◆成都市第四十九中學高一 張熙喬

經常飲用活菌型乳酸菌飲料可改善腸道微生物的組成，提高人體免疫力。但是，體內的乳酸菌活菌要積累到一定數量，才有機會到達并定植于小腸內，抑制有害菌生長，保持腸道微生態(tài)平衡。所以，評價活菌型乳酸菌飲料的一個重要指標是其活菌的含量。

目前，活菌型乳酸菌飲料都需冷藏保存。雖然大多數超市的乳酸菌飲料被存放在冰柜中，但有時為方便促銷，部分乳酸菌飲料被擺放在常溫柜臺或未密封的小冰柜里。

常溫下，乳酸菌飲料中的乳酸菌還能存活嗎？保質期內，冷藏保存的乳酸菌飲料中的活菌數真的達標嗎？外出攜帶的乳酸菌飲料中的活菌數有什么變化？對于腸胃敏感的人來說，提前多久將乳酸菌飲料置于常溫下更合適？這些問題都值得深入探討。

一、市場調研

走訪成都市新都區(qū)的超市，挑選并記錄常溫、冷藏保存的乳酸菌飲料的種類及產品信息。

二、實驗器材

4種活菌型乳酸菌飲料、MRS液體培養(yǎng)基、瓊脂粉、90 mm無菌培養(yǎng)皿、天平、三角瓶、微量移液器、酒精燈、普通光學顯微鏡、RO純水儀、超凈工作臺、滅菌鍋、培養(yǎng)箱等。

三、實驗方法

參照國家標準GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》執(zhí)行，遵循無菌操作程序。

（一）分組

將購買的活菌型乳酸菌飲料分成兩組。第一組包含4種，每種12瓶，分別儲存于4 ℃和常溫環(huán)境中，在保質期內，每隔5天分別取1瓶檢測其活菌數。第二組由2種活菌型乳酸菌飲料組成，每種7瓶，分別考察它們于常溫下放置 2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h后的活菌數。

（二）制備平板培養(yǎng)基

稱取MRS液體培養(yǎng)基66.2 g，將其加熱溶解于1000 mL蒸餾水中，加入2%瓊脂粉。將配好的培養(yǎng)基用121 ℃高壓滅菌20 min后冷卻至50 ℃左右，在超凈工作臺內制備平板。

圖1 制備平板培養(yǎng)基

（三）樣品稀釋、涂布及培養(yǎng)

1.樣品稀釋

將1 mL乳酸菌飲料制成1∶10的樣品稀釋液，混勻后取0.1 mL上述稀釋液加入0.9 mLRO水中，制成1∶100的稀釋液。按上述操作順序，做成10倍遞增樣品稀釋液。

2.涂布及培養(yǎng)

無菌條件下，取10-8、10-9或10-10稀釋梯度的稀釋液0.05 mL，分別均勻涂布于2個MRS平板內，封口膜密封平板后于37 ℃環(huán)境中倒置培養(yǎng)48 h。

（四）平板計數

選取菌落數在30～300 CFU、無散延菌落生長的平板計菌落數。每個稀釋度的菌落數記錄為兩個平板的平均數。將上述平均值乘以相應的稀釋倍數，作為每毫升乳酸菌飲料中含有的活菌數。

（五）觀察菌落形態(tài)

將培養(yǎng)好的平板取出，肉眼觀察每個平板上的菌落形態(tài)。

（六）革蘭氏染色及觀察細胞形態(tài)

1.革蘭氏染色

用接種環(huán)挑取菌落形態(tài)不同的單菌落置于載玻片，均勻涂開后用酒精燈外焰烤干。載玻片上的菌體薄層用草酸銨結晶紫染色1 min。之后用RO水沖洗，再滴加碘液覆蓋涂面染色1 min后，用RO水沖洗，用干凈的吸水紙吸干多余水分，加入數滴質量分數為95%的酒精，并輕輕搖動。脫色20 s后，再用RO水沖洗，用干凈的吸水紙吸去表面水分。最后用蕃紅復染1 min，RO水沖洗、干燥，用顯微鏡觀察。

2.觀察細胞形態(tài)

