唐躍東，謝啟亮，汪蘭曌，楊斐宇，張峰，周小勇，申捷

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院急危重病中心，上海 201508； 2. 上海市衛(wèi)生健康委員會(huì)化學(xué)傷害急危重病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201508；3. 復(fù)旦大學(xué)化學(xué)傷害與急危重病研究中心，上海 201508

心臟驟停（cardiac arrest， CA）是較為常見的危及生命的臨床急癥，也是一項(xiàng)重要的全球公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。 盡管近年來心肺復(fù)蘇技術(shù)逐步普及發(fā)展， CA 患者總體出院存活率仍然較低。 2020年美國(guó)院外心臟驟停（out-of-hospital cardiac arrest， OHCA）患者出院存活率僅為 10.4%［1］，而我國(guó)每年近55 萬例的 CA 患者的出院存活率更是不足1%［2］。 造成這一現(xiàn)狀的根本原因是CA 后延遲復(fù)蘇所導(dǎo)致的頑固性的神經(jīng)功能障礙。 這種復(fù)蘇后腦血流快速恢復(fù)，但神經(jīng)功能障礙不能恢復(fù)，甚至惡化的現(xiàn)象被稱為全腦缺血再灌注損傷 （global cerebral ischemia／reperfusion injury， GCI／RI）。 同時(shí)，高齡CA 患者比例也逐年增加，而年齡本身可能會(huì)增加老年CA 患者的死亡率［3］。

CA 后的腦水腫通常被認(rèn)為是神經(jīng)功能惡化的前兆，同時(shí)也是其早期干預(yù)治療重要的參考靶點(diǎn)［4］。 自主循環(huán)恢復(fù)后早期的腦水腫可能反映了大腦的自我調(diào)節(jié)能力喪失以及血腦屏障完整性廣泛破壞。 這種水腫常表現(xiàn)為一系列需要及早干預(yù)的臨床癥候，如顱內(nèi)壓升高、腦缺血、癲癇發(fā)作和彌漫性去極化所致的昏迷［5］。 其臨床轉(zhuǎn)歸多為輕重程度不等的可逆性腦損傷甚至是不可逆轉(zhuǎn)的腦死亡。 然而，迄今為止卻缺乏有效的針對(duì)性治療藥物。 人血白蛋白（human serum albumin， HSA）是一種公認(rèn)的神經(jīng)保護(hù)劑，可以減少局灶缺血大鼠腦梗死灶面積，同時(shí)能夠減輕腦水腫，從而改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能。 在局灶腦缺血模型中， HSA 的這種保護(hù)性一般認(rèn)為與其降低血腦屏障（blood-brain barrier， BBB）通透性有關(guān)，但近來也有研究認(rèn)為白蛋白會(huì)增加BBB 通透性而加重腦水腫［6-7］。 此外，年齡因素對(duì) BBB 的通透性也存在著獨(dú)立的影響。 在老年大鼠的全腦缺血再灌注損傷模型中， HSA 是否存在這種保護(hù)作用及對(duì)BBB 的作用尚未見報(bào)道。 而近年研究表明， G 蛋白偶聯(lián)受體 124（G-protein-coupled receptor 124， GPR124）是腦缺血時(shí)維持血腦屏障完整性的關(guān)鍵分子［8-9］。 因此，通過對(duì)HSA 如何緩解老年大鼠全腦缺血再灌注引起的腦損傷及其對(duì)GPR124 表達(dá)影響的研究，從而為臨床上老年CA 患者開展相關(guān)治療研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20 周齡清潔級(jí)健康成年雄性Wistar 大鼠108 只，體質(zhì)量260～300 g，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SLAC）。 大鼠飼養(yǎng)條件及手術(shù)操作嚴(yán)格遵守復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.1. 2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 熒光定量 PCR 儀（美國(guó)Roche 公司）；熒光酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技）；激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）；熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（賽默飛世爾科技）。

1.1.3 主要試劑 伊文思藍(lán)（生工生物工程股份有限公司）； Anti-GPCR GPR124 抗體（美國(guó) Abcam 公司）； Trizol （Ambion 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）。

