彭玉蘭 羅合一 李美玄 杜雪 曲同寶

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

火炬樹(RhustyphinaL.)為漆樹科(Anacardiaceae)鹽膚木屬(Rhus)落葉灌木或小喬木。火炬樹具有耐旱抗寒、形態(tài)優(yōu)美、生長迅速、根蘗繁殖等優(yōu)良特性，廣泛應(yīng)用于荒山綠化或退化山區(qū)植被的恢復(fù)[1-2]?；鹁鏄涓捣置谖飳r(nóng)作物[3]、喬木[4]、牧草[5]以及土壤微生物群落[6-7]的生長具有抑制作用，這種抑制作用主要通過化感作用實現(xiàn)。植物化感作用可以通過產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)直接(或間接)促進或抑制周圍生物的生長發(fā)育[4，8-9]。瑞香狼毒[10]及蔬菜類植物[11]根系分泌的次生代謝物質(zhì)會直接影響周圍植物種子萌發(fā)[12-13]。Qiao et al.[14]、楊云海等[15]研究發(fā)現(xiàn)不同溶劑提取物的化感效應(yīng)存在差異?；鹁鏄渌嵋旱幕凶饔靡延泻芏嘌芯縖16-19]，但其醇提物作用的研究未見報道。小白菜(BrassicacampestrisL.)種子萌發(fā)周期短，常作為受體植物研究化感作用的材料[20-22]。在前期試驗中，我們使用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析火炬樹提取物成分，其中沒食子酸、焦性沒食子酸在水提物中約占3.6%和1.5%，苯甲酸、糠醛在醇提物中大概占0.8%和2.1%。本試驗以小白菜種子為試驗材料，比較火炬樹根水提取物和醇提取物對小白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的化感效應(yīng)差異，并利用鑒定出的沒食子酸、焦性沒食子酸、苯甲酸和糠醛化合物純品，分析火炬樹化感作用機理，為進一步研究火炬樹化感作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

火炬樹根于2020年9月挖自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，以根直徑2～3 mm為宜，陰干備用；小白菜種子由本實驗室提供，種子質(zhì)量2.005 mg/粒。沒食子酸、焦性沒食子酸、糠醛和苯甲酸來自化學(xué)試劑公司。

將陰干的樹根粉碎，分別在去離子水和甲醇中浸泡24 h，過濾，重復(fù)3次，合并3次過濾液，旋轉(zhuǎn)濃縮，冷凍干燥，獲得干燥提取物備用。

1.2 種子萌發(fā)試驗

小白菜種子用0.5% NaClO消毒約20 min，然后用蒸餾水重復(fù)洗滌干凈，置于濾紙上吸干水分備用。提取物試驗采用沙培法。每個培養(yǎng)皿中20 g沙土，分別加入不同劑量(0(對照)、25、50、75和100 mg)的醇提物和水提物，然后將溶液與沙土混勻，選取大小均勻、種皮完整、飽滿的小白菜種子放入培養(yǎng)皿中，加入5 mL去離子水[14]。

4種化合物對比試驗采用水培法。將小白菜種子放入帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入3 mL不同濃度的化合物，去離子水作為陰性對照[17]。

將培養(yǎng)皿放置在濕度為75%、溫度(25±1)℃、光照強度3 500 lx(14 h光照、10 h黑暗)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每日添加去離子水保持沙土濕潤，每日觀察和記錄種子發(fā)芽數(shù)，以胚根突破種皮2 mm為萌發(fā)標(biāo)志，連續(xù)2 d不發(fā)芽為發(fā)芽結(jié)束，試驗均重復(fù)5次，統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和化感指數(shù)。

發(fā)芽率(GR)=(Gi/n)×100%；發(fā)芽指數(shù)(IG)=∑(Gt/Dt)；化感指數(shù)(IA)=(GC/G0)-1。式中，Gi為在i日內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；n為種子總數(shù);Gt為在第t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時間；GC為不同處理下的發(fā)芽數(shù)；G0為對照組的發(fā)芽數(shù)。IA>0，“+”表示促進作用；IA<0，“-”表示抑制。發(fā)芽結(jié)束后選取20株長勢一致的幼苗，使用游標(biāo)卡尺測定幼苗根長、莖長。

1.3 生理指標(biāo)的測定

丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度采用硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)法測定[23]；可溶性蛋白質(zhì)量濃度采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[24]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑光還原法檢測，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法測定[25]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SPSS 26.0進行ANOVA單因素方差分析和Duncan差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 火炬樹根提取物對小白菜種子萌發(fā)的影響

由表1可知，不同劑量火炬樹根提取物均顯著抑制了小白菜的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)(P<0.05)。隨著提取物劑量增加，抑制愈加強烈。當(dāng)劑量為100 mg時，小白菜發(fā)芽率均達到最低，其中水提物處理的小白菜發(fā)芽率達到80.56%，與對照相比降低了11.79%，發(fā)芽指數(shù)降到18.08，化感指數(shù)為-0.12；醇提取物處理下，當(dāng)劑量為100 mg時，小白菜發(fā)芽率達到最低為36.22%，比對照降低了60.34%，發(fā)芽指數(shù)降到6.76，化感指數(shù)達到-0.60。

