田麗麗 丁北川 王嫩寒 王楠 張潔 楊新宇 任怡宣 趙琰楓 陳雙雙 羅萍 王秀雙 劉青 代小偉 李傳友

研究證實肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)，尤其是細(xì)胞免疫在肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[1-3]。在活動性肺結(jié)核治療過程中，γ-干擾素濃度隨時間變化的價值尚不明確[4]。早在1976年Genoud A.等[5]研究顯示結(jié)核病患者細(xì)胞和體液免疫之間有很好的相關(guān)性，說明在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程中體液免疫亦發(fā)揮著輔助作用[3，6-8]，國內(nèi)梁冰等[9]研究亦發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者PPD試驗和結(jié)核抗體水平之間存在著較高的一致性。為了進(jìn)一步確定這些指標(biāo)在結(jié)核病診斷和療效判斷方面的意義，本研究分析了本所門診收治的34例肺結(jié)核患者的資料，于治療不同階段行T-SPOT.TB、結(jié)核抗體、痰涂片+培養(yǎng)檢測，評價其細(xì)菌學(xué)與免疫學(xué)指標(biāo)動態(tài)變化情況及其臨床意義。

資料和方法

一、 一般資料

研究選取2020年8月-2021年5月北京結(jié)核病控制研究與防治所門診收治的34例初診病原學(xué)陽性且利福平敏感的肺結(jié)核患者(課題推進(jìn)期間不間斷聯(lián)系了73名患者，部分患者不同意簽署知情同意書；部分患者在治療過程中因為依從性差而中斷監(jiān)測；部分患者由于突發(fā)的新冠疫情原因，治療途中離開北京而中斷監(jiān)測，因此最終完成規(guī)劃監(jiān)測的患者只有34例)，所有納入的肺結(jié)核病例均符合我國肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288—2017)[10]中的確診病例；治療方案參照“肺結(jié)核診斷和治療指南”[11]中規(guī)定的化療方案；分別于治療前、治療2月、治療6月三個階段均行T-SPOT.TB、結(jié)核抗體、痰涂片+培養(yǎng)檢測。34例肺結(jié)核患者中，男性24例(70.59%)，女性10例(29.41%)；年齡21～70歲，平均年齡(44.47±17.84)歲。所有患者均排除肺部其他疾病、糖尿病、肝炎、腎臟病及免疫性疾病，未用過皮質(zhì)類固醇激素的患者。本研究經(jīng)本所倫理委員會批準(zhǔn)(批件號202002)，且征得患者同意并簽署知情同意書。

二、檢測方法

1 T-SPOT.TB檢測：采用結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑盒(TS-SPOT.TB試劑盒，北京同生時代生物技術(shù)有限公司)。從全血樣本中分離出外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在每個預(yù)包被抗γ干擾素抗體的孔中加入2.5×105個PBMC，分別與早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)和Rv3615c共同孵育16～20 h，使用讀板儀對斑點進(jìn)行計數(shù)。陽性判斷值：(1)陰性對照孔斑點數(shù)≤10，超過10個視為無效檢測樣本；(2)陽性對照孔斑點數(shù)應(yīng)當(dāng)≥20個或布滿整個孔底，如果斑點數(shù)<20個時，且通過檢測孔與陰性對照孔判定結(jié)果為陽性，則視為陽性結(jié)果，否則為無效樣本； (3)當(dāng)陽性對照孔斑點數(shù)≥20個時，T-N等于5、6、7時，此結(jié)果認(rèn)為是灰區(qū)，應(yīng)當(dāng)結(jié)合其他臨床診斷信息進(jìn)行判斷，必要時重復(fù)實驗。

