黃軒雅,歐藝鵬,魏淑怡,林 娟

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438；2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438)

突變體的獲得途徑是研究基因功能的重要基礎(chǔ)。獲得突變體的方法有物理方法[1]、化學(xué)方法[2]和基因工程方法[3]。前兩種方法對基因的改變具有隨機(jī)性,不能夠?qū)Π谢蜻M(jìn)行直接修飾,因此其應(yīng)用受到了很大的限制。基因工程方法是近年來發(fā)展的一種新型的突變體獲得技術(shù),尤其是基因組編輯技術(shù)已成為基因改造和研究的主要手段,并已成功在多種植物中得到普遍應(yīng)用[4]。CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Proteins 9)是繼鋅指核酸酶技術(shù)(Zinc-Finger Nucleases, ZFNs)[5]和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(Transcription Activator-Like(TAL) Effector Nucleases, TALENs)[6]之后發(fā)展的第3代基因組定點(diǎn)編輯技術(shù),是目前最新和最高效的基因編輯技術(shù)。這一技術(shù)首先在人類和小鼠細(xì)胞中成功對部分基因?qū)崿F(xiàn)了編輯[7],之后在模式植物擬南芥[8]、煙草[9]、水稻[10]和一些經(jīng)濟(jì)植物[11-12]中獲得了廣泛的應(yīng)用,成功實(shí)現(xiàn)了靶點(diǎn)的突變。

CRISPR是指一段具有成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列,通過CRISPR系統(tǒng)將目標(biāo)序列切斷后,生物個體會啟動自身的修復(fù)機(jī)制,包括同源重組修復(fù)和非同源重組修復(fù),在修復(fù)后產(chǎn)生插入、缺失等突變,導(dǎo)致目標(biāo)基因沉默。其作用原理是核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白在gRNA(single-guide RNA)引導(dǎo)下,在目標(biāo)基因的特定區(qū)域?qū)μ囟ǖ腄NA進(jìn)行定點(diǎn)切割,造成DNA雙鏈的斷裂,細(xì)胞實(shí)行自主修復(fù)機(jī)制,從而實(shí)現(xiàn)特定位點(diǎn)的定向編輯。雖然CRISPR/Cas9技術(shù)在多種植物的基因編輯中取得了成功,然而這一編輯系統(tǒng)的編輯率卻因物種不同、基因不同而存在明顯差異,因此如何提高靶基因的編輯率是該技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn),也是研究者們重點(diǎn)關(guān)注的焦點(diǎn)。提高CRISPR/Cas9技術(shù)基因編輯率主要考慮兩個方面,一是gRNA的設(shè)計(jì)；二是Cas蛋白的改造。CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作的核心在于人工設(shè)計(jì)gRNA,gRNA是由crRNA(crispr RNA)和反式激活RNA即tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)兩種非編碼RNA通過堿基配對結(jié)合而成[13],目前已經(jīng)將其融合為一條鏈,仍稱為gRNA,因此人工設(shè)計(jì)的gRNA是影響CRISPR/Cas9技術(shù)基因編輯率的主要因素,這主要是對靶位點(diǎn)序列的設(shè)計(jì)。雖然研究者們設(shè)計(jì)了多款專門用于gRNA設(shè)計(jì)的在線軟件[14-16],這些軟件能夠篩選出評分較高的gRNA,為研究者們設(shè)計(jì)gRNA提供了一條途徑。但僅僅根據(jù)設(shè)計(jì)軟件,篩選使用評分最高的gRNA來構(gòu)建載體,后續(xù)的基因編輯率仍然得不到有效的保障[17]。目前研究發(fā)現(xiàn)gRNA序列上優(yōu)化的GC(Guanine-Cytosine)含量對基因的編輯率會產(chǎn)生一定的影響,高GC含量可使gRNA與基因組DNA的雜交趨于穩(wěn)定[18],而低GC含量可降低脫靶效應(yīng)[19]。因此研究gRNA的結(jié)構(gòu)與基因編輯的關(guān)系對于提高編輯率具有重要的意義。