1.2方法

1.2.1 大鼠全腦缺血再灌注模型的制作 參考本實(shí)驗(yàn)室方法及采用改良的Pulsinelli 四血管阻斷法（4-VO）構(gòu)建大鼠的全腦缺血再灌注 （GCI／RI） 模型［10］。 模型構(gòu)建成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：大鼠意識(shí)喪失；角膜反射消失、雙瞳孔散大固定；四肢上舉，翻正反射消失；剔除癲癇樣發(fā)作的大鼠。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 （1）動(dòng)物分組：取 Wistar 大鼠共計(jì)108 只按照隨機(jī)數(shù)字表法分成3 組（36 只／組）：1）假手術(shù)組（Sham 組）；2）全腦缺血／再灌注模型組（GCI／R 組）；3）HSA 治療組（GCI／R ＋ HSA 組）。其中Sham 組：完成切口，分離但不結(jié)扎和凝閉血管。實(shí)驗(yàn)組又分為缺血15 min 再灌注6、 24、 48 h 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組（每亞組各6 只）。 （2）各組給藥方法：假手術(shù)組（Sham 組）：只做手術(shù)，不行缺血再灌注也不給予人血白蛋白治療。 全腦缺血再灌注模型組（GCI／R組）：缺血再灌注后2 h 后，立即由頸外靜脈注射生理鹽水（normal saline）（0.9% NaCl， 5 mL／kg）； HSA 治療組（GCI／R ＋ HSA 組）：再灌注2 h 后，立即經(jīng)頸外靜脈注入人血白蛋白（Grifols Biologicals， Los Angeles，USA； 25% solution； 2.5 g／kg）。

1.2.3 伊文思藍(lán)染色法定性評(píng)價(jià)大鼠血腦屏障通透性 取腦組織前2 h 尾靜脈注射伊文思藍(lán)（evans blue，EB），每100 g 體質(zhì)量大鼠注射 2% EB 溶液 0.4 mL。經(jīng)血液循環(huán)1 h 后可見大鼠的口周、眼角、肢體和睪丸等淺表皮膚呈現(xiàn)藍(lán)色。 將大鼠斷頭取腦后，進(jìn)行大體觀察。 經(jīng)藍(lán)色激發(fā)光照射后， EB 在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，根據(jù)這些斑點(diǎn)的大小和數(shù)目，可定性反映 BBB 的通透性。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR （qRT-PCR）檢測(cè)GPR124 mRNA 的表達(dá) 取各組大鼠海馬組織，參照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA。 每個(gè)樣本取1 μg RNA 作為逆轉(zhuǎn)錄模板合成cDNA。 所用引物（表1）。 PCR 反應(yīng)條件： 95 ℃ 2 min； 95 ℃ 20 s、 60 ℃ 30 s、 72 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)；產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線單峰驗(yàn)證，記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定值時(shí)所需的循環(huán)數(shù)（Ct值）， △△Ct ＝ （Ct 目的基因-Ct β-actin）治療組 - （Ct目的基因-Ctβ-actin）對(duì)照組，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct 法分析，計(jì)算目的基因與內(nèi)參β-actin 比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息

1.2.5 免疫印跡法（WB）檢測(cè)海馬區(qū) GPR124 蛋白表達(dá) 取出海馬組織后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?RIPA 裂解液提取各組樣本總蛋白，用BSA 法測(cè)定總蛋白濃度，將各組蛋白終濃度調(diào)整一致。 采用SDS-PAGE 垂直板全濕法電泳，制備分離膠和濃縮膠，上樣，電泳，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，將膜放入含5%脫脂牛奶的TBST 封閉緩沖液中封閉2 h 后加入稀釋的一抗（GPR124 單克隆抗體 1∶1 000）。 一抗 4 ℃搖床孵育過夜，室溫下復(fù)溫2 h，充分洗膜后加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，洗膜后發(fā)光液化學(xué)發(fā)光，曝光顯色。

