo)志物[3]。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過全血miR芯片檢測技術(shù)證實(shí)，膿毒癥小鼠模型中miR-let-7d、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107、miR-451的表達(dá)發(fā)生顯著變化[4]，提示上述幾種miRs可能參與膿毒癥的發(fā)病。本研究將以此為基礎(chǔ)，對上述幾種miRs用于肺炎合并膿毒癥診斷及預(yù)后評價(jià)的價(jià)值展開探討。

資料與方法

一、研究對象

選擇2019年1月—2021年8月期間在我院就診的肺炎患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南(2016年版)》[5]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)臨床資料完整；(3)入院后留取外周靜脈血；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院前接受過抗感染治療；(2)合并肺結(jié)核、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺膿腫等肺疾病；(3)合并惡性腫瘤、正在接受激素治療的患者。共納入128例肺炎患者，根據(jù)《中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》[6]將其分為肺炎合并膿毒癥組、不合并膿毒癥的肺炎組。另取同期在我院體檢的60例健康者作為對照組。肺炎合并膿毒癥組共45例，男25例、女性20例，年齡41～67歲、平均(58.59±9.39)歲；肺炎組共83例，男性51例、女性32例，年齡38～68歲、平均(60.03±8.57)歲；對照組中男性36例、女性24例，年齡35～65歲、平均(58.77±9.32)歲。三組間一般資料的比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。本研究取得醫(yī)院委員會(huì)批準(zhǔn)[臨審第(2021-216號)]。

二、研究方法

1 外周血miRs表達(dá)水平的檢測 取三組受試者的外周靜脈血3 mL。采用全血RNA提取試劑盒(北京天根公司)分離外周血RNA，采用miR cDNA第一鏈合成試劑盒合成將miR反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用miR熒光定量檢測試劑盒配置miR檢測的PCR反應(yīng)體系，具體如下：cDNA 2μL、試劑盒內(nèi)反應(yīng)液10μL、10μmol/L上游引物0.4μL、試劑盒中的通用下游引物0.4μL、去離子水補(bǔ)足至20.0μL。將上述反應(yīng)體系放入熒光定量PCR儀(Bio-rad公司)，按照下列程序進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)：95℃ 15 min后94℃ 20s、60℃ 34s、重復(fù)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后生成循環(huán)曲線并得到循環(huán)閾值，以U6為內(nèi)參，計(jì)算miR-let-7d、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107、miR-451的表達(dá)量。

2 肺炎合并膿毒癥病情嚴(yán)重程度的評估 查閱肺炎合并膿毒癥患者的病歷，采用以下指標(biāo)評估病情嚴(yán)重程度：急性生理和慢性健康評分Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEU)、超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、降鈣素原(PCT)。

3 肺炎合并膿毒癥預(yù)后的評價(jià) 根據(jù)入院后28d的生存情況評價(jià)預(yù)后，包括生存患者和死亡患者。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0軟件錄入數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，3組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩計(jì)量資料間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，采用ROC曲線分析miRs用于診斷及預(yù)后評價(jià)的效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、三組受試者外周血miRs表達(dá)水平的比較

與對照組比較，肺炎合并膿毒癥組、肺炎組的外周血let-7d、miR-15b、miR-107、miR-451表達(dá)水平增加，miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103表達(dá)水平降低(P<0.05)；與肺炎組比較，肺炎合并膿毒癥組的外周血miR-107表達(dá)水平增加，miR-16、miR-25、miR-103表達(dá)水平降低(P<0.05)，let-7d、miR-15b、miR-92a、miR-451表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見表1)。

表1 三組受試者外周血miRs表達(dá)水平的比較

二、外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表達(dá)水平對肺炎合并膿毒癥的診斷價(jià)值

外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表達(dá)水平診斷肺炎合并膿毒癥的ROC曲線(見圖1)，經(jīng)ROC曲線分析，四項(xiàng)指標(biāo)區(qū)分單純肺炎與肺炎合并膿毒癥的效能(見表2)。

圖1 外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表達(dá)水平診斷肺炎合并膿毒癥的ROC曲線

表2 外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表達(dá)水平診斷肺炎合并膿毒癥的ROC曲線分析

三、外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107與肺炎合并膿毒癥病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性

外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107與肺炎合并膿毒癥病情嚴(yán)重程度相關(guān)性的Pearson檢驗(yàn)如下：肺炎合并膿毒癥患者外周血miR-16、miR-25、miR-103表達(dá)水平與APACHE Ⅱ評分、WBC、NEU、hs-CRP、PCT呈負(fù)相關(guān)，miR-107表達(dá)水平與APACHE Ⅱ評分、WBC、NEU、hs-CRP、PCT呈正相關(guān)(見表3)。

表3 外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107與肺炎合并膿毒癥病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性

四、肺炎合并膿毒癥組中生存患者與死亡患者外周血miRs表達(dá)水平的比較

與肺炎合并膿毒癥組中生存患者比較，死亡患者外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103表達(dá)水平降低，miR-107表達(dá)水平增加(P<0.05)，let-7d、miR-15b、miR-451表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見表4)。

