滿子意,鳳怡,吳祥庭
溫州大學生命與環(huán)境科學學院,浙江 溫州 325035
胰脂肪酶是胰腺合成和分泌的重要脂解 酶,能將三?;视王ニ獬蓡熙;视王ズ陀坞x脂肪酸,然后被機體重新吸收利用并最終合成脂肪[1],過多的脂肪堆積是導致肥胖、高血脂癥、脂肪肝等多種疾病的關鍵原因[2]。而抑制胰脂肪酶活性,延緩三酰基甘油酯的水解過程,是預防和治療肥胖、高血脂癥及其并發(fā)癥的重要方法[3]。目前,市場上用于治療肥胖和高血脂癥的臨床藥物以奧利司他和辛伐他汀為主[4],雖然這類藥物可以有效控制血脂的上升,但長期服用會出現(xiàn)惡心、頭痛、脹氣、腹瀉等副作用以及肝腎損傷等問題[5]。越來越多的證據(jù)表明,天然植物提取物對胰脂肪酶具有較好的抑制效果,且副作用較小[6-8],因此,從天然植物資源中找到安全、有效的胰脂肪酶抑制劑一直是食品、生物及醫(yī)藥領域的研究熱點。
表沒食子兒茶素(Epigallocatechin,EGC)作為茶葉中的一種天然兒茶素單體,是茶葉中含量較豐富、生物活性較高的茶多酚之一,被應用于食品加工、醫(yī)藥保健領域[9]?,F(xiàn)代藥理學研究表明,植物多酚具有抗氧化、調(diào)節(jié)血糖和血脂水平的作用,這歸因于其多個-OH和環(huán)狀結構[10]。陳旭等[11]研究發(fā)現(xiàn),山楂葉多酚在質(zhì)量濃度為 2.5 g·L-1時對胰脂肪酶的抑制率可達46.8%。李鋒等[12]對高血脂大鼠進行連續(xù)飼喂EGC,發(fā)現(xiàn)EGC能極顯著降低高脂模型大鼠血清中的甘油三酯含量,在一定程度上可以降低低密度脂蛋白膽固醇含量,說明EGC具有一定的降脂作用。王詩卉等[13]研究了茶葉兒茶素抑制劑對胰脂肪酶構效關系的影響,發(fā)現(xiàn)胰脂肪酶二級結構的變化與 EGCG濃度呈正相關,而三級結構的變化與 EGCG濃度沒有顯著的相關性。然而目前有關兒茶素單體EGC的降血脂作用機制尚未完全清楚,并且關于EGC在體外抑制胰脂肪酶的研究也鮮見報道?;诖?,本研究從EGC與胰脂肪酶化學結構的角度分析了二者之間的相互作用模式及結構變化,并對EGC抑制胰脂肪酶的效果和類型進行分析,旨在闡釋EGC與胰脂肪酶相互作用產(chǎn)生抑制效果的分子機制,為茶葉EGC在降血脂中的應用提供技術和理論依據(jù)。
干茶樣品由紹興御茶村茶葉有限公司提供,胰脂肪酶(來源:豬胰腺;15~35 U·g-1)購自上海阿拉丁試劑有限公司,二甲基亞砜(NMR級)購自寧波萃英化學技術有限公司,溴化鉀(光譜純)購自上海麥克林生化科技有限公司,AB-8大孔樹脂購自上海藍季科技發(fā)展有限公司,酚酞購自上海麥克林生化科技有限公司;其他化學試劑均為市售國產(chǎn)分析純。
MuNanoscope3a型掃描電子顯微鏡,美國Digitalinstrument公司;NicoletiN 10 MX型傅里葉紅外光譜儀,美國Thermo Scientific公司;AVANCE3 AV500型核磁共振氫譜儀,德國Bruker公司;F-7000型熒光分光光度計,日本日立公司;Rotavapor R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,瑞士Buchi公司。
參考魏志文[14]和顧峰[15]的方法,并進行適當修改提取純化EGC單體。茶多酚粗品的制備:稱取15 g干茶樣品,置于1 L燒杯中,加入 450 mL超純水,100℃水浴浸提 60 min(每隔20 min攪拌1次),過濾;向濾渣中再加入450 mL超純水,100℃水浴浸提60 min,過濾。合并兩次濾液,抽濾,棄濾渣,將濾液濃縮(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為50℃,壓強為0.1 mPa)得到約150 mL的濃縮液,濃縮液用等體積三氯甲烷萃取3次,脫除咖啡堿和色素,回收三氯甲烷層,水層用等體積的乙酸乙酯再次萃取3次,合并酯層溶液,溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮(50℃,0.4 mPa)、減壓干燥后得茶多酚粗品。
