游 牧，王凱月，李強峰

(1.青海省林木種苗總站，青海 西寧 810000；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

柳屬植物多為灌木，稀喬木，無頂芽，是北半球的主要木本樹種之一，具有喜濕、耐寒、喜光亦耐旱等特點[1]。柳屬植物往往分布于氣候惡劣，土壤貧瘠的環(huán)境中，所以形成了易成活、抗性較強、生長迅速等特有的生理生態(tài)特性[2]。在我國柳屬植物約有250種，主要分布于西北、西南和東北地區(qū)，青藏高原是現(xiàn)代柳屬植物的重要分布中心之一。青海地處青藏高原東北部，是我國柳屬植物較為豐富的地區(qū)之一[3]。

近年來全球氣溫不斷升高[4]，而柳屬植物大多喜濕冷，對高溫的耐受力不強。高溫條件不但影響柳屬植物的生長表現(xiàn)，更是制約柳屬植物資源引種的重要因子。而國內(nèi)關(guān)于柳屬植物的耐熱性適應(yīng)研究較少，因此研究青海地區(qū)柳屬植物的耐熱性，建立一套比較完備的耐熱性評價指標體系是非常重要的基礎(chǔ)工作。本研究以山生柳、烏柳、金絲柳、旱柳這4種青海地區(qū)常見的柳屬植物為試驗材料，測定其在高溫脅迫下葉片的4個生理指標，比較4種柳屬植物的耐熱性，為青海高海拔地區(qū)柳屬植物的引種栽培、園林綠化等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的4個柳屬植物分別為山生柳、烏柳、金絲柳、旱柳，均來源于青海大通植物園。植物園位于西寧市寧張公路29km處，海拔2460m，年平均降水量532.6mm，年日照時數(shù)2275.5-2836.8h，年平均氣溫3.9℃，植物生長期為158d[5]。是一個集科研、生產(chǎn)、旅游為一體的綜合園林基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

取山生柳、烏柳、金絲柳、旱柳4個柳屬植物1年生扦插苗的苗干截取插穗，于2020年4月上旬扦插在直徑30cm、高30cm的塑料花盆中，每盆一株，盆中裝入耕作土(田間持水量為30%)，期間在室溫條件下進行常規(guī)的養(yǎng)護管理及病蟲害防治，保證其正常生長。

在8月份將試驗材料放入人工氣候箱中進行熱脅迫處理，設(shè)置20℃(CK)、30℃、40℃三個溫度梯度，每個溫度下恒溫處理三天再依次升高到下一溫度梯度，測定不同溫度處理下4個柳屬植物的葉片的SOD(超氧化物歧化酶)活性、脯氨酸(Pro)含量、過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化氫(H2O2)含量四個生理生化指標，試驗重復(fù)三次，采用隸屬函數(shù)綜合評價法對4個柳屬植物進行耐熱性綜合評價。

1.2.2 測定指標

(1)SOD(超氧化物歧化酶)活性測定采用氮藍四唑光化還原法[6]。

(2)Pro(脯氨酸)含量的測定采用酸性茹三酮法[7]。

(3)CAT(過氧化氫酶)活性測定采用紫外吸收法[8]。

(4)H2O2(過氧化氫)含量測定采用分光光度法[9]。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法及數(shù)學(xué)模型

11個山生柳無性系的葉片指標數(shù)據(jù)采用模糊隸屬函數(shù)法[10]進行綜合評判，用隸屬度公式對試驗測定指標數(shù)據(jù)進行定量轉(zhuǎn)換，再將各指標隸屬函數(shù)值取平均值進行無性系間相互比較。使用Excel2010和SPSS23.0進行指標間的方差分析、相關(guān)性分析。

隸屬函數(shù)公式為：

Xij=(xij-xjmin)/(xjmax-xjmin)

(1)

Xij=(xjmax-xij)/(xjmax-xjmin)

(2)

式中：Xij為i樹種j指標的隸屬函數(shù)值，Xij為i樹種的j性狀值，Xjmin為各樹種j性狀的最小值，Xjmax為各樹種j性狀的最大值。當j性狀與植物的耐寒性成正相關(guān)時用(1)式，當j性狀與植物的耐寒性成負相關(guān)時用(2)式。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種柳屬植物超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化

