伊國(guó)云，程 亮

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

天然纖維素約占植物總干重的30%-50%，是自然界中產(chǎn)量最為豐富的可再生資源之一[1-2]。從纖維素結(jié)構(gòu)成分來(lái)看，它是由D-吡喃葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接起來(lái)的高分子長(zhǎng)鏈狀多糖，其分子式為(C6H10O5)n，n是指葡萄糖殘基的聚合度，n值越大纖維素單鏈就越長(zhǎng)[3-4]，隨著n值的不斷增大不同葡萄糖殘基中吡喃環(huán)基團(tuán)之間由于范德華力的作用，使微纖絲形成致密的晶體結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出強(qiáng)極性和剛性，因此難溶于水和弱酸弱堿，嚴(yán)重阻礙對(duì)纖維素的可再生性利用[5-6]。

從目前現(xiàn)有的纖維素利用手段來(lái)看主要方法包括物理方法、化學(xué)方法、微生物法[7]。物理方法如蒸汽爆破法、高壓膨化法、機(jī)械粉碎法，但主要作用于纖維素?zé)o定型區(qū)，降解效率很低；化學(xué)法如酸堿液處理法、氨化處理法，但對(duì)環(huán)境污染較為嚴(yán)重，降解產(chǎn)物易變性且不徹底[8-9]；微生物降解即便降解速率較慢，但能降解為可利用性單糖，且反應(yīng)條件溫和生產(chǎn)成本低，有利于大面積應(yīng)用[10-12]。因此，開發(fā)高效降解纖維素的微生物菌劑已成為當(dāng)今關(guān)注的熱點(diǎn)[13-14]。本研究以原始森林土壤為菌源，篩選優(yōu)勢(shì)菌株，對(duì)其進(jìn)行濾紙條崩解能力和纖維素酶測(cè)定，篩選產(chǎn)酶能力佳的菌株，為開發(fā)高效降解纖維素菌劑及優(yōu)質(zhì)菌源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源

使用蛇形采樣法從青海省北山、大坂山等處采集森林土，裝入聚乙烯塑料袋中，外部貼標(biāo)簽標(biāo)明序號(hào)，在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)2.0g，K2HPO41.0g，NaCl 5.0g，NaNO33.0g，MgSO4·3H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂20.0g，去離子水1L。

濾紙條培養(yǎng)基：1cm×2cm濾紙條，KH2PO41.0g，NaCl5.0g，F(xiàn)eCl30.01g，MgSO40.3g，NaNO32.5g，CaCl20.1g，1000ml蒸餾水。

細(xì)菌種子培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10g，KH2PO41.0g，NaCl5.0g，pH7.0，去離子水1L。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na20.0g，(NH4)2SO42.0g，KH2PO42.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，CaCl20.1g，NaCl5.0g，去離子水1000ml。

LB培養(yǎng)基：NaCl10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，瓊脂15.0g，去離子水1000ml。

上述培養(yǎng)基均121℃，101KPa滅菌20min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 降解菌的富集與分離

稱取森林土5g于裝有100ml已滅菌無(wú)菌水的250ml錐形瓶中，150r/min振蕩1h，使樣品完全分散，靜置后取上清液1ml加入裝有9ml無(wú)菌水的試管中，得到1×10-1稀釋液，依次連續(xù)稀釋，制成1×10-2、1×10-3、1×10-4濃度梯度稀釋液，接種到富集培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，多次繼代純化培養(yǎng)，直至得到純的單菌株。

1.2.2 降解菌的初篩

采用剛果紅染色劑培養(yǎng)菌株：將分離純化得到的不同菌株接轉(zhuǎn)到富集培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)72h。待生長(zhǎng)出完整旺盛菌落時(shí)用0.2mg/ml剛果紅染色，測(cè)量水解圈直徑(D)和菌落直徑(d)，計(jì)算降解效果(D/d)，每株菌株重復(fù)測(cè)量3次，菌株纖維素水解能力與D/d值呈正比，根據(jù)比值選取高產(chǎn)酶菌株。

濾紙的崩解實(shí)驗(yàn)：將水解能力較好的不同菌株置于50ml的種子培養(yǎng)基中，在25℃、180r/min搖床中振蕩培養(yǎng)2d制成種子液，按2%(W/V)的接種量轉(zhuǎn)接至濾紙條培養(yǎng)基中，在25℃、150r/min下培養(yǎng)15d；空白組不接種菌液。每組3個(gè)重復(fù)，根據(jù)濾紙的崩解情況來(lái)初步判斷菌株降解纖維素的能力。降解指標(biāo)如下：+，濾紙表面膨脹不整齊；++，濾紙表面膨脹并四角下彎；+++，濾紙形狀已改變；++++，濾紙完全成糊狀。

1.2.3 降解菌的復(fù)篩1.