大孔樹脂柱的制備與裝柱:用超純水多次淘洗大孔樹脂,直到洗出液不再有白色濁液后向樹脂中加入95%的乙醇溶液繼續(xù)清洗,待洗出液澄清后將樹脂浸泡在 95%的乙醇溶液中24 h待用。用充分溶脹后的大孔樹脂裝柱,得到2.5 cm×38 cm的柱體,裝柱后用95%的乙醇以5 mL·min-1的流速平衡柱體24 h,平衡后上樣。
EGC單體的純化:稱取制備好的茶多酚粗品2 g,用15 mL 95%乙醇溶解,再用0.45 μm有機濾膜過濾后上柱,用95%的乙醇溶液保持5 mL·min-1的流速洗脫,收集樹脂柱前 3 BV流失液(BV為樹脂床體積,1 BV即表示1倍樹脂床體積,約2 500 mL),將流失液旋轉(zhuǎn)減壓濃縮(50℃,0.4 mPa)、真空干燥,于-20℃保存,得EGC粗品。EGC粗品用少量乙酸乙酯溶解后過濾,后向濾液中加入二氯甲烷,會產(chǎn)生大量沉淀,繼續(xù)加二氯甲烷直到不產(chǎn)生沉淀為止。將溶液靜置 30~60 min,5 000 r·min-1離心10 min,將濾渣干燥后冷凍保存,即純化后的EGC。
1.4.1 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察
取純化的EGC單體,在25℃下真空干燥12 h。取真空干燥后的樣品,均勻分散在樣品臺上,吹去未粘住的樣品,并噴金3 min。噴鍍完成后用掃描電子顯微鏡觀察形貌[16]。參數(shù)設置:加速電壓 HV=1.00 kV;工作距離WD=6.9 mm;探頭類型ETD。
1.4.2 傅里葉紅外光譜(FTIR)檢測
將1 mg樣品與300 mg KBr混合后研磨并壓制成薄片,并使用傅里葉紅外光譜儀進行測試。掃描范圍為 400~4 000 cm-1,共掃描 64次[17]。
1.4.3 核磁共振氫譜(1H-NMR)
稱取 12 mg EGC樣品并轉(zhuǎn)移到 2 mL eppendorf管中,然后加入 0.5 mL NMR級DMSO溶劑,通過超聲溶解化合物。最后將澄清的溶液轉(zhuǎn)移到5 mm NMR管中,并使用核磁共振氫譜儀獲得數(shù)據(jù)[18]。
參照 GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》和王菲菲[19]的方法并適當修改。向兩個編號分別為A和B的100 mL的錐形瓶中分別加入4 mL底物溶液(PVA乳化液)和 5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS,0.2 mol·L-1、pH=7.5),然后向A瓶中加入15 mL 95%的乙醇溶液,將A、B兩瓶在40℃水浴鍋中預熱5 min,隨后向兩瓶中分別加入1 mL 10 mg·mL-1的胰脂肪酶溶液后立即混勻計時,準確反應 15 min后向 B瓶中加入15 mL 95%的乙醇溶液終止反應,再向 A、B瓶中分別加入 2~3滴酚酞溶液,用0.05 mol·L-1的 NaOH溶液滴定計算游離脂肪酸含量,按下式計算空白組胰脂肪酶活性。
式中:VA為A瓶消耗0.05 mol·L-1NaOH溶液的體積;VB為 B 瓶消耗 0.05 mol·L-1NaOH溶液的體積;50表示1 mL 0.05 mol·L-1的NaOH溶液相當于脂肪酸50 μmol;15表示反應時間15 min。
分別取 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg·mL-1EGC溶液或奧利司他溶液1 mL加入到A、B錐形瓶中,重復以上操作,測定并計算各計量組胰脂肪酶活性。按下式計算各組胰脂肪酶抑制率,并確定其半抑制濃度(IC50)值。
