張婉，高斌，符偉國，史振宇

1. 復旦大學附屬華東醫(yī)院血管外科，上海 200040；2. 復旦大學附屬中山醫(yī)院血管外科，上海 200032

周圍動脈疾?。╬eripheral artery disease， PAD）是由于系統(tǒng)性動脈粥樣硬化斑塊的形成導致動脈狹窄、閉塞等病理改變，最終出現(xiàn)遠端組織供血不足，臨床上以下肢動脈疾病多見。 全球范圍內的PAD 患者超200 萬例，多見于老年人群［1］， 70歲以上人群患病率高達 15%～20%［2］。 當 PAD 患者出現(xiàn)足部靜息痛、壞疽或潰瘍（病程＞2 周）時，臨床上即可診斷為重度肢體缺血（critical limb ischemia， CLI）［3-5］。 CLI 是 PAD最危重的類型，這類患者多合并糖尿病或腎功能不全，膝下流出道條件非常差［6］，常失去血運重建機會，這類“無重建選擇”的CLI 患者往往面臨大截肢、心血管不良事件和死亡風險［3-5］。

治療性血管新生指的是將基因技術與細胞移植有機結合，促進血管新生，改善缺血區(qū)域血流灌注［7］。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是多能干細胞，具有可塑性強、自我更新快、快速形成克隆等特征。 MSCs 是目前常用的治療性血管新生種子細胞，為“無重建選擇”的CLI 患者帶來了保肢和生存的希望［7-13］。 但移植環(huán)境往往非常惡劣， MSCs 存活率低，嚴重影響移植效果。 研究證明， MSCs 內基因過表達可以增強種子細胞的生物學性能，繼而提高移植性能［14-17］。 前期研究［18］證實 FOS 樣抗原 1（FOS-like antigen 1，F(xiàn)OSL1）基因修飾的MSCs 增殖與遷移能力增強，因此本研究通過構建免疫缺陷小鼠動脈缺血模型，觀察FOSL1 修飾MSCs 體內移植對缺血肢體血管新生能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株前期研究凍存的MSCs 細胞株和FOSL1基因修飾的 MSCs 細胞株［18］。

1.2動物6 ～8 周齡 SPF 級雄性 NOD-SCID 免疫缺陷小鼠30 只，體質量（25 ±5）g，購自復旦大學實驗動物科學部。

1.3 試劑一抗／二抗兔抗大鼠CD34 抗體、一抗兔抗大鼠成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2， FGF2）抗體、一抗兔抗大鼠肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor， HGF）抗體、一抗兔抗大鼠血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）抗體、一抗兔抗大鼠血小板內皮細胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1， PECAM-1）／CD31抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號分別為BA0532、 A00121-2、 BA0911、 A0045、 BA2966）。 二抗羊抗兔IgG 抗體、二抗Cy3 羊抗兔IgG 抗體（美國Jackson 公司，貨號分別為 85216、 94600）。 辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標記抗兔／抗小鼠二抗（上海威奧生物科技有限公司，貨號WB0177、WB0176）。 BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海威奧生物科技有限公司，貨號WB0123）。

1.4 儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）、倒置相差顯微鏡（美國Olympus 公司）、熒光顯微鏡（美國Olympus 公司）、小型 Trans-Blot 轉印槽（美國Bio-Rad 公司）、組織勻漿器（北京鼎昊源科技有限公司）、超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物儀器有限公司）、冰凍／石蠟切片機（德國Leica 公司）和激光散斑襯比分析（laser speckle contrast analysis，LASCA）成像儀（瑞典Perimed 公司）等。

1.5方法

1.5.1 缺血模型建立 2% 戊巴比妥（50 mg／kg）腹腔麻醉，小鼠后肢外旋位，備皮和消毒右腹股溝區(qū)域。術前通過LASCA 分析測得小鼠雙側肢體血流灌注指數差值／雙側肢體血流灌注指數平均值＜5%。 縱行切開腹股溝韌帶，逐層切開皮膚和皮下組織。 暴露股動脈鞘，完整游離股動脈（長約1 cm），在其兩端結扎后切除。 肉眼直視下確認血流消失，局部注射青霉素預防感染。 術后2 h， LASCA 測得造模側肢體血流灌注指數＜健側肢體血流灌注指數的25%即為造模成功。