如圖1所示，供試材料隨著處理溫度的逐漸升高，其SOD活性的變化趨勢基本相似，均呈現(xiàn)隨溫度升高而逐漸升高的變化趨勢。烏柳、山生柳、金絲柳SOD活性在高溫脅迫過程中增加的較緩慢，而旱柳SOD活性在20℃(CK)-30℃升高明顯。SOD活性在高溫脅迫過程中的增加反映了四個樹種隨著溫度的升高，超氧自由基不斷增加，刺激了SOD活性的增強。由圖1可以看出旱柳SOD活性水平偏高，由于SOD活性與抗逆性成正相關(guān)，說明其耐熱性較強。

圖1 高溫處理下四種柳屬植物超氧化物歧化酶活性變化折線圖

2.2 四種柳屬植物脯氨酸(Pro)含量的變化

大量文獻研究表明，溫度脅迫下耐熱的植物體內(nèi)積累的脯氨酸比不耐熱的植物品種多，而且耐熱性強的植物體內(nèi)脯氨酸的含量維持積累時間長，維持積累量更大。植物體內(nèi)脯氨酸可以調(diào)節(jié)滲透壓并具有保護細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用，與植物的抗逆性關(guān)系密切[11-12]。圖2反映了相同溫度處理不同樹種葉片脯氨酸的含量變化，由圖2可以看出，不同樹種的葉片游離脯氨酸變化有兩種類型，一種是先升高后降低，如旱柳，金絲柳，山生柳在20℃(CK)-30℃葉片脯氨酸累積增加，但30℃-40℃脯氨酸累積反而有下降的趨勢，在30℃達到峰值，其中山生柳的增幅最大為9.87%，此結(jié)果表明當溫度高于30℃時已不適合旱柳、金絲柳、山生柳的正常生長。另一種類型就是如烏柳在高溫脅迫整個過程中脯氨酸含量均呈上升趨勢，且在整個高溫脅迫過程中烏柳葉片內(nèi)游離脯氨酸的含量處于較高水平，表明其耐熱性較強。

圖2 高溫處理下四種柳屬植物脯氨酸含量變化折線圖

2.3 四種柳屬植物過氧化氫酶(CAT)活性的變化

CAT活性的大小與植物代謝強度以及抗性有著密切的關(guān)系[13]，如圖3所示，供試材料隨著處理溫度的逐漸升高，其CAT活性的變化趨勢基本分為兩種，其中山生柳和金絲柳呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢，而烏柳、旱柳CAT活性在CK-30℃先下降，30℃-40℃再逐漸升高，在整個高溫處理過程中，明顯可以看出旱柳CAT活性一直處于較高水平，說明其抗熱性較強，而山生柳的CAT活性較低，說明其耐熱性較弱。

圖3 高溫處理下四種柳屬植物過氧化氫酶活性變化折線圖

2.4 四種柳屬植物過氧化氫(H2O2)含量的變化

高溫脅迫對四種植物葉片過氧化氫含量的影響如圖4所示，四種植物過氧化氫含量均呈現(xiàn)先升高再緩慢降低的變化規(guī)律。在CK-30℃過氧化氫含量上升，升高的原因可能是在CK-30℃過程中過氧化氫酶(CAT)增加緩慢或出現(xiàn)降低；30℃-40℃過氧化氫含量降低，降低的原因是由于高溫脅迫下過氧化氫酶(CAT)活性的增加催化過氧化氫分解成氧和水。四種植物過氧化氫含量均在30℃時達到最大值，但增加幅度存在差異，其中山生柳相較于CK過氧化氫含量的增幅最大，增加幅度為138.97%，且在整個高溫脅迫過程中其過氧化氫含量處于一個較高水平，由于過氧化氫含量與抗逆性呈負相關(guān)，所以證明山生柳的耐熱性較差。在整個高溫脅迫過程中，金絲柳、烏柳的過氧化氫含量處于較低水平，說明其抗熱性較強。在溫度恢復(fù)試驗中，四種柳屬經(jīng)過高溫脅迫處理后恢復(fù)至20℃，四種柳屬植物過氧化氫含量均高于高溫處理前水平。