式中:Uck表示空白組酶活性,Us表示樣品組酶活性。
根據(jù)范金波等[20]的方法稍作修改,測定方法同1.5章節(jié)。將1 mL不同濃度的EGC溶液(0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg·mL-1)與 4 mL PVA 乳化液(6、8、10、12、14 mg·mL-1)混合,然后在 40℃下培養(yǎng) 5 min后加入 10 mg·mL-1的胰脂肪酶溶液準確反應15 min。以底物濃度的倒數(shù)(1/[S])為橫坐標,反應速率(1/V)為縱坐標,繪制不同質(zhì)量濃度下 EGC的Lineweaver-Burk圖,動力學 Cornish-Bowden方程如下用于確定抑制模式。
式中,[S]表示 PVA 乳化液濃度(mg·mL-1),Kic為競爭性抑制常數(shù),Kiu為非競爭性抑制常數(shù),Km為米氏常數(shù),V為酶促反應速率mol·(L·min)-1,[C]表示 EGC 濃度(mg·mL-1)。
F-7000熒光光度計(日本日立)用于測試樣品的熒光光譜。采用 PBS(0.2 mol·L-1,pH=7.5)配置胰脂肪酶溶液(0.5 mg·mL-1)和不同質(zhì)量濃度的EGC溶液(0.6、0.8、1.0、1.2 mg·mL-1)。EGC溶液分別與胰脂肪酶溶液按(V∶V=1∶1)充分混勻,將各反應組溶液置于 40℃孵育 15 min,孵育后測定其熒光吸光度。熒光激發(fā)波長為 280 nm,掃描范圍為290~450 nm,發(fā)射縫均為 5 nm[21]。
使用 AutodockVina程序進行胰脂肪酶和兒茶素單體EGC的半柔性分子對接。胰脂肪酶的結構(PDB ID:1ETH)從PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得[22]。對接前先去除蛋白質(zhì)晶體結構中的雜原子和水分子,在pH=7.4的生理條件下補加氫原子,然后進行全蛋白對接[23-24]。根據(jù)獲得的結果,選擇結合親和力打分最高的對接構象進行相互作用的討論,使用ChimeraX和 LigPlus查看相互作用的三維和二維圖像。
用掃描電子顯微鏡、紅外光譜儀、1H-NMR等方法表征制備的EGC單體的化學結構。圖1展示了EGC單體的微觀結構和形貌。SEM圖像表明EGC單體分布不規(guī)則,主要為管狀結構,表面光滑,與其同源物質(zhì)ECG顯微形貌相似[25]。
圖1 掃描電鏡(SEM)下的EGC晶體形貌Fig. 1 The EGC crystal morphology under SEM
圖2是EGC的紅外光譜結果,在3 406 cm-1附近的吸收峰主要是-OH伸縮振動產(chǎn)生,C-H伸縮振動的特征吸收峰在 2 837 cm-1附近,1 500 cm-1附近的幾個吸收峰是苯的 C=C伸縮振動峰,1 147 cm-1和 1 039 cm-1為 C-O伸縮振動峰[26]。
圖2 EGC的紅外光譜結果Fig. 2 FTIR results of EGC
圖3是 EGC的1H-NMR結果,EGC的1H-NMR信號中含有較多活潑氫,因此很難識別自旋體系。δH7.96、δH8.90、δH9.11 和 δH4.65處的信號屬于 EGC分子上的-OH,容易產(chǎn)生O-H···O 型氫鍵[27]。EGC 分子與其他多酚類化合物類似,為環(huán)狀結構,帶羥基、酚羥基等活性基團,推測EGC中的這些活性部位更容易通過氫鍵或疏水相互作用與酶中的關鍵氨基酸殘基發(fā)生相互作用[28]。胰脂肪酶的本質(zhì)是由多個氨基酸殘基組成的單鏈糖蛋白,共分為兩個區(qū)域,一個是發(fā)揮催化功能的N端結構,另一個是可結合輔助因子的C端區(qū)域[29]。研究表明,胰脂肪酶活性中心形成了1個天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸的三聯(lián)結構,經(jīng)化學修飾后絲氨酸可以降低酶的活性,說明絲氨酸是胰脂肪酶發(fā)揮催化作用的關鍵氨基酸[30]。