1.5.2 細胞培養(yǎng) 復蘇 MSCs 細胞和FOSL1 基因修飾的 MSCs 細胞［18］，傳代至 24 孔培養(yǎng)板中。 更換轉染液后于37 ℃培養(yǎng)箱孵育， 24 h 后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。 0.1 μg／mL 嘌呤霉素培養(yǎng)液培養(yǎng) 1周，細胞擴增、傳代至P3 代進行實驗。

1.5.3 體內移植與分組 重懸上述2 種細胞至密度為1 ×106／mL，造模后 3 h 向小鼠造模側肢體小腿腓腸肌注射1 mL 細胞混懸液或PBS， 5 個注射點，每2點間隔0.1 cm，每個注射點 0.2 mL。 實驗分為 PBS組（n＝ 10）、 MSCs 組（n＝ 10）與 FOSL1 組（n＝ 10）。轉染綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）標記移植細胞。

1.6 免疫熒光染色體內移植后第2 天，取小鼠造模側肢體腓腸肌組織，制成切片厚度10 μm 的冰凍切片。 甲醛固定 5 min 后， PBS 清洗 3 次。 山羊血清封閉液封閉 30～60 min，棄封閉液。 CD34（1∶100）一抗4 ℃過夜， IgG（1∶500）二抗 37 ℃避光 2 h。 DAPI 復染， PBS 清洗3 次，于熒光顯微鏡下觀察染色結果并拍照。

1.7 免疫組化染色體內移植后第14 天，取小鼠造模側肢體腓腸肌組織，制石蠟切片。 3%雙氧水室溫孵育5 ～10 min，蒸餾水和PBS 清洗，山羊血清封閉，室溫下孵育10 min。 PECAM-1（1∶200）一抗 4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗3 次。 IgG（1∶500）二抗37 ℃孵育30 min， PBS沖洗3 次。 HRP 標記鏈霉卵白素， 37 ℃孵育 30 min，PBS 沖洗3 次。 DAB 顯色，沖洗后復染，顯微鏡下記錄平均每肌纖維周圍的微血管數，即微血管與肌纖維（capillary／muscular fiber， C／MF）比值。

1.8 Western blot體內移植后第14 天，取小鼠造模側肢體缺血腓腸肌組織100 mg，獲取VEGF、 FGF2 和HGF 蛋白提取液， BCA 法測蛋白濃度。 制備上樣緩沖液，恒壓電泳30 min 后轉膜，5%BSA 室溫封閉2 h。VEGF（1∶1 000）、 FGF2（1∶400）和 HGF（1∶400）一抗4 ℃冰箱過夜， HRP（1∶2 000）二抗室溫孵育 2 h，化學發(fā)光檢測試劑作用2 min 后顯影。

1.9 血流灌注指數分別于體內移植后第1、 7、 14天，通過LASCA 評估后肢血流灌注指數，重復3 次取平均值。 灌注指數＝（造模側肢體血流／健側肢體血流） ×100%。

1.10 統(tǒng)計分析采用SPSS16.0 軟件對數據進行分析。 符合正態(tài)分布的計量資料采用均數 ± 標準差（）表示，3 組間的兩兩組間比較通過重復測量的方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 模型構建與缺血癥狀觀察通過完全結扎小鼠右側股動脈構建小鼠缺血模型，肉眼即刻觀察到造模側肢體無血流灌注。 LASCA 分析造模前肢體血流豐富，2 h 后造模側肢體幾乎觀察不到血流灌注，肢體顏色呈深藍黑色，確定造模成功。 術后短期小鼠精神淡漠，肢體蜷縮，納差。 造模側肢體冰冷，嚴重者趾甲發(fā)黑、壞疽或自體截肢。 體內移植后第7 天，小鼠后肢冰冷與趾甲發(fā)黑逐漸改善，但前肢受力，活動緩慢且謹慎。 體內移植后第14 天，小鼠進食增加，趾甲發(fā)黑好轉，四肢肌力增加，但仍存在活動不協(xié)調。 見圖1。

圖1 模型構建與缺血癥狀觀察

2.2 體內移植后MSCs 的分化情況體內移植后第2 天，熒光顯微鏡下觀察到GFP 陽性細胞分散于腓腸肌組織周圍或融合在肌間隙血管周圍。 FOSL1 組與MSCs 組可見少量GFP 與CD34 雙陽性細胞。 見圖2。

圖2 免疫熒光實驗結果（ ×20）

2.3 缺血肢體C／MF 比值體內移植后第14 天，與PBS 組（0.47 ±0.10）比較， MSCs 組（1.40 ±0.20）和FOSL1 組（1.95 ± 0.28）C／MF 比值均升高（均P＜0.05）；與 MSCs 組比較， FOSL1 組 C／MF 比值升高（P＜0.05）。 見圖 3。