圖4 高溫處理下四種柳屬植物過氧化氫含量變化折線圖

2.5 四種柳屬植物耐熱性的綜合評價

由于不同植物的耐熱機制不同，所以對耐熱相關(guān)指標的響應(yīng)也存在差異，單一指標并不能準確、真實地反映植物的耐熱性強弱[14]，因此，采用隸屬函數(shù)法得出各指標的隸屬函數(shù)值及各材料的平均隸屬度。4個柳屬植物耐熱性指標的隸屬平均值越大則表明該樹種耐熱性越強，由此做出耐熱性排序：旱柳>金絲柳>烏柳>山生柳。

表1 溫度處理下山生柳4個柳屬植物耐熱性綜合評價

2.6 相關(guān)性分析

運用SPSS23.0數(shù)據(jù)分析軟件對SOD、CAT活性、過氧化氫含量、脯氨酸含量進行相關(guān)性分析。表2表明，過氧化氫含量與SOD活性顯著相關(guān)，與脯氨酸含量呈極顯著相關(guān)。

表2 四種柳屬植物耐熱性指標相關(guān)系數(shù)

3 討論與結(jié)論

植物耐熱性往往是植物與環(huán)境相互作用的結(jié)果[15，16]，不同的植物其耐熱機制也不盡相同，對某一特定耐熱指標的響應(yīng)也不盡相同，單一的指標難以準確地反映植物的耐熱性強弱，多個指標的綜合評價則較為全面準確[17]。SOD是植物體保護系統(tǒng)中重要的保護酶之一，在高溫脅迫下，SOD可以通過激活植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，降低膜脂過氧化作用，啟動植物的防御系統(tǒng)[18]。SOD的活性可以間接證明植物抗性的強弱，SOD活性的上升證明了高溫脅迫下其清除自由基的能力增強[19]。本研究中，4個柳屬植物均表現(xiàn)出升高的趨勢，其中旱柳葉片SOD的活性較高，證明其耐熱性較強；在植物抗逆系統(tǒng)中脯氨酸是一種理想的有機溶質(zhì)滲透調(diào)節(jié)物，在植物正常的生理活動中，脯氨酸的含量很低，但處于逆境時，就會增加脯氨酸的含量來維持植物細胞體內(nèi)的正常代謝過程[20]，其積累指數(shù)反映了植物逆境條件下的滲透調(diào)節(jié)能力[21]。目前對植物體中脯氨酸的滲透調(diào)節(jié)作用研究最多，多數(shù)情況下認為，脯氨酸的含量與植物的耐熱性強弱緊密相關(guān)，當植物處于高溫脅迫時脯氨酸含量的上升速率與耐熱性成正比。因此研究環(huán)境因子脅迫可以把脯氨酸的含量變化作為抗性生理指標[22，23]。在高溫脅迫過程中旱柳，金絲柳，山生柳在20℃(CK)-30℃葉片脯氨酸累積增加，但30℃-40℃脯氨酸累積反而有下降的趨勢，而烏柳葉片內(nèi)游離脯氨酸的含量一直表現(xiàn)為升高趨勢。這與馬寧[24]對裸仁南瓜及張施君[25]對百合品種耐熱性研究結(jié)果一致。而4個柳屬植物在高溫脅迫下葉片中CAT活性的變化存在較大差異，其變化趨勢基本分為兩種，其中山生柳和金絲柳呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢，而烏柳、旱柳過氧化氫酶活性在20-30℃先下降，30℃-40℃再逐漸升高，這也說明了無法用單一指標來評價植物耐熱性的強弱，植物耐熱性是一個復(fù)雜的綜合性狀。植物在受到高溫脅迫時，細胞膜被破壞，膜透性增強，從而發(fā)生過氧化作用，導(dǎo)致葉片中的H2O2含量增加[26]，本研究中，四種植物在高溫脅迫下葉片過氧化氫含量均呈現(xiàn)先升高再緩慢降低的變化規(guī)律。金絲柳、烏柳的過氧化氫含量處于較低水平，說明其抗熱性較強。通過對4個柳屬植物運用隸屬函數(shù)法以及生理指標的相關(guān)性分析進行綜合評價，結(jié)果表明：耐熱性排序：旱柳>金絲柳>烏柳>山生柳。

本研究僅對4個柳屬植物一年生苗木進行了高溫脅迫下生理生化指標的測定，尚不能完全反映4個柳屬植物的耐熱性。但本文所測定的試驗結(jié)果具有可對比性，可以體現(xiàn)出4個柳屬植物耐熱性的強弱，對今后青海高海拔地區(qū)柳屬植物的引種栽培、園林綠化等提供理論參考。