本研究從gRNA的二級結(jié)構(gòu)入手,選用的載體為2015年報(bào)道的CRISPR載體,該載體的策略是通過具有串聯(lián)排列的tRNA-gRNA結(jié)構(gòu)的合成基因,利用植物體內(nèi)的RNase P和RNase Z識別出tRNA-gRNA,并將其切割加工成5’靶向序列的gRNA,從而釋放gRNA,再由gRNA去引導(dǎo)Cas9蛋白去編輯目的基因[20]。由于tRNA-gRNA后加入的靶位點(diǎn)序列不同,會形成不同的二級結(jié)構(gòu),也會影響基因的編輯率。本研究選擇的靶標(biāo)基因?yàn)橹参锝M蛋白去乙?；?Histone Deacetylase, HDAC)基因家族中一個植物特有的HD2(HD-2 type protein)亞家族基因,通過設(shè)計(jì)這一亞家族中3個基因不同的CRISPR/Cas9靶點(diǎn),觀察不同的RNA(gRNA+靶點(diǎn)序列)的二級結(jié)構(gòu)對基因編輯率的影響。HD2亞家族在擬南芥中共包含4個基因,分別稱為HD2A,HD2B,HD2C和HD2D[21]。之前研究顯示HD2基因的過表達(dá)或突變體植株具有容易觀察的表型,如: 擬南芥HD2A過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株具有多種發(fā)育異常,包括葉片卷曲,開花延遲和種子發(fā)育中斷等[22]。HD2B的CRISPR基因編輯植株的葉片也表現(xiàn)為窄而尖的葉子[23]。HD2D基因的突變體會導(dǎo)致葉片少而小,HD2D過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株葉片多且大[24]。從擬南芥的葉片的變化可以直接看出HD2基因是否被編輯。因此選擇HD2基因作為驗(yàn)證不同tRNA-gRNA二級結(jié)構(gòu)影響CRISPR/Cas9編輯率的靶基因,可為CRISPR/Cas9技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

擬南芥野生型植株Col-0(Columbia生態(tài)型),突變體植株hd2b-1(SALK_049380C)和hd2d-1(SALK_104071C)均購自Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State University(ABRC, http:∥abrc.osu.edu),純合的突變體植株根據(jù)SIGnAL(Salk Institute Genomic Analysis Laboratory, http:∥signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)提供的方法及引物序列進(jìn)行檢測。所有植物材料生長條件一致,均培養(yǎng)在恒溫溫室(22 ℃),濕度65%,光周期為16 h光照,8 h黑暗。

CRISPR/Cas9編輯植株:hd2b-2(HD2B靶點(diǎn)A的G堿基插入),hd2d-2(HD2D靶點(diǎn)A的A堿基缺失)。

1.2 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α菌株和根瘤農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensGV3101菌株購自唯地生物公司。PTG模板質(zhì)粒: pLFC294(pGTR-sp)和CRISPR載體質(zhì)粒: Pro: 35S: SpCas9來自河南大學(xué)陸平利教授的饋贈。

1.3 方法

1.3.1 CRISPR載體構(gòu)建

根據(jù)HD2A,HD2B,HD2D基因的序列,使用網(wǎng)站https:∥www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html,對每個基因分別設(shè)計(jì)兩個不同的靶點(diǎn),分別稱為靶點(diǎn)A(Target A)和靶點(diǎn)B(Target B),具體靶點(diǎn)位置如圖1(a)(見第148頁)所示。通過MEGA軟件分別對3個基因的靶點(diǎn)A和靶點(diǎn)B的序列進(jìn)行了比對,發(fā)現(xiàn)不同基因靶點(diǎn)位置的序列有一定的差異(圖1(b)，見第148頁)。

圖1 HD2家族基因結(jié)構(gòu)圖和編輯位點(diǎn)示意圖Fig.1 Gene structure and editing sites of HD2 family(a) HD2家族基因結(jié)構(gòu)圖和編輯位點(diǎn)示意圖;(b) 箭頭所指為靶點(diǎn)序列和靶點(diǎn)通過MEGA軟件序列比對后的序列相似性。