1.2.6 免疫熒光法（IF）檢測(cè)海馬區(qū) GPR124 蛋白表達(dá) 將大鼠海馬冰凍組織切片用4 ℃的丙酮溶液固定大約10 min。 其后進(jìn)行如下操作：用組化筆在玻片上圈起組織；用PBS 浸潤(rùn)組織；4%多聚甲醛處理（室溫）10 min；PBS 漂洗， 5 min × 3 遍； 0.5% Txiton X-100處理（室溫） 5 min； TBST 漂洗， 5 min × 3 遍；封閉（室溫） 1 h；孵育 GPR124 一抗（用 0.1%BSA／TBST配） 4 ℃ 孵育過夜；0.1% BSA／TBST 漂洗，5 min ×3遍；孵育熒光二抗（用含 0.1 BSA 的 TBST 配）RT 孵育1 ～2 h； 0.1% BSA／TBST 漂洗， 5 min ×3 遍； DAPI， 5 min； PBS 漂洗， 5 min × 3 遍；用封片劑進(jìn)行封片，因熒光不斷淬滅，應(yīng)盡早在熒光顯微鏡下拍照；ImageJ 用于量化核和／或細(xì)胞質(zhì)熒光信號(hào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 6 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖及數(shù)據(jù)分析。 所有數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ±SD）描述，正態(tài)分布且方差齊性的多組計(jì)量資料用One-way-ANOVA（單因素方差分析），組間比較采用SNK 分析，方差不齊者采用 Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 伊文思藍(lán)（EB）評(píng)價(jià)血腦屏障結(jié)果大體觀察可見假手術(shù)組（Sham 組）大鼠腦大體標(biāo)本呈棕白色，全腦缺血再灌注模型組（GCI／R 組）大鼠腦大體標(biāo)本呈藍(lán)色，人血白蛋白組（GCI／R ＋ HSA 組）與 GCI／R組比較腦組織藍(lán)色程度明顯減輕。 見圖1。

圖1 全腦缺血-再灌注后各組大鼠EB 染色后腦部直視圖

由于EB 不能透過正常的BBB，因此在熒光顯微鏡下， Sham 組的大鼠腦組織中幾乎沒有紅斑；而在GCI／R 組的大鼠腦組織中在鏡下可以觀察到紅斑明顯增多，提示 EB 大量滲漏；在 GCI／R ＋ HSA 組的鏡下紅斑較GCI／R 組明顯減少，但仍明顯多于 Sham 組（圖 2）。 同時(shí)，免疫熒光也顯示， GCI／R 組再灌注 6 h 后， EB 外滲明顯增加，24、48 h 滲漏進(jìn)一步增多，而 GCI／R ＋HSA組， EB 滲漏24 h 達(dá)高峰，48 h 時(shí)較前明顯減少。

圖2 全腦缺血-再灌注后各組大鼠EB 染色熒光拍照?qǐng)D

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果隨著缺血損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，GPR124 mRNA 在 GCI／R 組和 GCI／R ＋ HSA組均呈現(xiàn)逐步上調(diào)的趨勢(shì)。 在再灌注后6 h，大鼠海馬區(qū)組織GPR124 mRNA 的表達(dá)上調(diào)，其后的缺血再灌后24、48 h 2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)GPR124 mRNA 的表達(dá)隨時(shí)間進(jìn)一步上調(diào)，而應(yīng)用人血白蛋白后各時(shí)間點(diǎn)的GPR124 mRNA 表達(dá)較 GCI／R 組進(jìn)一步上調(diào)。 在缺血再灌注后第24 h，與Sham 組相比較，GCI／R 組的海馬區(qū)GPR124 （Sham： 1.05 ± 0.13， GCI／R： 2.04 ± 0.25，P＜0.01）的 mRNA 表達(dá)上調(diào)；與 GCI／R 組相比較，GCI／R ＋ HSA 組的海馬區(qū)GPR124 （GCI／R： 2.04 ±0.25， GCI／R ＋ HSA： 2.66 ± 0.42，P＜ 0.05）的 mRNA 表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)（圖 3：A-C）。

圖3 qRT-PCR 檢測(cè)GPR124 mRNA 的表達(dá)