2 結(jié)核抗體檢測：結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)(MP Diagnostics ASSURE? TB Rapid Test)購自MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司(MP Biomedicals Asia Pacific)。取患者血清25μl至檢測孔內(nèi)，加3滴緩沖液于橢圓孔，直至樣本前沿到達(dá)藍(lán)色指示線后，即刻拉下分離片，加1滴緩沖液于加樣孔，水平放置，15 min內(nèi)判讀結(jié)果。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：(1)如果在測試線處(T)和質(zhì)控線處(C)出現(xiàn)紫紅色條帶，則結(jié)核分枝桿菌抗體為陽性，任何深度條帶均應(yīng)判作陽性；(2)如果視窗內(nèi)僅質(zhì)控線處(C)顯示紫紅色條帶，則結(jié)核分枝桿菌抗體陰性；(3)如果質(zhì)控線處(C)條帶未顯示，則結(jié)果無效。

3 GeneXpert法：GeneXpert MTB/RIF核酸檢測儀及試劑由美國 Cepheid公司生產(chǎn)。檢測嚴(yán)格按照說明書操作，取 1 mL痰標(biāo)本，加入2 mL標(biāo)本處理液，震蕩混勻，靜置 15 min后，吸取2 mL液化標(biāo)本于反應(yīng)盒內(nèi)，將加好 標(biāo)本的反應(yīng)試劑盒放到檢測儀內(nèi)，開始自動檢測，反應(yīng)結(jié)束后在檢測系統(tǒng)窗口下直接觀察測試結(jié)果。

4 痰涂片+培養(yǎng)：萋-尼抗酸染色液、酸性羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。痰涂片抗酸染色鏡檢采用萋-尼染色，按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[12](簡稱《規(guī)程》)進(jìn)行抗酸桿菌痰涂片鏡檢；分枝桿菌固體培養(yǎng)采用簡單法，按照《規(guī)程》進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查。痰涂片、培養(yǎng)或GeneXpert任何1項結(jié)果陽性即判斷病原學(xué)陽性。

三、質(zhì)量控制

T-SPOT.TB檢測質(zhì)量控制：按照試劑盒內(nèi)提供的陽性對照和陰性對照，與樣品同時檢測，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性；結(jié)核抗體檢測質(zhì)量控制：根據(jù)檢測反應(yīng)板質(zhì)控線條帶顯示判斷，嚴(yán)格按照試劑盒檢測規(guī)程以保證檢測準(zhǔn)確性；GeneXpert法質(zhì)量控制：每個檢測方法定期進(jìn)行樣品處理質(zhì)量控制(SPC)和探針質(zhì)量控制(PCC)，以確保樣品經(jīng)過正確處理和探針符合指定的接受標(biāo)準(zhǔn)，保證檢測系統(tǒng)合格；痰涂片與培養(yǎng)質(zhì)量控制：按照《規(guī)程》要求，進(jìn)行抗酸桿菌痰涂片鏡檢及分枝桿菌培養(yǎng)的室內(nèi)質(zhì)量控制及室間質(zhì)量評價。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0、GraphPad Prism8.0.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計數(shù)資料采用“百分率(%)”表示，不同階段結(jié)果比較分析采用Fisher精確檢驗；計量資料不同階段結(jié)果比較分析采用配對t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、4種指標(biāo)治療前陽性檢出率的比較

34例菌陽肺結(jié)核中，治療前初次檢測痰涂片+培養(yǎng)陽性29例，陽性檢出率為85.29%；GeneXpert檢測陽性33例，陽性檢出率為97.06%；γ-干擾素檢測陽性34例，陽性檢出率為100%；結(jié)核抗體檢測陽性26例，陽性檢出率為76.47%(見表1)。4種檢測指標(biāo)中GeneXpert、γ-干擾素檢測陽性檢出率與結(jié)核抗體陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher精確檢驗P值=0.027，0.005，P<0.05)。