絲氨酸中存在羥基、氨基、羧基等活性官能團,可以與EGC分子中的羥基、酚羥基形成多個不同氫鍵,結合成更穩(wěn)定的復合物影響酶的活性。另外苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸等疏水性氨基酸在胰脂肪酶結構中也發(fā)揮了重要作用,EGC還可與這些氨基酸形成氫鍵、范德華力、疏水相互作用等多種作用模式,從而改變了酶的化學結構和空間構象,導致酶活性的改變[30]。
圖3 EGC的核磁共振氫譜結果Fig. 3 1H-NMR results of EGC
人類消化系統(tǒng)中碳水化合物主要通過α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶水解為葡萄糖[31],而脂肪的消化主要依靠胰脂肪酶水解為游離脂肪酸和單?;视王?,它能夠?qū)⑷梭w攝入的三酰基甘油酯水解掉 40%~70%[32-33]。因此胰脂肪酶是脂肪消化的先決條件,其活性高低可以影響脂肪的消化反應進程。奧利司他等胰脂肪酶抑制劑是臨床用于輔助治療高血脂癥、肥胖癥的有效藥物,可通過阻止三?;视退?,減少腸腔黏膜對膳食中脂肪的吸收,促使脂肪排出體外[34]。如圖4所示,不同濃度的EGC溶液對胰脂肪酶具有一定的抑制作用,且隨著EGC濃度的增加而增加。但抑制效果明顯弱于對照品奧利司他對胰脂肪酶的抑制效果,且EGC抑制胰脂肪酶的 IC50值為(1.620±0.085) mg·mL-1,高于奧利司他(1.013±0.072) mg·mL-1。但 EGC 是從天然植物中分離出的化合物,具有綠色、安全、副作用小的優(yōu)點,相比奧利司他更適合長期用于輔助治療高血脂癥以及肥胖癥。且相比于其他天然產(chǎn)物中提取到的胰脂肪酶抑制劑,褚盼盼等[35]研究的苦蕎麥多糖對胰脂肪酶抑制作用的 IC50為 28.23 mg·mL-1、張靜等[36]研究的黑果枸杞花色苷提取物對胰脂肪酶抑制作用的 IC50為(2.84±0.45) mg·mL-1、安歡等[37]研究的苦瓜多糖對胰脂肪酶抑制作用的 IC50為 29.86 mg·mL-1,EGC表現(xiàn)出較強的胰脂肪酶抑制作用。相比其他兒茶素單體,EGC對胰脂肪酶的抑制效果低于其同源物質(zhì)EGCG,趙瑜等[38]、楊龍佳等[39]、Sergent等[40]、Grove等[41]分別報道了 EGCG以(0.55±0.02) mg·mL-1、1.32 mg·mL-1、0.8 μmol·L-1、7.5 μmol·L-1的IC50值抑制胰脂肪活性。此外Rahim等[42]通過研究幾種黃酮和非黃酮多酚體外抑制胰脂肪酶活性的模式發(fā)現(xiàn),只有沒食子酸、EGC和EGCG顯示出較高的脂肪酶抑制潛力(IC50值分別為 387.2、237.3 μmol·L-1和 391.2 μmol·L-1);沒食子酸乙酯和沒食子醇葡萄糖僅顯示出一定的抑制效果;而未酯化的黃烷-3-醇,如(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、(+)-沒食子酸對胰脂肪酶幾乎沒有抑制效果。這些結果表明EGC是一種有效的胰脂肪酶抑制劑,在降血脂、抗肥胖藥物和功能性食品的研究中具有潛在價值。
建立基于動力學 Cornish-Bowden方程的Lineweaver-Burk圖來確定EGC抑制胰脂肪酶的抑制模式。如圖5所示,隨著EGC濃度的提高,EGC對胰脂肪酶的酶促反應速率直線的斜率逐漸增大,與 Y軸的交點(1/Vmax)上移,即最大反應速率(Vmax)減小。在所有EGC受試濃度下,直線在X軸上的截距(-1/Km)保持不變,即無論 EGC的濃度如何,米氏常數(shù)(Km)保持在恒定值,表明EGC對胰脂肪酶的抑制效率與底物濃度無關,EGC是胰脂肪酶的非競爭性抑制劑。非競爭性抑制僅取決于抑制劑的濃度,抑制劑與酶活性位點以外的部位結合,與底物不形成競爭關系[43-44]。因此EGC抑制胰脂肪酶的機制可能是與酶活性中心以外的關鍵氨基酸殘基結合,形成更穩(wěn)定的多元復合物或使酶的分子結構發(fā)生改變,減慢三?;视王サ姆纸馑俣龋瑥亩_到控制血脂的目的。