2.3免疫印跡法（WB）結(jié)果WB 結(jié)果顯示，各組GPR124 蛋白表達(dá)的時(shí)間變化趨勢(shì)與GPR124 mRNA結(jié)果趨于一致。 再灌注后 6 h，大鼠海馬區(qū)組織GPR124 蛋白的表達(dá)增加，其后的缺血再灌后24、 48 h 2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)GPR124 蛋白的表達(dá)隨時(shí)間進(jìn)一步增加。此外， GCI／R ＋HSA 組的大鼠海馬組織 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的GPR124 蛋白表達(dá)均較 GCI／R 組表達(dá)相應(yīng)增加（圖4A）。 在全腦缺血再灌注后第24 h，與Sham 組相比， GCI／R 組的海馬組織 GPR124 蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；與 GCI／R 組相比， GCI／R ＋ HSA 組的海馬組織 GPR124 蛋白表達(dá)明顯增加（P＜ 0.01），灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4B。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)（6、24、48 h）大鼠海馬組織中GPR124 蛋白表達(dá)

2.4 免疫熒光法（IF）結(jié)果IF 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了各組大鼠GPR124 蛋白表達(dá)的時(shí)間變化趨勢(shì)。 此外，在再灌注后第 24 h，與 Sham 組比較， GCI／R 組大鼠GPR124 的平均熒光強(qiáng)度顯著增加（P＜0.01），提示缺血再灌注后GPR124 在海馬CA1 區(qū)GPR124 蛋白表達(dá)增加，與 GCI／R 組比較， GCI／R ＋ HSA 組 GPR124 平均熒光強(qiáng)度進(jìn)一步顯著增加（P＜0. 05），提示應(yīng)用HSA 可促進(jìn)GPR124 蛋白表達(dá)的增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 見圖 5～7。

圖5 免疫熒光檢測(cè) CA1 區(qū) GPR124 蛋白的表達(dá)（6 h）（Bar ＝20 μm， ×400 倍）

圖6 免疫熒光檢測(cè) CA1 區(qū) GPR124 蛋白的表達(dá)（24 h）（Bar ＝20 μm， ×400 倍）

圖7 免疫熒光檢測(cè) CA1 區(qū) GPR124 蛋白的表達(dá)（48 h）（Bar ＝20 μm， ×400 倍）

3 討論

本研究通過改良的Pulsinelli 四血管阻斷法構(gòu)建了老年大鼠GCI／RI 模型，模擬了CA 后全腦缺血的臨床場(chǎng)景，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用大劑量（2.5 g／kg）人血白蛋白（HSA）加以干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人血HSA 可以改善老年大鼠GCI／RI 模型的血腦屏障（BBB）的通透性并影響B(tài)BB 相關(guān)蛋白GPR124 的表達(dá)。

BBB 是指血液循環(huán)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間形成的一種機(jī)械和功能屏障，它發(fā)揮著維持腦血管穩(wěn)態(tài)作用。 BBB 的破壞或功能障礙與包括缺血性卒中在內(nèi)的多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。年齡等衰老相關(guān)因素可以促進(jìn)或加重BBB 的破壞和功能障礙。 腦脊液／血漿白蛋白比值增加和腦成像研究表明，正常人類衰老過程中， BBB 破裂較為常見［11］。 BBB 損害是腦缺血再灌注損傷后腦水腫的核心病因，因而控制BBB 功能的內(nèi)皮受體蛋白對(duì)老年CA 患者的神經(jīng)保護(hù)顯得猶為重要。 而控制BBB 功能的內(nèi)皮受體蛋白并不唯一并且功能較為復(fù)雜。 本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，全腦缺血再灌注大鼠的海馬區(qū)，與BBB 結(jié)構(gòu)相關(guān)的Caveolin-1 蛋白的表達(dá)下調(diào)［12］。