表1 4種指標(biāo)陽性檢出率比較

二、3種檢測指標(biāo)不同時間段(治療前、治療2月、治療6月)檢測結(jié)果比較

29例痰涂片+培養(yǎng)陽性的肺結(jié)核患者，治療2月陰轉(zhuǎn)26例，陰轉(zhuǎn)率89.66%(26/29)；治療6月全部陰轉(zhuǎn)，陰轉(zhuǎn)率100%(29/29)。其中治療2月未陰轉(zhuǎn)的3例患者為涂片陽性，培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。治療前與治療2月、治療6月痰涂片+培養(yǎng)檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher精確檢驗均P<0.001)，治療2月與治療6月痰涂片+培養(yǎng)檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher精確檢驗P值=0.239，P>0.05)(見表2)。

表2 3種檢測指標(biāo)治療前、治療2月、治療6月檢測結(jié)果比較

34例γ-干擾素釋放試驗陽性的肺結(jié)核患者，治療2月γ-干擾素檢測陰轉(zhuǎn)2例，陰轉(zhuǎn)率5.88%(2/34)；治療6月陰轉(zhuǎn)8例，陰轉(zhuǎn)率23.53%(8/34)。治療前與治療6月γ-干擾素釋放試驗檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher精確檢驗P值=0.005，P<0.05)，治療前與治療2月、治療2月與治療6月γ-干擾素釋放試驗檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

26例結(jié)核抗體陽性的肺結(jié)核患者中，治療2月結(jié)核抗體陰轉(zhuǎn)3例，陰轉(zhuǎn)率11.54%(3/26)；治療6月結(jié)核抗體陰轉(zhuǎn)7例，陰轉(zhuǎn)率26.92%(7/26)。治療前與治療6月、治療前與治療2月、治療2月與治療6月抗體檢測結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher精確檢驗P值=0.123，0.590，0.454，P>0.05)(見表2)。

三、γ-干擾素釋放試驗結(jié)核特異性抗原與植物血凝素(TBAg/PHA)比值在不同時間段(治療前、治療2月、治療6月)動態(tài)檢測結(jié)果比較

17例患者治療2月TBAg/PHA比值相比較于治療前下降超過50%，10例患者TBAg/PHA比值下降低于50%，7例患者TBAg/PHA比值比治療前較高，但低于50%；28例患者治療6月TBAg/PHA比值下降超過50%，4例TBAg/PHA比值下降低于50%，2例TBAg/PHA比值治療前與治療6月變化不大。治療前、治療6月TBAg/PHA比值分別為0.473±0.677、0.129±0.199(t=3.656，P=0.001，P<0.05)；治療前、治療2月后 TBAg/PHA比值分別為0.473±0.677、 0.261±0.483(t=3.428，P=0.002，P<0.05)；治療2月、治療6月TBAg/PHA比值分別為0.261±0.483、0.130±0.199(t=2.277，P=0.029，P<0.05)，治療前、治療2月、治療6月TBAg/PHA比值差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

圖1 結(jié)核特異性抗原與植物血凝素(TBAg/PHA)比值在抗結(jié)核治療不同時間段動態(tài)變化折線圖

討 論

在研究結(jié)核病免疫的過程中，普遍認(rèn)為以細(xì)胞免疫為主，體液免疫為輔[3,25]。而隨著對結(jié)核病的深入研究，越來越多的研究結(jié)果表明，體液免疫在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，尤其是結(jié)核抗體IgG 更是明顯提高，在機(jī)體免疫保護(hù)中發(fā)揮重要作用；結(jié)核抗體檢測呈陽性反應(yīng)，提示Th2型免疫應(yīng)答增強，患者可能存在組織損傷和抗結(jié)核免疫力下降[3,7，26]。目前，對于結(jié)核抗體檢測的意義各家看法不一，普遍認(rèn)為與其他檢測聯(lián)合可以提高檢測意義[27-29]，造成陽性率相差較大的緣由，與試劑如抗原等，還與儲存、人員技術(shù)水平等有關(guān)。本研究對34例菌陽肺結(jié)核病患者外周血分別于0, 2, 6月行結(jié)核抗體檢測，首診陽性檢出率達(dá)76.47%，2月陰轉(zhuǎn)率11.54%；6月陰轉(zhuǎn)率26.92%；治療前、治療2月、治療6月抗體檢測結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。顯示了其在菌陽肺結(jié)核患者中陽性檢出率相對較高，但陰轉(zhuǎn)率較低，可能與菌陽肺結(jié)核的組織損傷程度相對要重，組織修復(fù)相對要慢、體液免疫恢復(fù)更要慢[16]有關(guān)，因此結(jié)核抗體在結(jié)核輔助診斷中起到一定的作用，但不能很好地反映治療療效情況。