載體構(gòu)建選用GG(Golden Gate)一步克隆策略[20,25]。以基因的靶向序列為模板,分別設(shè)計(jì)一對gRNA間隔區(qū)特異性引物。引物設(shè)計(jì)原則見圖2(a)(見第149頁),其中每一個引物5’端的2個堿基(小寫字母)為隨機(jī)添加的保護(hù)酶切位點(diǎn)的堿基,3’端的15個堿基為與gRNA退火(正向引物)或與tRNA退火(正向引物)的堿基,5’端的第3～9個堿基為BsaⅠ的酶切位點(diǎn)的特異性序列(斜體大寫字母),5’端的第10～21個堿基為基因靶點(diǎn)的特異性序列(大寫字母),正向引物為基因靶點(diǎn)的9～20序列,反向引物基因靶點(diǎn)的1～12的反向互補(bǔ)序列,其中正反向引物內(nèi)有4個堿基的反向互補(bǔ)(粗體大寫字母)。引物分別命名為gRNA-HxA-F,gRNA-HxA-R,其中Hx代表HD2基因,A代表靶點(diǎn)A,F代表正向引物,R代表反向引物。載體構(gòu)建過程如圖2(b)所示。以pGTR-sp質(zhì)粒為模板,用相應(yīng)的gRNA間隔區(qū)特異性正向引物(gRNA-HxA-F)和L5AD5引物、gRNA間隔區(qū)特異性反向引物(gRNA-HxA-R)和L3AD5(表1，見第150頁)分別擴(kuò)增得到兩條序列,分別用BsaⅠ酶切后,用T4DNA連接酶連接得到PTG產(chǎn)物(序列包括tRNA序列+靶點(diǎn)序列+gRNA序列)。PTG產(chǎn)物用水稀釋10倍。以稀釋后的PTG產(chǎn)物為模板,用S5AD5和S3AD5引物擴(kuò)增PTG產(chǎn)物。使用FokⅠ限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增后的PTG產(chǎn)物,同時用BsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切Pro: 35S: SpCas9質(zhì)粒。使用T4DNA連接酶連接兩個酶切產(chǎn)物后,使用熱激法將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)。在Kan抗性的固體LB培養(yǎng)基上涂板。陽性菌用OsU3和UGW-gRNA引物(表1，見第150頁)菌檢,將陽性菌搖菌后提取質(zhì)粒,送測序,構(gòu)建好的載體分別命名為pHD2A-AC、pHD2A-BC、pHD2B-AC、pHD2B-BC、pHD2D-AC、pHD2D-BC。把測序正確的6個載體分別通過熱激的方法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌A.tumefaciensGV3101感受態(tài)中,制備成工程菌。

1.3.2 擬南芥的轉(zhuǎn)化

擬南芥的轉(zhuǎn)化采用浸花法[21]。選擇合適開花期的野生型擬南芥植株,在轉(zhuǎn)基因24 h前將植株的果莢和開放的小花全部剪掉,保留未開放的小花蕾。將待轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌工程菌小搖培育種子液,隨后1∶200(體積比)大搖至OD600=1.3～1.7,離心收集菌體(8 000 r/min,3 min),用緩沖液重懸后,將擬南芥的花序放到含農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化介質(zhì)中浸泡3～5 min進(jìn)行擬南芥的轉(zhuǎn)染,保濕、避光一天后,置于溫室正常生長,兩周后再重復(fù)轉(zhuǎn)染一次。

1.3.3 擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選

陽性苗的篩選采用載體抗性篩選方法。把T0代轉(zhuǎn)基因植株的種子均勻撒在抗性平板(1/2 MS附加25 μg/mL潮霉素(Hygromycin, Hyg)上,篩選T1代陽性苗。

1.3.4 轉(zhuǎn)基因陽性植株基因編輯結(jié)果的檢測

選用常規(guī)基因測序技術(shù)檢測目的基因的編輯結(jié)果。采用CTAB法提取待測植株的DNA,用基因靶點(diǎn)序列檢測引物(見表1)分別擴(kuò)增HD2A,HD2B和HD2D基因的特異序列(引物的位置見圖1(a)),瓊脂糖凝膠電泳后切下目的條帶,純化后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因陽性植株基因表達(dá)量的檢測和表型觀察

