孫曉惠，陸錦銳，李雪營，王傳明，趙 成，王海瓊

(黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校，貴州 都勻 558000)

水藥八角蓮為小檗科鬼臼屬植物八角蓮[D.versipellis(Hance)M.Cheng ex Ying]、小八角蓮[D.difformis(Hemsl.et Wils.)T.H.Wang ex Ying]、六角蓮[D.pleantha(Hance)Woodson]、川八角蓮[D.veitchii(Hemsl.ex Wils)Fu ex Ying]、云南八角蓮[D.aurantiocaulis(Hand.-Mazz.)Hu]的干燥根及根莖，為我國特有的藥用植物[1]。八角蓮以鬼臼之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性涼，味甘，微苦，有小毒。具有清熱解毒、化痰散結(jié)、祛瘀消腫的功效，可用于治療癰腫、疔瘡、瘰疬、喉蛾、跌打損傷、蛇蟲咬傷等[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，八角蓮具有抗腫瘤[3]、抗菌[4]、抗病毒[5]和抗蛇毒等作用。但是八角蓮具有細胞毒性，民間常有因攝入過量致中毒或死亡的報道[6]。有毒副作用的藥物，經(jīng)過炮制可明顯降低，甚至消除其毒性或副作用，從而確保用藥安全[7]。本實驗采用正交試驗法，依據(jù)《中國民族藥炮制集成》[8]對八角蓮的姜制工藝進行優(yōu)化。

1 實驗部分

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；BT-600電子天平(啟東有銘衡器有限公司)；電爐(廣西灌陽縣元利電器廠)；KQ-3200超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；2500C多功能粉碎機(永康市艾澤拉電器有限公司)；JA2003N電子天平(上海菁海儀器有限公司)。

1.2 試劑

鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚的標準品(北京百靈威科技有限公司，編號分別為131142、203057、268623、258643)；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；生姜(都勻市斗篷山路沃爾瑪超市)。

1.3 試藥

對貴州都勻、羅甸等縣市的八角蓮屬藥材資源進行了野外考察和樣品收集，收集的樣品由黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校生藥教研室王傳明副教授鑒定，分別為八角蓮[Dysosma versipellis(Hance) M.Cheng ex Ying]、貴州八角蓮[D. majorensis (Gagnep.)Ying]、川八角蓮[D. veitchii (Hemsl. et Wils.)Fu ex Ying.]和小八角蓮[D. difformis (Hemsl.et.Wils.)T.H. Wang ex Ying]。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC測定鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚的含量

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：290 nm。流動相為A乙腈，B 0.1%磷酸。梯度洗脫條件：0～15 min,25%～30% A;15～25 min 30%～50% A[9]。色譜圖如圖1所示。

A. 醋制品;B.生品;C.混合標準品;1.4′-去甲基鬼臼毒素；2.槲皮素；3.山奈酚；4.鬼臼毒素。圖1 八角蓮HPLC色譜圖

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取鬼臼毒素對照品 15.300 mg、4′-去甲基鬼臼毒素對照品 0.212 mg、槲皮素對照品 1.490 mg、山奈酚對照品 2.040 mg，置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，振蕩均勻即可制成相應濃度的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取過三號篩(355 μm±13 μm，50目)的藥材粉末 1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入80%甲醇，料液質(zhì)量比為1∶10。精密稱定質(zhì)量，超聲 40 min,放置室溫，80%甲醇補足減失的質(zhì)量，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液[9]。

2.2 姜制八角蓮炮制工藝優(yōu)選

2.2.1 生八角蓮飲片制備

取八角蓮原藥材，除去殘莖及雜質(zhì)，洗凈，潤透，切厚片，干燥，即得。

2.2.2 生姜汁的制備

稱取已切丁的生姜末 20 g，加水 100 mL(5倍量)于燒杯中，置于電熱套內(nèi)煎煮 20 min,紗布過濾生姜汁；再加水 100 mL 繼續(xù)煎煮 20 min,合并生姜汁。將總生姜汁濃縮至 40 mL(0.5 g/mL)。

2.2.3 因素水平

根據(jù)八角蓮根莖的性質(zhì)及查閱文獻，選取姜用量、悶潤時間、炒制時間為考察因素。經(jīng)單因素考察確定因素水平，以鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚總含量為考察指標，采用L9(34)正交試驗法優(yōu)選姜制八角蓮的炮制工藝，因素水平詳見表1。

表1 因素水平表

2.2.4 藥物的炮制

取八角蓮9份，每份 50 g，根據(jù)表1、表2安排，加入一定量姜汁置燒杯中，拌勻，悶潤。將悶潤后的藥物，置于預熱的炒鍋內(nèi)，炒制定量時間后取出，晾涼，除去藥屑。試驗安排及結(jié)果見表2，方差分析見表3。每組平行制備3份。

表2 正交試驗安排及直觀分析

表3 姜制工藝方差分析

空白列D項為誤差項，表中R為極值，R值越大，則某個因素越重要。從表3方差分析結(jié)果可知，C(炒制時間)對試驗結(jié)果有較顯著影響，A(姜用量)、B(悶潤時間)影響不顯著?？梢钥闯?，最佳炮制工藝以第3組實驗即A1B3C3為佳，即姜用量5%，悶潤時間 60 min,炒制時間 12 min。

2.2.5 驗證試驗

為驗證該工藝的穩(wěn)定性，按優(yōu)選出的最佳工藝A1B3C3進行驗證性實驗，平行制備3份。測得4種指標成分總質(zhì)量分數(shù)平均值為 10.6048 mg/g。結(jié)果表明，優(yōu)選的八角蓮姜制工藝合理可行，制備的姜八角蓮飲片質(zhì)量穩(wěn)定。

3 小結(jié)

本研究首次對八角蓮進行了姜制的工藝研究，以八角蓮中指標性成分為指標，對姜用量、悶潤時間、炒制時間進行了考察，經(jīng)直觀分析和方差分析得出影響八角蓮姜制的因素為：炒制時間>姜用量>悶潤時間。優(yōu)選的姜制工藝為A1B3C3，即姜用量5%，悶潤時間 60 min,炒制時間 12 min。驗證性實驗表明，此工藝合理、可行，制備出的姜八角蓮飲片質(zhì)量穩(wěn)定可控，為八角蓮后期進行炮制減毒增效研究奠定了基礎。