圖3 免疫組化實驗結果（ ×200， n ＝5）

2.4 MSCs 的促血管新生能力體內移植后第14天，與 PBS 組比較， MSCs 組的 FGF2、HGF 和 VEGF表達水平升高（P＜ 0.05）， FOSL1 組的 FGF2、 HGF和 VEGF 表達水平升高（P＜0.05）；與 MSCs 組比較，F(xiàn)OSL1 組的 FGF2、 HGF 和 VEGF 表達水平升高（P＜0.05）。 見圖 4。

圖4 Western blot 實驗結果（n ＝3）

2.5 3 組血流灌注指數比較體內移植后第1 天， 3組造模側肢體均無明顯血流。 體內移植后第7 天，MSCs 組與FOSL1 組可見少量動脈血流灌注，血流恢復程度均優(yōu)于 PBS 組（P＜0.05）。 體內移植后第 14 天，F(xiàn)OSL1 組血流恢復程度優(yōu)于 MSCs 組（P＜ 0.05）；PBS 組血流灌注雖較體內移植前有所緩解，但血流恢復不及其余2 組。 見表1。

表1 3 組血流灌注指數比較（%）

3 討論

目前，干細胞移植存在的困境是MSCs 體內移植環(huán)境惡劣，嚴重降低了移植療效［19］。 Li 等［14］發(fā)現(xiàn)，在缺氧狀態(tài)下MSCs 過表達Bcl-2基因后抗凋亡與旁分泌能力提高，進一步移植于大鼠心肌梗死模型的缺血組織后，能促進梗死區(qū)域的毛細血管密度與梗死面積恢復。 本次研究構建免疫缺陷小鼠肢體缺血模型，在缺血肌肉組織直接注射MSCs，并通過免疫組化和體內實驗觀察移植效果。

MSCs 體內移植后促進血管新生的機制，主要包括直接分化為內皮細胞和旁分泌VEGF、 FGF2 等促血管生成細胞因子，間接促進內皮細胞的生成［20-22］。 過表達HIF-α基因促進MSCs 細胞分泌細胞因子VEGF，能增強內皮細胞的成管功能與遷移功能［23］。 此次研究通過免疫熒光染色明確MSCs 是否在體內分化為內皮細胞。移植前，通過基因轉染技術對移植細胞轉染GFP，以便進行細胞體內追蹤。 CD34 是一種內皮標志物，熒光鏡下證實少部分移植細胞出現(xiàn)雙陽性（GFP 與CD34）表現(xiàn)， MSCs 在缺血組織存活并向缺血區(qū)域分散，且有少部分MSCs 向血管內皮細胞分化，參與血管新生。 進一步通過蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，促血管生成因子在FOSL1 組與 MSCs 組的表達均高于 PBS 組，提示FOSL1 修飾的MSCs 分泌細胞因子的能力更強。

MSCs 移植后通過觀察缺血癥狀、檢測C／MF 比值和LASCA 技術來評估側支循環(huán)是否有效建立。 移植后14 d 內，肉眼觀察小鼠缺血癥狀存在一定程度緩解。 但該方法較為主觀，進一步使用LASCA 技術客觀判斷［24］缺血肢體血流灌注情況。 移植后第7 天， FOSL1 組與MSCs 組的血流灌注指數差異不明顯。 移植后第14 天，F(xiàn)OSL1 組的血流灌注指數優(yōu)于MSCs 組。 這些改變與大體觀察到的缺血癥狀改善趨勢基本一致。 移植后第14 天，通過免疫組化實驗觀察微血管密度，結果顯示FOSL1 組 C／MF 比值高于 MSCs 組。 提示移植FOSL1基因修飾的MSCs 有著更強的促血管新生能力。

本研究仍存在一定的缺陷：（1）FOSL1 基因與MSCs 的研究少見，此次實驗結果初步證實了FOSL1促進MSCs 的旁分泌功能，但體內分子機制仍待進一步探究； （2）MSCs 本身存在致癌風險［25］，后續(xù)研究應更重視MSCs 的移植安全性，深入探討分子機制。

綜上所述，與單純MSCs 移植相比，F(xiàn)OSL1 基因轉染的MSCs 具備更強的旁分泌功能，能更有效地改善缺血肢體的血流灌注，促進血管新生。