表達(dá)量的檢測選用實(shí)時熒光定量PCR(Real-Time PCR)的方法[27]。使用CWBIO公司的植物RNA提取試劑盒提取待測植株葉片的總RNA,使用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。Real-Time PCR擴(kuò)增使用TaKaRa公司TB GREEN試劑盒,Actin-R為擬南芥的內(nèi)參基因,采用BIO-RAD定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。Real-Time PCR程序?yàn)?5 ℃(10 min);95 ℃(15 s),60 ℃(1 min),共40個循環(huán),溶解曲線默認(rèn)系統(tǒng)程序(95 ℃,10 s;60 ℃,1 min;95 ℃,15 s)。根據(jù)程序?qū)С鯟T值數(shù)據(jù),利用2-ΔΔCT獲得相對表達(dá)量數(shù)據(jù),每個樣本3次生物性重復(fù)。Real-Time PCR擴(kuò)增基因?qū)?yīng)引物詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.3.6 RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法

RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測在http:∥rna.tbi.univie.ac.at/和http:∥www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form.php網(wǎng)站預(yù)測,預(yù)測的序列: 20 bp靶點(diǎn)序列和靶點(diǎn)+gRNA骨架,一共96 bp。其中g(shù)RNA骨架序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 gRNA靶點(diǎn)+gRNA骨架二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

為了分析RNA的二級結(jié)構(gòu)對基因的編輯率的影響,我們通過網(wǎng)站(http:∥rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNA fold.cgi)預(yù)測了不同靶點(diǎn)上的靶點(diǎn)序列和gRNA骨架的二級結(jié)構(gòu)(如圖3(a)～(f)①所示),并通過另一個網(wǎng)站(http:∥www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form.php)預(yù)測(如圖3(a)～(f)②所示)。兩個網(wǎng)站預(yù)測的結(jié)果大體一致,排除預(yù)測結(jié)果因?yàn)榉椒ā?shù)選擇不同而改變。從圖3(a)可以看出HD2ATarget A+gRNA骨架的二級結(jié)構(gòu)由一段單鏈RNA、5個莖環(huán)、1個內(nèi)飾環(huán)、1個突環(huán)、1個多環(huán)和2個發(fā)夾環(huán)組成。如果以HD2ATarget A+gRNA骨架的二級結(jié)構(gòu)為標(biāo)準(zhǔn),那么HD2ATarget B+gRNA骨架多了1個突環(huán),少了1個發(fā)夾環(huán)(圖3(b))。HD2BTarget A+gRNA骨架少了1個多環(huán)和1個發(fā)夾環(huán)(圖3(c))。HD2BTarget B+gRNA骨架少了1個內(nèi)飾環(huán),多了1個發(fā)夾環(huán)和2個突環(huán)(圖3(d))。HD2DTarget A+gRNA骨架少了1個內(nèi)飾環(huán)和1個發(fā)夾環(huán),多了1個突環(huán)(圖3(e))。HD2DTarget B+gRNA骨架的莖環(huán)、內(nèi)飾環(huán)、多環(huán)和發(fā)夾環(huán)各少1個(圖3(f))。gRNA靶點(diǎn)+gRNA骨架二級結(jié)構(gòu)的最小自由能在-26～-21 kcal/mol之間。

圖3 gRNA靶點(diǎn)+gRNA骨架的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.3 Prediction of secondary structure of gRNA target+gRNA scaffold(a) HD2A Target A+gRNA骨架;(b) HD2A Target B+gRNA骨架;(c) HD2B Target A+gRNA骨架;(d) HD2B Target B+gRNA骨架;(e) HD2D Target A+gRNA骨架;(f) HD2D Target B+gRNA骨架(根據(jù)最小自由能預(yù)測gRNA靶點(diǎn)+gRNA骨架的二級結(jié)構(gòu)。不同顏色表示堿基配對概率: 0%～100%)。

