萬(wàn)文斌，桑紹明，鐘春玖

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200127；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200032

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease， AD）是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system， CNS）退行性疾病，也是癡呆的最常見(jiàn)類(lèi)型，其主要臨床表現(xiàn)有以記憶減退為主要表現(xiàn)的進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙及其他神經(jīng)精神癥狀［1］，病理上以腦內(nèi) β-淀粉樣蛋白（β-amyloid， Aβ）沉積形成老年斑（senile plaque， SP）、過(guò)度磷酸化Tau （hyperphosphorylated Tau）蛋白聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles， NFT）及神經(jīng)突觸損傷、神經(jīng)元丟失為特征性改變［1］。

越來(lái)越多的基礎(chǔ)及臨床研究顯示，硫胺素代謝障礙與AD 發(fā)病關(guān)系密切［2-3］，但硫胺素代謝障礙對(duì)Tau病理形成的影響尚不清楚。 因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建硫胺素缺乏（thiamine deficiency， TD）小鼠模型，分析其腦內(nèi)Tau 蛋白病理改變特征。 從而為硫胺素代謝障礙致AD 相關(guān)病理產(chǎn)物的形成提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3月齡 SPF 級(jí) C57／BL6 小鼠由中國(guó)科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，自然照明，自由進(jìn)食和飲水。 本實(shí)驗(yàn)由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.2 主要設(shè)備與試劑硫胺素缺乏小鼠顆粒飼料及對(duì)照飼料（中國(guó)Trophic 公司訂制）、吡啶硫胺素（美國(guó)Sigma）、 Tau5 抗體（英國(guó) Abcam）、 AT8 抗體（美國(guó)Pierce）、磷酸化 Tau S396 （p-Tau S396）抗體（德國(guó)CST）、磷酸化 Tau T181 （p-Tau T181）抗體（德國(guó)CST）、 IRDye? 680LT／800CW 二抗（美國(guó) Li-Cor）、蛋白酶抑制劑（瑞士 Roche）、 BSA（美國(guó) Amresco）、橫冷冰凍切片機(jī)（德國(guó)徠卡CM1950）。 垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad）、 Odyssey 雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國(guó) Li-Cor）、 HPLC（美國(guó) Agilent）、超純水凈化儀（美國(guó) Millipore）、電子天平（美國(guó) Mettler Toledo）。

1.3 動(dòng)物分組及硫胺素缺乏小鼠模型構(gòu)建將小鼠隨機(jī)分為2 組（正常對(duì)照組和硫胺素缺乏組），硫胺素缺乏組予硫胺素缺乏顆粒飼料聯(lián)合吡啶硫胺素（劑量500 μg／kg·d）腹腔注射，正常對(duì)照組予正常飲食聯(lián)合等體積生理鹽水腹腔注射。

1.4 標(biāo)本采集與制備小鼠處理10 d 后取腦，分離海馬組織和稱定質(zhì)量記錄，在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗1 次放入液氮中，再放入-80 ℃冰箱中保存。 用于高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)硫胺素含量的標(biāo)本經(jīng)KH2PO4處理后用研磨機(jī)震蕩預(yù)處理后凍存，用于Western Blot 檢測(cè)的標(biāo)本加入含蛋白酶抑制劑的裂解液經(jīng)研磨震蕩、裂解提取組織蛋白，測(cè)定濃度后凍存。 用于免疫熒光染色的小鼠經(jīng)冰生理水心臟灌流后予以4% PFA 固定后按程序性脫水處理，橫冷切片機(jī)切片后置于凍存液中保存。

1.5 HPLC 檢測(cè)參照高效液相色譜法《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0631，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-磷酸氫二鉀水溶液（25 mmol／L， pH值7.0）為流動(dòng)相，梯度洗脫（參數(shù)如表1 所示），熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)為375 nm，吸收波長(zhǎng)為435 nm。

表1 HPLC 檢測(cè)參數(shù)