2.3.1 粗酶液的制備

將復(fù)篩獲得的單菌落于50mL液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在25℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)72h，獲得的發(fā)酵液在4℃、6000r/min條件下離心10min，上清液即為粗酶液，用于酶活力的測(cè)定。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml于25ml試管中，分別準(zhǔn)確加入DNS試劑1.5ml，沸水浴5min，取出后待冷卻至室溫，使用蒸餾水補(bǔ)足至20ml，顛倒混勻，540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.9197x-0.1488(R2=0.9985)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3.3 纖維素酶活的測(cè)定[15]：

(1)羧甲基纖維素酶酶活測(cè)定：取0.5mL稀釋后的粗酶液至試管中，加1mL1%的CMC-Na溶液和0.5mL的磷酸緩沖液(0.1mol/ml，pH值6.0)混勻，于50℃水浴反應(yīng)30min，取出，加入1.5ml DNS試劑，沸水浴5min中止反應(yīng)，冷卻至室溫，以100℃煮沸10min失活的粗酶液作為空白對(duì)照組，采用3，5-二硝基水楊酸比色法在540nm下測(cè)定還原糖的量，計(jì)算酶活。

(2)濾紙酶活性測(cè)定：取1cm×2cm的濾紙條作為底物，加入1.5ml pH 6.0的磷酸緩沖液和0.5ml粗酶液，于50℃水浴條件下反應(yīng)60min后終止反應(yīng)，余下操作與羧甲基纖維素酶的處理方式相同，在540nm下測(cè)定其OD540nm值。

(3)外切-β-葡聚糖酶活性測(cè)定：在試管中加入1%的微晶纖維素底物溶液和0.5ml緩沖液，再加入0.5ml酶液，于50℃水浴鍋中反應(yīng)30min，剩余操作與羧甲基纖維素酶的處理方式相同。以每分鐘生成相當(dāng)于1μg的葡萄糖為一個(gè)酶活力單位。

酶活力X=1000×G/(V×T)

式中，X是樣品的酶活力(U/ml)；G是標(biāo)準(zhǔn)曲線上光吸收值所對(duì)應(yīng)的葡萄糖毫克數(shù)；V是加酶量(ml)；T為作用時(shí)間(min)。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

菌株DNA提?。喊凑占?xì)菌基因組提取試劑盒的操作步驟提取菌株的基因組DNA，提取的DNA使用NanoDrop2000檢測(cè)濃度(μg/ml)及純度(A260/A280)，使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。PCR擴(kuò)增及測(cè)序：以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，選用細(xì)菌通用引物(上游引物27F：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(25μl)：DNA模板0.5μl、上下游引物各0.5μl、PCR Master Mix 12.5μl、dd H2O補(bǔ)足25μl。反應(yīng)程序：94℃ 4min，94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取陽(yáng)性樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序所得序列提交Gen-Bank并進(jìn)行BLAST序列同源性比對(duì)，采用MEGA7.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)，比較生防菌株與其他近緣菌株的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離與篩選

以森林土為菌源，經(jīng)過(guò)多次富集培養(yǎng)和分離純化，初步篩選的得到24株菌，將篩選的菌株再接種到剛果紅培養(yǎng)基上，在剛果紅培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見圖2。11個(gè)菌株均產(chǎn)生大小不同的水解圈，篩選的11株菌對(duì)纖維素均具有一定降解能力，由表1可知，11株菌的D/d為1.91-6.28，其中GG-5-1、H36-7-4、AM-1-4的D/d分別為4.0、6.28、3.56，高于其它菌株，之后對(duì)這三個(gè)菌株做進(jìn)一步的濾紙條試驗(yàn)。

圖2 11株菌在剛果紅培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

表1 纖維素降解菌水解圈與濾紙崩解情況

2.2 濾紙條崩解試驗(yàn)研究

接種GG-5-1、H36-7-4、AM-1-4菌液的培養(yǎng)瓶中，菌株AM-1-4整體呈現(xiàn)為淡黃色渾濁液，濾紙表面蓬松粗糙，四角已被崩解且整體厚度較對(duì)照薄，濾紙崩解效果為+++；菌株H36-7-4渾濁度比AM-1-4低，整體呈乳白色，濾紙邊緣均變薄，濾紙崩解效果為+++。菌株GG-5-1的渾濁度是最高的，濾紙成邊緣薄小段，濾紙崩解效果為++++。表現(xiàn)出高崩解效果。