表4 肺炎合并膿毒癥組中生存患者與死亡患者外周血miRs表達(dá)水平的比較

五、外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表達(dá)水平對肺炎合并膿毒癥預(yù)后的預(yù)測價(jià)值

外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表達(dá)水平預(yù)測肺炎合并膿毒癥預(yù)后的ROC曲線(見圖2)，經(jīng)ROC曲線分析，五項(xiàng)指標(biāo)對肺炎合并膿毒癥預(yù)后的預(yù)測效能(見表5)。

表5 外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表達(dá)水平預(yù)測肺炎合并膿毒癥預(yù)后的ROC曲線分析

圖2 外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表達(dá)水平預(yù)測肺炎合并膿毒癥預(yù)后的ROC曲線

討 論

重癥肺炎病情重，嚴(yán)重者會(huì)發(fā)展為膿毒癥，臨床救治難度大、死亡率高[7-8]。因此，深入認(rèn)識普通肺炎向膿毒癥發(fā)展的病理生理機(jī)制具有迫切的臨床需求。miR是近些年分子生物學(xué)領(lǐng)域及表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的熱門分子，目前的研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)的激活受到多種miR的調(diào)控，不同的miRs能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)Toll樣受體、核因子-κB、沉默信息調(diào)節(jié)因子1等基因的表達(dá)，進(jìn)而起到促炎或抗炎作用。在肺炎、胰腺炎等感染性疾病的研究中，相關(guān)的動(dòng)物模型中及相關(guān)的患者外周血中均存在多種miRs表達(dá)的變化[9-12]，提示miRs參與感染性疾病的發(fā)生發(fā)展且可以作為診斷疾病或評價(jià)病情的標(biāo)志物。

本研究使用外周血miRs作為標(biāo)志物、進(jìn)行肺炎合并膿毒癥的診斷及預(yù)后評價(jià)。Hsieh CH的研究在脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型中通過miRs芯片檢測證實(shí)miR-let-7d、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107、miR-451的表達(dá)發(fā)生顯著變化。本研究檢測了肺炎患者及肺炎合并膿毒癥患者外周血中上述miRs表達(dá)的變化，與肺炎患者比較，肺炎合并膿毒癥組的外周血miR-107表達(dá)水平增加，miR-16、miR-25、miR-103表達(dá)水平降低，提示四種miRs可能參與肺炎合并膿毒癥的發(fā)生；進(jìn)一步經(jīng)ROC曲線分析證實(shí)四種miRs對區(qū)分單純肺炎與肺炎合并膿毒癥具有診斷價(jià)值，提示四種miRs可以用于肺炎合并膿毒癥的早期診斷。

國內(nèi)外相關(guān)的研究結(jié)果認(rèn)為miR-16、miR-25、miR-103起到抗炎作用，miR-107起到促炎作用。孫小平的研究證實(shí)，miR-16可能通過與PPARγ相關(guān)作用的方式在膿毒癥細(xì)胞模型中抑制多種炎癥細(xì)胞因子的釋放[13]；吳斌[14]和Yao Y[15]的研究在膿毒癥引起腎損害和心肌損害的模型中證實(shí)miR-25起到組織保護(hù)作用、顯著減輕炎癥反應(yīng)；Yang M的研究證實(shí)miR-103靶向抑制Toll樣受體4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[16]；Wang S.的研究證實(shí)miR-107誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α的釋放并促進(jìn)炎癥反應(yīng)的激活[17]。本研究分析了四種miRs表達(dá)水平與肺炎合并膿毒癥病情的相關(guān)性，結(jié)果顯示：APACHE Ⅱ評分、WBC、NEU、hs-CRP、PCT等反映病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)與miR-107呈正相關(guān)，與miR-16、miR-25、miR-103呈負(fù)相關(guān)，表明在肺炎合并膿毒癥的發(fā)病過程中miR-107表達(dá)增加及miR-16、miR-25、miR-103表達(dá)降低與病情加重、炎癥反應(yīng)激活有關(guān)。

最后，本研究還對肺炎合并膿毒癥患者的預(yù)后進(jìn)行了評價(jià)。肺炎進(jìn)展為膿毒癥后極大地增加了救治難度，臨床患者的死亡率較高。本文評價(jià)了肺炎合并膿毒癥患者的28d生存和死亡情況，45例患者中共14例死亡、死亡率31.11%；通過比較生存與死亡患者外周血 miRs的差異可知：與生存患者比較，死亡患者外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103表達(dá)水平降低，miR-107表達(dá)水平增加；進(jìn)一步進(jìn)行ROC曲線分析可知：上述五種miRs對肺炎合并膿毒癥患者的28d生存和死亡情況具有預(yù)測價(jià)值。

綜上所述，外周血多種miRs可用于肺炎合并膿毒癥的診斷及預(yù)后評價(jià)；miR-16、miR-25、miR-103、miR-107可用于肺炎合并膿毒癥的診斷且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)；miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107可用于肺炎合并膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)測。本研究的以上結(jié)果為今后深入認(rèn)識肺炎合并膿毒癥發(fā)生的病理生理機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的防治靶點(diǎn)及評估的分子標(biāo)志物提供了臨床研究依據(jù)。