田彩平 李瑞 馬佰菁 閔建平 荊曉 楊碎勝

1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

眾所周知，癌癥是引起死亡的一個主要原因，也是世界性難題。若能早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，就可以進(jìn)行早期干預(yù)，從而提高療效，減少死亡，因此腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要［1］。目前腫瘤標(biāo)記物、醫(yī)學(xué)影像以及穿刺活檢是主要的腫瘤診斷方式，其中腫瘤標(biāo)記物是檢測腫瘤生長過程中分泌到血液中的特異性蛋白質(zhì)含量，醫(yī)學(xué)影像是借助X 光、CT、核磁等技術(shù)進(jìn)行檢測病灶，穿刺活檢是通過穿刺或外科手術(shù)的方式取得腫瘤組織，這三種診斷方式均存在局限性，不能在腫瘤早期檢測到疾病信息而錯過最佳治療時機(jī)，從而導(dǎo)致腫瘤患者治愈率低，生存期短［2］。因此，尋求一種能夠在腫瘤早期階段方便檢測的方法至關(guān)重要。

新興的液體活檢可以實時反映原始組織的生理和病理狀態(tài)，能夠在疾病早期被檢測出來，可以方便無創(chuàng)的取樣。與傳統(tǒng)有創(chuàng)的活檢相比，液體活檢具有及時、個體化診療的優(yōu)勢。然而，液體活檢在檢測靶標(biāo)的有效分離、信號放大等方面存在不足，而核酸適配體由于其特殊的空間構(gòu)象，可以進(jìn)行修飾和組裝，從而可以進(jìn)行信號放大，能夠彌補(bǔ)液體活檢存在的不足。本文從液體活檢的類型、優(yōu)缺點，核酸適配體在腫瘤液體活檢中的應(yīng)用、優(yōu)缺點等方面進(jìn)行綜述，為腫瘤的早期檢測提供參考依據(jù)。

1 液體活檢的主要檢測靶標(biāo)及在腫瘤檢測中的優(yōu)點和不足

1.1 液體活檢的主要檢測靶標(biāo) 液體活檢是一種源自體液的疾病診斷和監(jiān)測工具，體液主要有血液、腦脊液、唾液、尿液等，它們要么在體內(nèi)循環(huán)，要么在體外分泌，具有營養(yǎng)輸送、廢物收集以及潤滑等一系列生理功能，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分析技術(shù)的發(fā)展，在體液中發(fā)現(xiàn)了越來越多的生物分子、細(xì)胞外囊泡甚至細(xì)胞，它們可以作為疾病管理的標(biāo)記物具有重要的臨床價值［3］。檢測分析這些體液靶標(biāo)（循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環(huán)腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和外泌體（Exosome）可以實時、全面、動態(tài)的反映原始組織的全局生理和病理信息，其結(jié)果可以對腫瘤進(jìn)行早期篩查、指導(dǎo)治療、監(jiān)測療效和監(jiān)控復(fù)發(fā)［4-5］。

1.2 液體活檢在腫瘤檢測中的優(yōu)點和不足 液體活檢與傳統(tǒng)腫瘤診斷方式相比，具有很多優(yōu)勢。首先，液體活檢能夠診斷出疾病的早期階段，使及時治療成為可能；其次，液體活檢可以方便且無創(chuàng)的進(jìn)行取樣，使疾病篩查更便捷，即使稀少的樣本也能檢測到，樣本還可以進(jìn)行重復(fù)檢測和分析；再次，液體活檢能夠提供全面、動態(tài)的病理信息來精準(zhǔn)全面的指導(dǎo)疾病診斷和治療方案［6］。同時它們在實際應(yīng)用中存在一些不足［7］，如CTCs 在體液中含量極低，很難被捕獲和識別到，并且體液是相對復(fù)雜的基質(zhì)，特別是外周血中有數(shù)十億血細(xì)胞和很多種蛋白質(zhì)，捕獲和識別都需要高效富集和高信號放大策略。ctDNA 存在檢測方法不統(tǒng)一，缺少標(biāo)準(zhǔn)化流程。外泌體在分離、分析靈敏度等方面技術(shù)受到限制。此外，脆弱的檢測靶標(biāo)需要溫和的分離和釋放方法進(jìn)行下游分析，不同程度的異質(zhì)性檢測靶標(biāo)需要綜合的檢測分析方法，克服這些困難需要高特異性和高靈敏度的靶標(biāo)檢測技術(shù)。核酸適配體檢測方法的出現(xiàn)彌補(bǔ)了液體活檢的不足。