本文34例菌陽肺結(jié)核患者痰涂片+培養(yǎng)檢出29例陽性，陽性檢出率達(dá)85.29%，2月陰轉(zhuǎn)率達(dá)89.66%；另3例雖然痰涂片陽性，但培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，證實2月末排出為無活性的結(jié)核分枝桿菌，且此3例患者治療2月γ-干擾素釋放試驗TBAg/PHA比值較治療前均下降；治療6月29例全部陰轉(zhuǎn)，陰轉(zhuǎn)率達(dá)100%，說明在菌陽患者中痰涂片+培養(yǎng)結(jié)果能夠很好的反應(yīng)病情程度與治療療效；但痰涂片+培養(yǎng)在所有肺結(jié)核病檢出中敏感性較低，因此雖為肺結(jié)核病檢出的金標(biāo)準(zhǔn)，但有很大程度的限制性[27]。Genexpert MTB/RIF(簡稱GeneXpert)為近幾年發(fā)展起來的新型快速結(jié)核分枝桿菌特異性分子生物檢測技術(shù)，基于PCR基礎(chǔ)，同時能檢測是否為利福平敏感/耐藥株。此技術(shù)直接檢測標(biāo)本為痰液，2 h出結(jié)果，敏感性較高，因此目前廣泛應(yīng)用于臨床[30-31]，本研究采用GeneXpert分子檢測方法篩選菌陽且利福平敏感活動性肺結(jié)核患者34例，33例陽性，陽性率高達(dá)97.06%。

綜上所述，通過對34例初治利福平敏感肺結(jié)核患者動態(tài)檢測觀察患者免疫應(yīng)答動態(tài)變化趨勢與細(xì)菌檢測結(jié)果分析，顯示各項指標(biāo)對活動性肺結(jié)核患者的陽性檢出率各不相同；在有效抗結(jié)核治療6個月后，肺結(jié)核患者的IFN-γ水平顯著降低，尤其是在治療的最初2個月；結(jié)核抗體雖在結(jié)核診斷中起到輔助診斷的作用，但陰轉(zhuǎn)較低，不能很好地反映治療療效情況；在菌陽患者中痰涂片+培養(yǎng)亦能夠很好的反應(yīng)治療情況。在治療過程中對細(xì)菌學(xué)指標(biāo)與免疫學(xué)指標(biāo)動態(tài)變化分析可能為監(jiān)測肺結(jié)核患者的病情與治療療效反應(yīng)提供一定的價值，可供臨床參考與借鑒。

本研究僅收集到部分患者治療過程中的影像學(xué)資料，無法用于統(tǒng)計分析，此為本文不足之一；從已收集到的影像學(xué)資料來看，CT或X線影像學(xué)病灶的吸收好轉(zhuǎn)和免疫學(xué)指標(biāo)情況一般滯后于臨床癥狀、體征，可能與免疫損傷后恢復(fù)慢和不一致有關(guān)[16]。本文另一不足之處是收集觀察樣本較少，可能引起結(jié)果偏倚，影響數(shù)據(jù)統(tǒng)計；未同時做呼吸道其他疾病或菌陰肺結(jié)核的對照實驗亦是本文不足之處。在以后的研究中，我們將進(jìn)一步完善不足，嘗試進(jìn)一步研究其在菌陰肺結(jié)核的輔助診斷與治療中的指導(dǎo)價值。