同時對20 bp靶點(diǎn)序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。由于20 bp序列較短,導(dǎo)致不同網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果有差別,以下描述以①圖為主。自身存在發(fā)卡結(jié)構(gòu)的靶位點(diǎn)沒有編輯成功(圖4(a),4(f)),編輯成功的靶點(diǎn)沒有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖4(c),4(e))?？梢猿晒庉嫷陌形稽c(diǎn)二級結(jié)構(gòu)最小自由能在-0.64～2.00 kcal/mol區(qū)間。最小自由能低于-1.00 kcal/mol不能成功編輯(圖4(a),4(f))。

圖4 20 bp靶點(diǎn)序列的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.4 Prediction of secondary structure of 20 bp target(a) HD2A Target A;(b) HD2A Target B;(c) HD2B Target A;(d) HD2B Target B;(e) HD2D Target A;(f) HD2D Target B(根據(jù)最小自由能預(yù)測可能性最高的二級結(jié)構(gòu)。不同顏色表示堿基配對概率: 0%～100%)。

2.2 靶位點(diǎn)編輯的統(tǒng)計(jì)分析

將工程菌轉(zhuǎn)入擬南芥,收獲轉(zhuǎn)基因T1代種子后,進(jìn)一步的篩選獲得T1代的陽性苗。針對HD2A基因的編輯,共獲得了41株陽性苗,其中靶點(diǎn)A有23株,靶點(diǎn)B有18株；針對HD2B基因的編輯,共獲得了38株陽性苗,其中靶點(diǎn)A有17株,靶點(diǎn)B有21株；針對HD2D基因的編輯,共獲得了51株陽性苗,其中靶點(diǎn)A有29株,靶點(diǎn)B有22株,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。將獲取的全部陽性苗分別提取DNA后,擴(kuò)增靶位點(diǎn)上下游序列進(jìn)行基因編輯位點(diǎn)的檢測(如圖1所示),結(jié)果顯示: 針對HD2A基因的編輯,所有41株陽性苗的靶位點(diǎn)序列與野生型擬南芥的序列相同,說明均未發(fā)生基因編輯,基因的編輯率為0；針對HD2B基因的編輯,只有靶位點(diǎn)A有2株陽性苗的靶位點(diǎn)序列與野生型擬南芥的序列不同,說明基因成功進(jìn)行了編輯,基因編輯率為11.7%；針對HD2D基因的編輯,也只有靶位點(diǎn)A有8株陽性苗的靶位點(diǎn)序列與野生型擬南芥的序列不同,說明基因也成功進(jìn)行了編輯,基因編輯率為27.5%,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 靶點(diǎn)編輯率統(tǒng)計(jì)

2.3 靶位點(diǎn)編輯類型的分析

基因編輯時,一般會在PAM位點(diǎn)的上游3個堿基的位點(diǎn)切割目標(biāo)DNA。為了確定基因被編輯后是否會對基因的功能產(chǎn)生影響,我們對編輯基因的序列進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。針對HD2B基因靶位點(diǎn)A的2株陽性植株的分析,發(fā)現(xiàn)在靶位點(diǎn)第10個堿基的位置插入了一個G堿基(屬于ATG前的第3個堿基,如圖5(a)所示),2株陽性植株的編輯位點(diǎn)相同；針對HD2D基因靶位點(diǎn)A的8株陽性植株的分析,發(fā)現(xiàn)有5種基因編輯類型: 有2株刪除了靶位點(diǎn)的第3位的A堿基(屬于ATG前的第19個堿基,如圖5(b)所示)；有1株為靶位點(diǎn)的第2位T堿基的缺失(屬于ATG前的第20個堿基,如圖5(c)所示)；有1株為靶位點(diǎn)的第4～6位AAG 3個堿基的缺失(屬于ATG前的第16～18位堿基,如圖5(d)所示)；有1株為靶位點(diǎn)第2位前插入一個G堿基(屬于ATG前的第19位堿基,圖5(e)所示)；還有1株編輯了兩個位點(diǎn),一個位點(diǎn)為靶點(diǎn)第2位的堿基G替換了堿基T(屬于ATG前的第20個堿基),另一個是靶點(diǎn)前的第一個堿基T的刪除(屬于ATG前的第22個堿基,如圖5(f)所示)。HD2B基因靶位點(diǎn)A和HD2D基因靶位點(diǎn)A的5種基因編輯類型都影響了5’UTR的序列。