2 核酸適配體的特性及其在不同腫瘤液體活檢中的應(yīng)用

2.1 核酸適配體的特性 近年來，廣泛研究的核酸適配體由于其具有獨特的空間構(gòu)象，能夠與病毒、細(xì)菌和細(xì)胞等多種靶點高特異的結(jié)合，它是利用指數(shù)富集的配基進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從大容量的寡核苷酸隨機(jī)文庫中迭代篩選出來的一類具有特異性識別功能的單鏈DNA 或RNA 核酸分子，它易于被合成，并根據(jù)靶標(biāo)特點通過體外方法進(jìn)行修飾，便于高效篩選到與核酸適配體高特異性、高親和力結(jié)合的檢測靶標(biāo)，更便于檢測信號的放大和檢測靶標(biāo)的充分釋放［8］。該技術(shù)于1990 年首次報道，后續(xù)開發(fā)出了許多改良的SELEX技術(shù)，并結(jié)合高效的篩選平臺和生物信息學(xué)工具，核酸適配體檢測方法促進(jìn)了CTCs、ctDNA 和外泌體等液體活檢的發(fā)展，分別于2009 年、2012 年和2016 年探索了基于核酸適配體的檢測靶標(biāo)分離方法、釋放策略以及用于CTCs 研究的亞群分析平臺［9］。

2.2 核酸適配體在腫瘤液體活檢中的應(yīng)用 核酸適配體在腫瘤診療中作為識別配體，其性質(zhì)決定其親和力、特異性和穩(wěn)定性等性能。親和力決定核酸適配體與檢測靶標(biāo)之間的結(jié)合力，從而影響檢測效率和靈敏度。核酸適配體的特異性識別保證了檢測的選擇性和可靠性，核酸適配體三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性在實際應(yīng)用中非常重要。許多針對特定腫瘤生物標(biāo)志物的核酸適配體已被開發(fā)應(yīng)用于液體活檢中檢測靶標(biāo)的捕獲和分析，比如黏液蛋白1（MUC1）和表皮生長因子受體2（HER2）的核酸適配體［10-11］，CD63 和 HSP70 的胞外結(jié)構(gòu)域已成為開發(fā)特異性核酸適配體的目標(biāo)，用以分離和分析外泌體［12-13］。在此，我們總結(jié)了現(xiàn)有的一些成功應(yīng)用于不同腫瘤液體活檢的核酸適配體（表1）［14-16］。但是在親和力、特性性以及穩(wěn)定性方面還需大力提升，因此許多努力致力于研發(fā)親和力強(qiáng)、特異性高和穩(wěn)定性好的核酸適配體篩選方法。

表1 核酸適配體在不同腫瘤液體活檢中的應(yīng)用

3 核酸適配體檢測的靈敏度、特異性方面的優(yōu)勢

3.1 核酸適配體具有提高親和力的優(yōu)勢 核酸適配體的親和力決定了其結(jié)合性能，從而決定了檢測靶標(biāo)的高效分離和靈敏檢測，一些核酸適配體的親和力有限，同時復(fù)雜的基質(zhì)通常會對核酸適配體的親和力和穩(wěn)定性有害，因此提高核酸適配體的親和力是實際應(yīng)用中亟待解決的問題。為了解決這一問題在生物系統(tǒng)中引入多價核酸適配體，以增強(qiáng)核酸適配體與不同活性細(xì)胞的親和力，多價核酸適配體即一個實體上的多個配體與另一個實體上的一個或多個受體同時結(jié)合，受此啟發(fā)，核酸適配體采用各種策略來設(shè)計多價組件作為識別元素來提高親和力，常用的方法有雜交、聚合和基于納米結(jié)構(gòu)的多價組裝［17］。為了提高檢測靶標(biāo)的特異性，核酸適配體是在嚴(yán)格的篩選條件下和適當(dāng)?shù)南麥p條件下進(jìn)行篩選，如在連續(xù)流動的微流控中進(jìn)行孵育有助于產(chǎn)生高度特異性的核酸適配體，與傳統(tǒng)的孵育方法相比，流動的流量可以抑制大約50 倍的非特異性結(jié)合的寡核苷酸，因此消減篩選是消除寡核苷酸非特異性結(jié)合的關(guān)鍵過程。Li 等［18］利用高轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231 細(xì)胞進(jìn)行正向性篩選，利用低轉(zhuǎn)移性MCF-7 細(xì)胞進(jìn)行反向篩選，實現(xiàn)了特異性靶向轉(zhuǎn)移細(xì)胞的適配體M3 的篩選，此外，基于M3 的捕獲系統(tǒng)成功地從轉(zhuǎn)移乳腺癌患者得到的轉(zhuǎn)移性表型細(xì)胞捕獲到了CTCs，因此，篩選高特異性識別的適配體有助于檢測靶標(biāo)的選擇性捕獲和分子分型。