表1 火炬樹提取物對小白菜種子萌發(fā)的影響

處理各處理提取物不同劑量小白菜的發(fā)芽指數(shù)025mg50mg75mg100mg水提物(24.42±0.92)a(22.41±1.41)b(20.31±1.32)c(19.45±1.35)b(18.08±1.28)d醇提物(24.42±0.92)a(10.18±1.40)b(10.14±1.45)b(8.12±0.73)c(6.76±1.07)e

注：表中數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同列不同小寫字母表示各處理差異顯著(P<0.05)。

2.2 火炬樹提取物對小白菜幼苗生長和生理指標(biāo)的影響

由表2可知，小白菜根長在兩種提取物處理下均受到抑制作用，其中，根長受到醇提物的抑制作用更為顯著(P<0.05)。隨著水提取物處理劑量的增加，小白菜的根長逐漸減少，處理劑量為100 mg時，小白菜根長均達到最小值，根長為15.60 mm，比對照降低了71.00%，而醇提物處理小白菜根長先促進后抑制，最小達到33.77 mm，抑制作用不顯著。

表2 火炬樹提取物對小白菜幼苗生長的影響

注：表中數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同列不同小寫字母表示各處理差異顯著(P<0.05)。

小白菜莖長隨兩種提取物處理劑量的增加呈先升高后降低的趨勢，表現(xiàn)出低劑量促進高劑量抑制的作用，當(dāng)劑量為100 mg時，莖長最短，但兩種提取物處理的小白菜莖長無顯著差異。

由表3可知，小白菜幼苗可溶性蛋白的質(zhì)量濃度隨提取物劑量增加均呈下降趨勢。在劑量為50 mg時，水提物和醇提物處理的小白菜幼苗可溶性蛋白的質(zhì)量濃度均達到最低(P<0.05)。其中，小白菜葉片中可溶性蛋白的質(zhì)量濃度，醇提物處理比水提物處理降低的更多。水提物處理的小白菜葉片可溶性蛋白的質(zhì)量濃度最小值為8.32 mg·L-1；醇提取物處理的小白菜葉片可溶性蛋白的質(zhì)量濃度最小值為7.05 mg·L-1。

表3 火炬樹提取物對小白菜幼苗生理指標(biāo)的影響

處理各處理提取物不同劑量小白菜幼苗的丙二醛的質(zhì)量摩爾濃度/nmol·g-1025mg50mg75mg100mg水提物(5.86±0.42)d(17.77±1.01)c(25.53±1.80)a(24.82±1.53)a(21.31±1.63)b醇提物(5.86±0.42)e(8.19±0.65)d(11.60±1.04)b(18.48±1.88)a(10.08±0.84)c

處理各處理提取物不同劑量對小白菜幼苗的超氧化物歧化酶活性/U·g-1025mg50mg75mg100mg水提物(314.95±12.86)d(408.85±21.33)c(514.53±35.09)a(463.96±31.73)b(316.62±27.55)d醇提物(314.95±12.86)c(509.63±20.61)b(572.29±19.46)a(597.32±21.08)a(248.28±21.32)d

注：表中數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同列不同小寫字母表示各處理差異顯著(P<0.05)。

小白菜幼苗丙二醛的質(zhì)量摩爾濃度隨不同提取物劑量的增加均呈先升后降趨勢，兩種提取物處理間差異顯著(P<0.05)。在水提物劑量為50 mg時，小白菜幼苗丙二醛的質(zhì)量摩爾濃度的最大值為25.53 nmol·g-1，比對照提高了335.79%，醇提取物75 mg時，小白菜幼苗丙二醛的質(zhì)量摩爾濃度為18.48 nmol·g-1，比對照提高了215.37%(P<0.05)。

小白菜幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性隨兩種提取物處理劑量的增加均先升后降，且兩種提取物差異顯著(P<0.05)。在水提物處理劑量為50 mg時，超氧化物歧化酶活性最大值為514.53 U·g-1，比對照提高了63.37%。在醇提取物處理劑量為75 mg時，小白菜幼苗超氧化物歧化酶活性最大為597.32 U·g-1，比對照提高了89.66%。

小白菜幼苗過氧化物酶(POD)活性隨提取物劑量的增加均先升后降，且兩種提取物間差異顯著(P<0.05)。在水提物處理50 mg時，小白菜幼苗過氧化物酶活性最大為95.63 U·g-1·min-1，比對照顯著提高了64.58%；醇提取物75 mg時，小白菜幼苗過氧化物酶活性最大為115.11 U·g-1·min-1，比對照提高了98.10%。