圖5 不同EGC濃度下的Lineweaver-Burk圖Fig. 5 Lineweaver-Burk plots of pancrelipase inhibition by various concentrations of EGC
熒光光譜實驗被用來進一步研究EGC與胰脂肪酶之間的相互作用。在一定的激發(fā)波長下,色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸的存在可以使得胰脂肪酶具有熒光特性[45]。其中貢獻最大的是色氨酸與酪氨酸殘基,在280 nm波長時內(nèi)源熒光被激發(fā),并且這兩種氨基酸殘基所處的微環(huán)境還會影響其熒光強度與位置[46]。圖6顯示了不同濃度的EGC對胰脂肪酶的熒光猝滅效應。EGC對胰脂肪酶具有熒光猝滅作用,熒光光譜在340 nm附近出現(xiàn)固有峰。隨著EGC濃度的增大,胰脂肪酶的熒光強度逐漸下降,且最大發(fā)射波長發(fā)生輕微紅移,這種濃度依賴關系是EGC和胰脂肪酶相互作用的明顯證據(jù)[21]。在熒光光譜中,最大發(fā)射波長的紅移也意味著蛋白質(zhì)的部分結構發(fā)生改變,這可能是EGC與胰脂肪酶中的氨基酸殘基發(fā)生相互作用的結果[47]。由于微環(huán)境由親水性變?yōu)槭杷?,導致蛋白質(zhì)結構展開,最終產(chǎn)生熒光猝滅效應。因此推測EGC可能通過氫鍵和疏水相互作用與酶中的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等結合形成更穩(wěn)定的多元復合物,導致酶構象或極性的改變,從而抑制酶的活性。
圖6 不同濃度EGC對胰脂肪酶熒光特性的影響Fig. 6 The effect of EGC on the fluorescence characteristics of pancrelipase
分子對接技術可以直觀地表示配體與受體的結合位點和結合構象,有助于其相互作用機理的分析。選擇結合親和力打分最高的 9組對接構象進行相互作用分析(圖7),如圖所示,與 EGC相互作用的氨基酸殘基為Asp206、Cys262、Asp258、Gln239、Lys233、Asn213、Asn263、Gln234、Cys238、Phe259、Ala261、Val260、Gly251、Leu214等,這些氨基酸殘基是驅(qū)動胰脂肪酶與EGC結合的主要氨基酸。其中 Asp206、Asp258、Gln239、Cys262主要通過 N-H···O、O-H···O 型氫鍵與胰脂肪酶相互作用,其余氨基酸殘基則主要通過疏水相互作用與胰脂肪酶相互作用。已有研究表明,胰脂肪酶活性中心是 1個天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸的三聯(lián)結構[30],因此可以推測EGC主要與胰脂肪酶活性中心以外的必需基團結合,如Asn263、Phe259、Gln234等,通過非競爭的方式抑制胰脂肪酶活性,這與抑制動力學的試驗結果一致。與其他多酚類化合物(如黃酮類、花青素類)相似,芳香六元環(huán)上的羥基在氫鍵的形成上起到了關鍵作用[48],已有研究表明,隨著羥基數(shù)目的增加,多酚類物質(zhì)的生物活性越強,對胰脂肪酶的抑制效果更顯著[49]。EGC通過疏水相互作用與多個氨基酸殘基周圍的疏水腔結合,影響其微環(huán)境的極性,導致蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊現(xiàn)象,改變了酶的結構,從而產(chǎn)生了熒光光譜實驗中的熒光猝滅現(xiàn)象,也影響了胰脂肪酶的生物活性,進而降低其對底物的催化能力[23,49]。