2.3 纖維素酶活性測(cè)定

選取濾紙條試驗(yàn)效果最好的GG-5-1為目的菌株，分別測(cè)定羧甲基纖維素酶、濾紙酶和外切-β-葡聚糖酶酶活。每隔24h測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定7d，分析產(chǎn)酶特點(diǎn)。由圖3可知，羧甲基纖維素酶活在第3d時(shí)達(dá)到最大值，為12.96U/ml，外切-β-葡聚糖酶在第3d時(shí)達(dá)到最大值，為12.96U/ml，濾紙酶在第2d時(shí)達(dá)到最大值，為9.00U/ml。

圖3 菌株GG-5-1纖維素酶酶活測(cè)定結(jié)果

2.4 GG-5-1菌株分子生物學(xué)鑒定

以GG-5-1菌株基因組為模板，擴(kuò)增獲得GG-5-1菌株的16S rDNA基因，序列長(zhǎng)度為1485bp。如圖4所示，基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，GG-5-1菌株與多株蕈狀芽胞桿菌(Bacillusmycoides)相似性最高，達(dá)到99%，并與蕈狀芽胞桿菌登錄號(hào)為KR233759.1、ON287188.1、MT586023.1、KR233754.1以及OL354433.1的為同一分支?；?6S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將GG-5-1鑒定為蕈狀芽胞桿菌(Bacillusmycoides)，命名為B.mycoidesGG-5-1。

圖4 基于16S rDNA基因序列以鄰接法構(gòu)建菌株GG-5-1及其相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

微生物降解法因其能夠提高作物秸稈利用效率、保護(hù)環(huán)境且耗能小、已被廣泛關(guān)注[16]。微生物降解纖維素主要分為3大類：細(xì)菌、真菌和放線菌[17]，其中纖維素降解細(xì)菌在生長(zhǎng)的過(guò)程中分泌大量胞外酶，促進(jìn)纖維素的降解。據(jù)報(bào)道，纖維素的降解主要是依賴于微生物產(chǎn)生的降解酶，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[18]等多種酶相互協(xié)同，可安全無(wú)毒害性的作用于纖維素分子的結(jié)晶區(qū)，徹底解成小分子寡糖和葡萄糖[19]。郜道玉[20]將從奶牛糞污異位發(fā)酵床高溫期物料中篩選到地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)a4和a8在搖瓶培養(yǎng)5d后，發(fā)現(xiàn)其羧甲基纖維素酶活力分別為168.92和114.98U/ml。黃穎婕等[21]從牛糞秸稈堆肥中分離獲得的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloiquefaciens)X7，10d內(nèi)完全崩解濾紙條，37℃培養(yǎng)3d，纖維素酶活為40.02U/ml。

芽孢桿菌屬是自然界分布極廣的一類細(xì)菌，因具有芽孢、耐堿、耐酸、耐高溫、適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于堆肥，其中蕈狀芽孢桿菌還具有嗜熱、兼性厭氧和降解有害物質(zhì)等特性[22]。本研究篩選得到的1株降解菌，25℃恒溫培養(yǎng)經(jīng)過(guò)多次純化后生長(zhǎng)較好，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶和降解纖維素能力，但有關(guān)蕈狀芽孢桿菌GG-5-1菌株高產(chǎn)酶活性的報(bào)道較少，具有較高的研究?jī)r(jià)值。關(guān)于菌株的生化特性、產(chǎn)酶條件及其在秸稈降解過(guò)程中降解纖維素與生產(chǎn)運(yùn)用的效果有待進(jìn)一步研究。

本研究從原始森林土中分離出11株纖維素降解菌，經(jīng)過(guò)剛果紅培養(yǎng)基和濾紙崩解試驗(yàn)篩選，得到1株纖維素降解能力較好的菌株GG-5-1，進(jìn)一步對(duì)這1株菌株的CMC酶活力進(jìn)行測(cè)定，其CMC酶、外切-β-葡聚糖酶和濾紙酶活力分別為12.96、12.96和9.00U/ml，經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)鑒定，初步確認(rèn)其為芽孢桿菌屬菌B.mycoides。