2.3 火炬樹根4種化合物對小白菜種子萌發(fā)的影響

由表4可知，4種化合物均顯著抑制小白菜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，且隨處理濃度的升高抑制更加強烈。其中，糠醛處理下，小白菜種子受到的抑制最為強烈，糠醛質(zhì)量濃度為1.00 g·L-1處理下，小白菜種子發(fā)芽率降為4.80%，發(fā)芽指數(shù)降為0.67，化感指數(shù)為-0.95(P<0.05)。

表4 4種化合物對小白菜種子萌發(fā)的影響

在4種化合物處理下，小白菜的根長和莖長受到顯著抑制，隨濃度升高呈下降趨勢(P<0.05)。其中，焦性沒食子酸對小白菜根長生長抑制最強烈，焦性沒食子酸質(zhì)量濃度為1.00 g·L-1時，根長為6.18 mm。苯甲酸顯著抑制小白菜莖長生長，苯甲酸質(zhì)量濃度為0.75 g·L-1時，小白菜莖長為7.36 mm。

3 討論

植物產(chǎn)生的化感物質(zhì)釋放到環(huán)境中，會促進或抑制周圍植物的生長[7，26]。本試驗中，火炬樹根水提物和醇提物均抑制了小白菜種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)和根長生長?；鹁鏄涓阂种屏饲G條及波斯菊種子萌發(fā)[17]，因為根系分泌的化合物對其他植物的種子萌發(fā)具有直接的化感效應(yīng)。在本試驗中，火炬樹根醇提物對小白菜種子發(fā)芽率、萌發(fā)速度的抑制作用更加顯著，水提物對小白菜根的伸長抑制更加顯著。這是因為醇提取物中有更多的活性物質(zhì)，如糖類、黃酮類、多酚和生物堿等化合物[10，27-28]，而水提物中的物質(zhì)易被植物吸收，破壞植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、抑制其根尖細(xì)胞分裂，從而導(dǎo)致根的長度降低[17]。

活性氧(ROS)含量通常作為許多代謝過程的副產(chǎn)物產(chǎn)生，包括H2O2和O2-·，活性氧的生成與消除受到植物細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的控制，通常處于一個動態(tài)的平衡狀態(tài)，這種平衡在外界脅迫下容易被打破[17，25，29]。MDA一般用來表示植物細(xì)胞膜損傷的程度，代表葉組織中脂質(zhì)過氧化的程度[30]。小白菜葉片中的POD和SOD活性隨處理劑量的增加先升高然后降低，因為提取物脅迫使植物細(xì)胞產(chǎn)生更多的抗氧化酶以保護細(xì)胞膜穩(wěn)定性，免受氧化損傷[23，31]。在醇提物處理下，小白菜葉片中POD和SOD活性的增加更為顯著，這是因為醇提物對小白菜氧化損傷更嚴(yán)重。小白菜葉片中MDA含量隨提取物濃度的增加先升高后降低，該結(jié)果同波斯菊對火炬樹的化感響應(yīng)研究結(jié)果相似[17，32]。水提物處理下，MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高更為顯著，可能是因為水提物易溶于水，更容易進入小白菜細(xì)胞，導(dǎo)致其細(xì)胞膜高度過氧化，嚴(yán)重破壞小白菜細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。在根提物處理下，小白菜可溶性蛋白質(zhì)量濃度降低，這與以往馬銀山等[33]、張震等[34]的研究結(jié)果相似，因為環(huán)境脅迫導(dǎo)致植物為了適應(yīng)不利環(huán)境而降低新陳代謝和光合作用，減少可溶性蛋白的生成[35]。

從火炬樹根中鑒定出的4種化合物中，沒食子酸和焦性沒食子酸從水提物中鑒定出來，糠醛和苯甲酸從醇提物中鑒定出來。沒食子酸和焦性沒食子酸的處理顯著抑制了小白菜根的伸長，糠醛和苯甲酸對小白菜種子萌發(fā)的抑制作用更為顯著。這與提取物對小白菜種子萌發(fā)的抑制作用類似，更進一步的驗證了水提物與醇提物對小白菜的化感效應(yīng)存在顯著差異。

4 結(jié)論

火炬樹根醇提取物會顯著抑制小白菜種子萌發(fā)率、延遲其發(fā)芽速度，而水提物顯著抑制小白菜根長。火炬樹根水提物和醇提物會不同程度地使得小白菜幼苗體內(nèi)活性氧動態(tài)失衡、破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、導(dǎo)致膜脂過氧化程度增加，從而抑制小白菜幼苗的生長，其中水提物對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞更嚴(yán)重，MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加更為顯著，而醇提物對小白菜幼苗體內(nèi)氧化損傷更大，造成SOD和POD活性升高更多。本試驗研究了火炬樹根水提物和醇提物對小白菜種子萌發(fā)和幼苗生長影響差異，但火炬樹根化感物質(zhì)還需要進一步鑒定研究。