1.6 Western Blot 蛋白檢測(cè)蛋白樣品加入上樣緩沖液后進(jìn)行上樣電泳，積層膠電壓60 V，分離膠電壓100 V，轉(zhuǎn)膜采用電壓70 V 持續(xù)120 min，5%BSA 封閉后一抗孵育在4 ℃過(guò)夜，復(fù)溫后IRDye?680LT／800CW二抗孵育用Odyssey 近紅外成像系統(tǒng)掃膜。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用經(jīng)SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理進(jìn)行分析。 計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn)后，正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料據(jù)均用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示， 2 組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硫胺素缺乏小鼠腦內(nèi)硫胺素代謝產(chǎn)物含量降低體內(nèi)硫胺素主要包括游離硫胺素（free thiamine，fT）、一磷酸硫胺素（thiamine monophosphate， TMP）及二磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate， TDP）3 種衍生物，其中TDP 是硫胺素的主要儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)形式，也是執(zhí)行硫胺素參與線粒體能量代謝的主要成分。 為此，采用HPLC 對(duì)硫胺素缺乏小鼠腦組織中硫胺素的3 種成分進(jìn)行測(cè)定。

與對(duì)照組比較，硫胺素缺乏小鼠全血TDP、 TMP及fT 水平均降低，定量分析顯示與對(duì)照小鼠比較分別減少82%、 80%及63%（P＜0.01）。 對(duì)腦組織的分析也觀察到一致的結(jié)果。 硫胺素缺乏小鼠大腦皮層TDP、 TMP 及fT 水平與對(duì)照小鼠比較分別降低86%、97%及94% （P＜0.01）；硫胺素缺乏小鼠海馬組織TDP、 TMP 及fT 水平與對(duì)照小鼠比較分別降低79%、95%及 96%（P＜0.01）。 見(jiàn)圖 1。

圖1 硫胺素缺乏小鼠腦內(nèi)硫胺素代謝產(chǎn)物水平測(cè)定

2.2 硫胺素缺乏促進(jìn)Tau 蛋白磷酸化Tau 蛋白是神經(jīng)元中含量豐富的微管相關(guān)蛋白，其功能在于促進(jìn)微管組裝及維持微管的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。 在AD 中， Tau 蛋白過(guò)度磷酸化是重要的特征性病理改變，其在認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4］。 既往前期已發(fā)表研究提示，硫胺素與Tau 蛋白病理形成關(guān)系密切［2］。

蛋白印跡檢測(cè)顯示硫胺素缺乏小鼠皮層及海馬中S202 和 T205 雙位點(diǎn)磷酸化 Tau（p-Tau S202，T205， AT8） 水平分別增加了 2 倍與 1. 2 倍 （P＜0.01）。 對(duì)經(jīng)典 Tau 蛋白磷酸化位點(diǎn) T181、S396 進(jìn)行了檢測(cè)顯示，在硫胺素缺乏小鼠皮層， pT181 及pS396蛋白水平分別增加了 1.3 倍及 2 倍（P＜ 0.01），在硫胺素缺乏小鼠海馬， pT181 及pS396 蛋白水平分別增加了 1 倍及 0.3 倍（P＜0.01）。 見(jiàn)圖 2。

圖2 硫胺素缺乏小鼠腦內(nèi)過(guò)度磷酸Tau 蛋白水平增加

2.3 硫胺素缺乏引起Tau 蛋白異常聚集從蛋白印跡條帶分布可以看出，硫胺素缺乏小鼠存在Tau 蛋白出現(xiàn)條帶遷移（mobility shift），即膜上免疫印跡結(jié)果顯示硫胺素缺乏小鼠腦組織Tau 蛋白條帶向分子量大的位置遷移。 與對(duì)照組比較，硫胺素缺乏組Tau 蛋白分子量顯著增加。 蛋白條帶遷移意味著蛋白空間構(gòu)象改變及翻譯后與其他蛋白耦合等可能。 然而由于含0.1% SDS、1% Triton X-100 的強(qiáng)效裂解液對(duì)總蛋白進(jìn)行提取，在SDS 和Triton X-100 的作用下可破壞蛋白間相互作用，從而將翻譯后的蛋白耦合成分去除，推測(cè)可能存在Tau 蛋白異常聚集導(dǎo)致的蛋白條帶遷移。既往已有文獻(xiàn)報(bào)道AD 患者及動(dòng)物模型中存在Tau 蛋白過(guò)度磷酸化聚集形成的空間構(gòu)象改變，蛋白強(qiáng)變性劑尿素（Urea）可使聚集的 Tau 蛋白充分解螺旋［5］。 利用尿素處理后再次對(duì)Tau 蛋白進(jìn)行電泳鑒定。 經(jīng)尿素處理后，硫胺素缺乏小鼠皮層及海馬組織Tau 蛋白磷酸化變化趨勢(shì)同前，然而通過(guò)蛋白條帶位置反映的Tau 蛋白分子量顯示硫胺素缺乏小鼠與正常對(duì)照小鼠基本一致，蛋白條帶遷移現(xiàn)象被尿素處理逆轉(zhuǎn)。 本結(jié)果也提示Tau 蛋白過(guò)度磷酸化可能是導(dǎo)致其在免疫印跡檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)條帶遷移的原因，硫胺素缺乏使通過(guò)引起Tau 蛋白異常磷酸化，從而導(dǎo)致蛋白的異常聚集。 見(jiàn)圖3。