圖5 靶位點(diǎn)編輯類型測序結(jié)果圖Fig.5 Sequences of target site in transgenic plants(a) HD2B Target A中G堿基插入;(b) HD2D Target A中A堿基缺失;(c) HD2D Target A中T堿基缺失;(d) HD2D Target A中AAG堿基缺失;(e) HD2D Target A中G堿基插入;(f) HD2D Target A中G替換T堿基和缺失T堿基(上述都是反向鏈的測序結(jié)果)

2.4 基因編輯突變體與T-DNA插入突變體植株的比較

2.4.1 表達(dá)水平的檢測

首先對購買的T-DNA插入突變體進(jìn)行了鑒定。HD2B和HD2D基因的信息和T-DNA插入的位置如圖6所示。HD2B基因T-DNA插入在啟動子位置,產(chǎn)生的突變體命名為hd2b-1(圖6(a))；HD2D基因T-DNA也插入在啟動子位置,產(chǎn)生的突變體命名為hd2d-1(圖6(b))。

圖6 HD2基因T-DNA插入示意圖Fig.6 T-DNA insertion of HD2 gene(a) HD2B基因T-DNA插入結(jié)構(gòu)圖;(b) HD2D基因T-DNA插入結(jié)構(gòu)圖.

采用Real-Time PCR對T-DNA插入突變體和相應(yīng)的基因編輯突變體的相應(yīng)基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測,T-DNA插入突變體引物的位置如圖6所示,引物序列見表1。野生型Col-0的HD2B基因表達(dá)量作為對照,hd2b-1T-DNA插入突變體的相對表達(dá)量約為0.6,HD2BTarget A中G堿基插入T2代轉(zhuǎn)基因植株命名為hd2b-2,相對表達(dá)量為0.9(圖7(a))；野生型Col-0的HD2D基因表達(dá)量作為對照,hd2d-1T-DNA插入突變體的相對表達(dá)量約為0.5,HD2DTarget A中A堿基缺失T2代轉(zhuǎn)基因植株命名為hd2d-2,相對表達(dá)量為0.8(圖7(b))。

2.4.2 葉片表型的觀察

取生長約30天的T-DNA插入突變體hd2b-1和hd2d-1以及CRISPR編輯的轉(zhuǎn)基因植株hd2b-2和hd2d-2用于葉片的觀察。T-DNA突變體hd2b-1的蓮座葉平均數(shù)為13,CRISPR編輯的突變體植株hd2b-2的蓮座葉平均數(shù)為13.8(圖7(d))。hd2b-1和hd2b-2葉片長寬比稍微高于Col-0(圖7(d))。T-DNA突變體hd2d-1的蓮座葉平均數(shù)為12.5,CRISPR編輯突變體hd2d-2的蓮座葉平均數(shù)為13。hd2d-1和hd2d-2葉片長寬比也稍微高于Col-0(圖7(d))。

圖7 基因編輯突變體與T-DNA插入突變體植株的比較Fig.7 Comparison between gene editing mutants and T-DNA insertion mutants(a) hd2b-1 T-DNA插入和hd2b-2 CRISPR編輯植株中HD2B表達(dá)量;(b) hd2d-1 T-DNA插入和hd2d-2 CRISPR編輯植株中HD2D表達(dá)量;(c) hd2b-1 T-DNA插入突變體和hd2b-2 CRISPR編輯轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉;hd2d-1 T-DNA插入突變體和hd2d-2 CRISPR編輯轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉;(d) 蓮座葉數(shù)量統(tǒng)計(jì)和葉片上寬比統(tǒng)計(jì)。每種類型植株統(tǒng)計(jì)20株以上,*表示P<0.05(Student t-test),差異顯著。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上,并且結(jié)果類似。