先用普通光學顯微鏡的低倍鏡找到待觀察物象，并移到視野中央，再切換到高倍鏡和油鏡，觀察菌體細胞形態(tài)和上述革蘭氏染色結果。

四、實驗觀察

（一）選取實驗對象

經市場調研發(fā)現，2022年暑假期間成都市新都區(qū)售賣的乳酸菌飲料主要來自伊利、蒙牛、新希望、養(yǎng)樂多、菊樂等5個廠家，產品類型主要有10種。挑選其中4種明確標識“活菌型乳酸菌”的產品作為本實驗研究對象，如表1。

表1 4種實驗研究對象的產品信息

（二）不同儲存溫度對保質期內活菌型乳酸飲料中活菌數的影響

將4種乳酸菌飲料分別儲存在4 ℃和常溫的環(huán)境中，30天內其活菌數的變化如表2所示。

表2 4種乳酸菌飲料中的活菌數檢測數據

（三）短時間內常溫環(huán)境中乳酸菌飲料中活菌數的變化

常溫下，上市5 d后的“蒙牛優(yōu)益C”和“養(yǎng)樂多”的活菌數變化如表3。

表3 常溫環(huán)境中24 h內兩種乳酸菌飲料中活菌數的變化

（四）乳酸菌的菌落及細胞形態(tài)

如圖2，平板內的菌落均為白色、圓形，有的菌落中等偏大，有的偏小，所有菌落表面凸起、濕潤，邊緣整齊。所有菌體細胞經革蘭氏染色處理后呈紫色，表明這些菌體均為革蘭氏陽性菌(G+)。有的菌體細胞為直徑0.5～2.0 μm的球形（圖3b），有的為長桿或短桿形（圖3c），細胞均成對或成鏈排列，無芽胞、不運動。

圖2 乳酸菌的菌落形態(tài)

圖3 觀察到的乳酸菌菌體細胞形態(tài)（1000倍）

五、結果分析與結論

（一）在保質期內，冷藏與常溫條件下活菌數的變化

常溫儲存5～10 d時，雖然乳酸菌飲料中的活菌數仍然達標，但還是建議市民購買活菌型乳酸菌飲料時，一定要從冷藏柜中挑選并盡量選擇生產日期較新的產品。買回家后若不能馬上飲用，一定要冷藏儲存并盡快飲用。

生產企業(yè)和超市應始終對活菌型乳酸菌產品進行冷鏈運輸，并對超市銷售人員進行培訓，以便引導消費者正確飲用。

（二）常溫條件下儲存24 h后，活菌數的變化

活菌型乳酸菌飲料常溫放置超過4 h時，其中的活菌數開始顯著下降。因此，建議腸胃敏感者可提前將活菌型乳酸菌飲料置于常溫下，但在常溫下放置的時間最好不要超過4 h。外出游玩時，未冷藏的活菌型乳酸菌飲料最好在4 h內飲用。

（三）乳酸菌的菌落及細胞形態(tài)

本實驗分離的乳酸菌均為革蘭氏陽性菌。目前，市面上銷售的乳酸菌飲料中主要含有乳桿菌屬、嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌屬三類，本實驗只觀察到了嗜熱鏈球菌和乳桿菌的細胞形態(tài)，未見雙歧桿菌。可能是因為雙歧桿菌只能存活于絕對厭氧條件下，在兼性需氧條件下不生長。而我們的培養(yǎng)條件是兼性厭氧，未達到絕對厭氧，因此雙歧桿菌不能生長。

綜合上述實驗結果，可得出結論：活菌型乳酸菌飲料中的活菌數與儲存條件比如溫度、時間密切相關。

六、創(chuàng)新性與實用性

首次探究了常溫條件下，活菌型乳酸菌飲料中活菌數在24 h內的變化，為人們科學飲用活菌型乳酸菌飲料提供實驗依據。同時，探索了冷藏和常溫兩種環(huán)境對活菌型乳酸飲料中活菌數在保質期內的變化，為企業(yè)生產活菌型乳酸菌飲料以及行業(yè)標準的制定提供參考。

實用性體現在本實驗結果可引導人們正確選購與飲用活菌型乳酸菌飲料，以保證攝入足夠的活菌，充分發(fā)揮乳酸菌促消化、抑制有害微生物在人體腸道內生存等作用。

感謝指導老師為本研究提供的實驗條件和指導！