HSA 是近年發(fā)現(xiàn)的能對(duì)抗多種腦缺血再灌注損傷機(jī)制的神經(jīng)保護(hù)劑，對(duì)局灶性腦缺血、外傷性腦缺血等均有明顯治療作用。 HSA 能夠維持BBB 的穩(wěn)定性， 改善腦水腫， 減少腦梗死體積； 另還能有效地清除腦創(chuàng)傷后形成的腦水腫，抑制內(nèi)源性過氧化物酶；通過與血液中游離脂肪酸結(jié)合，阻斷病理性脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；擴(kuò)張血管容量，減少紅細(xì)胞聚集，降低血液黏度等作用［13］。 此外也有研究發(fā)現(xiàn)HSA 具有明顯的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并且促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)缺血部位血管新生等作用［14］。 臨床應(yīng)用中，大劑量HSA 治療缺血性腦卒中患者，可減輕腦水腫，預(yù)防延遲的局部缺血損傷，最終改善患者的長(zhǎng)期預(yù)后。 HSA 的腦保護(hù)作用存在著明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)優(yōu)勢(shì)。 Belayev 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，即使是延遲至缺血后 4 h 再應(yīng)用中等劑量的 HSA（1.25 g／kg）治療，也可以明顯減小局腦缺血模型的腦梗死灶的體積，減輕腦組織水腫的嚴(yán)重程度，并最終改善神經(jīng)功能的評(píng)分［15］。 HSA 對(duì) BBB 的作用仍存在一定的爭(zhēng)議。 有研究報(bào)道，新生小鼠腦出血后給予HSA 治療，可減少血腦屏障的滲透性，維持 BBB 的穩(wěn)定等作用［16］。 局腦缺血模型研究表明，應(yīng)用rt-PA 和HSA 聯(lián)合治療時(shí)可以能顯著降低rt-PA 治療產(chǎn)生的缺血再灌注損傷，其作用與 HSA 降低 BBB 通透性有關(guān)［17］。 而另外一些研究卻認(rèn)為， HSA 通過增加BBB 通透性來加重局腦缺血模型大鼠的腦水腫［18］。 而 HSA 對(duì)老年大鼠的GCI／R 后的BBB 通透性的作用及可能機(jī)制，較少有研究涉及。 本研究表明，在老年大鼠的GCI／RI 模型中，再灌注后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB 通透性均增加，而HSA 的應(yīng)用可以阻斷這種增加趨勢(shì)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

HSA 誘導(dǎo)腦組織中GPR124 的表達(dá)增加可能是其引起全腦缺血再灌注大鼠BBB 通透性降低的原因之一。 G 蛋白偶聯(lián)受體124（GPR124）是一種膜表面受體，血管生成過程中在胚胎內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)在腦內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成周細(xì)胞中也有特異性表達(dá)［19］。 體內(nèi)研究表明， GPR124 缺陷小鼠在胚胎15.5 d 內(nèi)因前腦和脊髓血管發(fā)育缺陷死亡，因而GPR124 在正常胚胎小鼠的前腦血管生成和維持BBB 功能中發(fā)揮著不可或缺的作用［20］。 在正常成年小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中，條件敲除GPR124 并不影響B(tài)BB 的穩(wěn)態(tài)完整性，但在缺血性卒中小鼠模型中，可導(dǎo)致BBB 破壞、微血管出血和腦水腫［9］。 GPR124 具有顯著的功能趨向性，可能是腦缺血再灌注損傷過程中BBB 完整性的必要因素之一，因此可作為GCI／RI 所致BBB 相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)。本研究表明在老年大鼠GCI／RI 后， BBB 結(jié)構(gòu)和功能破壞，同時(shí)伴隨著 GPR124 蛋白的表達(dá)增加，推測(cè)GCI／RI 早期 GPR124 表達(dá)可能是 BBB 的保護(hù)因素。給予 HSA 治療后，與模型組（GCI／R 組）相比較，其表達(dá)進(jìn)一步增加，推測(cè) GCI／RI 后應(yīng)用 HSA 能增加GPR124 蛋白的表達(dá)可能參與了對(duì)抗GCI／RI 的病理生理過程，亦即 HSA 治療能有效地促進(jìn)GPR124 蛋白表達(dá)增加而發(fā)揮BBB 保護(hù)作用。

本研究存在一定的局限性。例如僅應(yīng)用了EB 熒光法來定性評(píng)估血腦屏障的通透性。 此外，有關(guān)HSA對(duì)全腦缺血再灌注后的BBB 的保護(hù)作用的未進(jìn)行劑量效應(yīng)關(guān)系的實(shí)驗(yàn)。 這些不足有待在今后的研究中進(jìn)一步完善。

綜上所述， HSA 在老年大鼠全腦缺血再灌注損傷（GCI／RI）早期應(yīng)用具有改善 BBB 通透性的作用，其作用可能與誘導(dǎo)腦組織中GPR124 的表達(dá)增加有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。