3.2 核酸適配體具有多價組裝的優(yōu)勢 由于檢測靶標(biāo)存在于復(fù)雜的體液中，所以靈敏的檢測需要檢測靶標(biāo)的有效分離和富集，體液的復(fù)雜成分會影響檢測信號，尤其是血液樣本，一毫升血液中含有大于109個紅細(xì)胞、107個白細(xì)胞、大于108個血小板，以及幾十毫克的蛋白質(zhì)和有機(jī)小化合物，這種復(fù)雜的基質(zhì)會在電化學(xué)檢測時引起電極污染，在光學(xué)檢測時引起自熒光、光散射以及吸附，因此檢測靶標(biāo)的有效分離和富集是提高檢測效率和靈敏度的關(guān)鍵。核酸適配體具有許多獨特的特性，首先，由體外SELEX 進(jìn)化而來的各種核酸適配體可以全面準(zhǔn)確地識別液體活檢的檢測靶標(biāo)；其次，核酸適配體的合成具有較低的批量變異性，可以方便地制備成多價納米組裝體，具有官能團(tuán)和小分子的位點特異性修飾允許高度定向和高密集的界面功能化，這些優(yōu)點都有助于高親和力捕獲界面的設(shè)計［19］。隨著材料科學(xué)和微/納米技術(shù)的發(fā)展，迄今為止，許多微/納米材料和微/納米工程裝置已經(jīng)被制造出來，為液體檢測提供了多功能、穩(wěn)健和高效的分離平臺，將核酸適配體整合到各種平臺中（包括磁性材料、微/納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)和微流控芯片）可以整合核酸適配體和平臺的優(yōu)點。

3.3 核酸適配體具有信號放大的優(yōu)勢 檢測靶標(biāo)的靈敏性分析對于準(zhǔn)確和可靠的疾病診斷很重要，但是體液中某些類型的檢測靶標(biāo)濃度較低，因此檢測靶標(biāo)的靈敏檢測需要信號放大策略，與其他識別配體相比，核酸適配體具有眾多獨特的組成和結(jié)構(gòu)特征，在信號放大方面有優(yōu)勢［9］，核酸適配體探針含有不同的信號放大基團(tuán)，它與靶標(biāo)結(jié)合時提供多種直接放大策略，包括DNA 擴(kuò)增/組裝和酶催化反應(yīng)，或者對于與觸發(fā)序列雜交的核酸適配體探針，核酸適配體-靶標(biāo)相互作用競爭性地釋放觸發(fā)序列以進(jìn)行信號放大，基于核酸適配體的信號放大策略有直接放大和競爭放大。

4 展望

核酸適配體用于液體活檢具有的諸多優(yōu)點和應(yīng)用潛力，但是目前大多數(shù)核酸適配體的特性尚未得到充分研究，只有極少數(shù)核酸適配體被批準(zhǔn)用于臨床。全面的液體活檢仍需要靶向各種檢測靶標(biāo)的多種核酸適配體。此外，在復(fù)雜的基質(zhì)中，核酸適配體結(jié)合性能的降低使得基于核酸適配體的液體活檢變得困難，迄今為止，已有多種策略來提高核酸適配體的穩(wěn)定性和親和力，如對核酸酶敏感位置的核酸適配體序列進(jìn)行化學(xué)修飾和多價組裝，然而這兩種方法都使核酸適配體的應(yīng)用復(fù)雜化，并且化學(xué)修飾有時會影響核酸適配體的特異性和親和力，因此核酸適配體的多樣性、親和性以及穩(wěn)定性有望進(jìn)一步提高，需要更先進(jìn)的SELEX 技術(shù)。其次，CTCs 和外泌體攜帶著豐富的生物信息，這些生物信息是現(xiàn)有基于核酸適配體的液體活檢難以獲得的，由于CTCs 和外泌體高度的異質(zhì)性，它們不同的亞群與腫瘤的轉(zhuǎn)移有不同的相關(guān)性，但是基于核酸適配體親和力的分離依賴于特定生物標(biāo)志物的表達(dá)，這會導(dǎo)致CTCs 和外泌體的特定亞群檢測不出來，從而無法提供準(zhǔn)確和全面的信息，影響了腫瘤液體活檢的臨床價值。再次，標(biāo)準(zhǔn)化的處理程序和集成設(shè)備是臨床轉(zhuǎn)化的重要前提，借助商業(yè)儀器和試劑盒以及成熟方案，這些基于核酸適配體的腫瘤液體活檢方法將實現(xiàn)從工作臺到床邊的平穩(wěn)過渡。最好，具有質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化操作程序的商業(yè)試劑盒將確?；诤怂徇m配體的液體活檢方法可靠和并具有重復(fù)性。

綜上所述，通過核酸適配體特性的改善、檢測靶標(biāo)的綜合分析策略和相應(yīng)的商用設(shè)備的開發(fā)、臨床應(yīng)用可行性驗證等方面的共同努力，基于核酸適配體的液體活檢有望推動腫瘤診療的發(fā)展。