圖7 EGC與胰脂肪酶的分子對接Fig. 7 Molecular docking for the interaction between pancrelipase and EGC
茶葉具有降血脂功效已得到廣泛認同,但是關于其有效成分的機制研究卻進展不大。茶多酚是茶葉中兒茶素類、黃酮類、酚酸類和花色素類物質(zhì)的總稱,占干物質(zhì)含量的15%~25%[50];其中兒茶素類化合物是最重要的組分。兒茶素類化合物可抑制多種與脂肪合成相關酶的表達及活性,并調(diào)節(jié)多種與膽固醇合成相關的酶的活性,其中研究最廣泛的是EGCG,體外試驗結果表明,EGCG可以通過抑制與物質(zhì)消化相關的酶以及與腸道細胞刷毛緣上特定轉(zhuǎn)運因子形成復合物,降低胃腸道對葡萄糖和脂類的吸收與利用,減少三?;视王ニ?,從而降低游離脂肪酸被機體重新吸收利用并最終合成脂肪的過程[51]。EGC作為EGCG的同源化合物,與 EGCG具有相似的化學結構和生物活性,含量僅次于EGCG,是兒茶素以及茶多酚類化合物發(fā)揮生物活性的重要化合物。
本研究通過多種光譜技術研究了EGC的化學結構,以及與胰脂肪酶的相互作用。我們證實了EGC對胰脂肪酶具有非競爭性抑制作用,IC50為(1.62±0.085) mg·mL-1,抑制作用主要是通過氫鍵和疏水相互作用改變酶的化學結構和空間構象與胰脂肪酶中的氨基酸殘基形成復合物來實現(xiàn)。EGC抑制胰脂肪酶的機制是深入理解多酚類化合物作為脂肪水解酶抑制劑的關鍵因素。通常食物中的脂肪進入人體后會被胰脂肪酶水解為游離脂肪酸和單酰基甘油酯,這些物質(zhì)經(jīng)腸道吸收后會重新合成脂肪導致脂肪堆積以及血脂升高,通過抑制胰脂肪酶活性可以減少脂肪的分解從而達到降血脂的目的,因此抑制胰脂肪酶活性是研究脂肪分解代謝、降血脂機制以及開發(fā)降血脂藥物的關鍵[52-53]。EGC分子同時顯現(xiàn)出親水性和疏水性,而胰脂肪酶內(nèi)部非極性氨基酸的側鏈區(qū)域表現(xiàn)出疏水性,EGC中的酚羥基能夠與胰脂肪酶內(nèi)部的氨基酸殘基通過氫鍵以及疏水相互作用結合在一起,形成更穩(wěn)定的復合物,改變酶的結構,降低了酶的分解速率,從而減少脂肪分解實現(xiàn)降脂的目的。因此本研究可以為利用EGC作為新型食品添加劑或胰脂肪酶抑制劑開發(fā)功能性食品以及降血脂、抗肥胖藥物提供理論依據(jù)。但是本研究僅通過體外試驗對EGC抑制胰脂肪酶的活性進行探究,暫未進行動物試驗,難以反映EGC在體內(nèi)的復雜作用機制。欲深入闡明EGC對脂肪代謝的作用機制,后續(xù)還需進行動物體內(nèi)試驗,深入了解其在體內(nèi)的復雜作用。
另一方面,通常綠茶鮮葉中的兒茶素含量約為200 mg·g-1,鮮葉中兒茶素組分含量由多到少分別為 EGCG、EGC、ECG、EC、GC、C[54],由于 EGC抑制胰脂肪活性所需的有效濃度較高,通過日常飲茶難以真正達到相應濃度。但是許多研究已表明,飲茶可以達到降脂效果且兒茶素對胰脂肪酶有較好抑制效果[55-57],因此飲茶降脂功能的實現(xiàn)應該是通過茶湯中的多種活性成分共同發(fā)揮作用。兒茶素作為最重要的活性物質(zhì),其單體成分在降脂機制中的作用十分重要,根據(jù)兒茶素的構成和比例,EGCG和EGC可能是發(fā)揮主要作用的單體,而這兩種單體都屬于黃烷-3-醇類化合物且結構主鏈中都有一個沒食子?;糠?。因此胰脂肪酶中非極性氨基酸的數(shù)量及比例、酚羥基的個數(shù)以及黃烷-3-醇的沒食子酰部分都是今后研究兒茶素以及多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶活性影響的關鍵。