3 討 論

CRISPR/Cas9用于基因組編輯已被廣泛應(yīng)用,該系統(tǒng)在實(shí)際應(yīng)用中主要包含兩部分,Cas9蛋白質(zhì)以及gRNA。gRNA靶位點(diǎn)的正確選擇是保證Cas9在特定位點(diǎn)切割DNA的關(guān)鍵。以往的研究主要是依賴在線軟件預(yù)測的gRNA靶位點(diǎn),但軟件預(yù)測出評分最高gRNA不能代表有較高的編輯率,是否能夠被正確的編輯需要轉(zhuǎn)基因后進(jìn)行鑒定,這樣往往帶有一定的盲目性和滯后性。近期有研究者采用在線軟件設(shè)計(jì)并結(jié)合體外酶切檢測的方法可大大提高基因的編輯率[17]。

因本文所得的基因編輯陽性株個體數(shù)目較少,所得為初步結(jié)論。本研究通過對擬南芥HD2家族的3個基因進(jìn)行CRISPR/Cas9編輯。每個基因各設(shè)計(jì)2個不同的靶點(diǎn),不同的靶點(diǎn)會有不同的gRNA接頭二級結(jié)構(gòu)。我們發(fā)現(xiàn)不同靶點(diǎn)+gRNA骨架的二級結(jié)構(gòu)會有不同的編輯率,當(dāng)二級結(jié)構(gòu)由一段單鏈RNA、5個莖環(huán)、2個突環(huán)和3個發(fā)夾環(huán)組成的時候,編輯率最高(圖3(e))。當(dāng)gRNA靶點(diǎn)+gRNA骨架的二級結(jié)構(gòu)由一段單鏈RNA、5個莖環(huán)、1個內(nèi)飾環(huán)、1個突環(huán)和3個發(fā)夾環(huán)組成時(圖3(c)),CRISPR/Cas9也能成功編輯,但編輯率低,為11.7%。當(dāng)gRNA靶點(diǎn)+gRNA骨架的二級結(jié)構(gòu)組成為其他類型的時候,CRISPR/Cas9的編輯率為0。此外,20 bp靶點(diǎn)如果自身會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)也會影響編輯率(圖4(a),4(f))。說明gRNA接頭二級結(jié)構(gòu)對以tRNA為策略設(shè)計(jì)gRNA的CRISPR/Cas9工具極為重要。除了二級結(jié)構(gòu)外,不同基因的染色質(zhì)開放水平不同可能也會影響基因編輯的效率[28-29],這可能是靶點(diǎn)A更容易編輯成功的原因,后續(xù)需要結(jié)合ATAC-seq進(jìn)一步分析[30]。T-DNA插入系中該基因表達(dá)水平的檢測與編輯個體的檢測作比較的目的是讓讀者除了以Col-0作對照外,還能以T-DNA插入系作對照。HD2B和HD2D的T-DNA插入系的插入位置都在啟動子上,而CRISPR/Cas9成功編輯株系的位點(diǎn)在5’UTR上。5’UTR可能影響了mRNA的穩(wěn)定性[31]。

通過對轉(zhuǎn)基因植株中HD2目的基因測序、Realtime PCR檢測和葉片的表型分析,發(fā)現(xiàn)特定gRNA接頭二級結(jié)構(gòu)的CRISPR/Cas9載體成功編輯了HD2家族的兩個基因。說明特定gRNA接頭二級結(jié)構(gòu)有助于植物體內(nèi)RNase P和RNase Z識別tRNA。如果沒有相應(yīng)的gRNA接頭二級結(jié)構(gòu),植物體內(nèi)部RNase P和RNase Z無法識別,相當(dāng)于只是轉(zhuǎn)了一個帶有Hyg抗性的空載體到野生型中。我們的研究有助于以tRNA為策略設(shè)計(jì)gRNA的CRISPR/Cas9工具的靶點(diǎn)選擇,幫助科研人員選擇合適的gRNA接頭二級結(jié)構(gòu),從而有效地對目的基因進(jìn)行基因編輯,提高CRISPR/Cas9編輯率。