圖3 硫胺素缺乏小鼠腦內(nèi)Tau 空間構(gòu)象改變

2.4 硫胺素缺乏增加難溶性Tau 蛋白組分除過(guò)度磷酸化及蛋白異常聚集導(dǎo)致空間構(gòu)象改變以外，難溶組分含量增加是AD 中Tau 蛋白變化的另一個(gè)重要病理表現(xiàn)形式［6-7］。 采用Sarkosyl 分離可溶性和難溶性Tau蛋白，結(jié)果顯示硫胺素缺乏小鼠腦組織中可溶組分Tau蛋白水平與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），但難溶組分 Tau 蛋白水平顯著增加（P＜0.01）。 見(jiàn)圖 4。

圖4 硫胺素缺乏小鼠腦內(nèi)難溶性Tau 蛋白水平增加

3 討論

以Aβ 為核心的發(fā)病機(jī)制假說(shuō)（Aβ 級(jí)聯(lián)假說(shuō)）是目前AD 領(lǐng)域最廣為接受的病因假說(shuō)。 Aβ 假說(shuō)認(rèn)為各種原因引起的Aβ 生成異常增加以及清除障礙，腦內(nèi)Aβ 過(guò)度沉積形成神經(jīng)毒性SP，繼而誘發(fā)包括Tau蛋白病理、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元損傷等一系列級(jí)聯(lián)效應(yīng)，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能減退及AD 病程進(jìn)展［8］。 因此清除腦內(nèi) Aβ 沉積是研究 AD 治療領(lǐng)域的重要課題。 然而研究表明，腦內(nèi)Aβ 沉積并不與AD病情成正相關(guān)，三分之一認(rèn)知功能正常的77歲以上老年群體腦內(nèi)Aβ 沉積達(dá)到AD 診斷標(biāo)準(zhǔn)、約50%認(rèn)知功能正常的82歲以上老年群體腦內(nèi)Aβ 沉積達(dá)到AD診斷標(biāo)準(zhǔn)［9-11］。 可見(jiàn)， Aβ 沉積過(guò)程可能獨(dú)立于 AD 認(rèn)知功能損害的進(jìn)展。 更重要的是，近十年來(lái)基于該假說(shuō)的多項(xiàng)Aβ 相關(guān)臨床藥物試驗(yàn)均宣告失?。?2-14］。 這提示可能存在腦糖代謝障礙是AD 病程中恒有的病理生理改變。 大量臨床與基礎(chǔ)研究證實(shí)AD 患者早期即存在大腦葡萄糖代謝異常，腦糖代謝障礙明顯早于臨床癥狀的出現(xiàn)，甚至有研究發(fā)現(xiàn)早于AD 發(fā)病數(shù)十年［15-17］，提示大腦葡萄糖代謝障礙在AD 發(fā)病中的關(guān)鍵作用。然而，對(duì)于腦糖代謝障礙的誘發(fā)因素學(xué)界仍未找到確切答案。

越來(lái)越多的基礎(chǔ)研究及臨床循證依據(jù)顯示硫胺素代謝障礙可能是AD 超早期的潛在病理改變［2-3］。AD 患者腦細(xì)胞中，以硫胺素作為輔酶的α-酮戊二酸脫氫酶（α-ketoglutarate dehydrogenase， KGDH）、丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase， PDH）和轉(zhuǎn)酮醇酶（Transketolase， TK） 活性下降顯著［18-19］，且 PDH 和KGDH 與 AD 臨床病情評(píng)定等級(jí)高度相關(guān)［20］。

Tau 蛋白空間構(gòu)建改變出現(xiàn)聚集繼而引起難溶性組分增加是 AD 中 Tau 蛋白病理的經(jīng)典類(lèi)型［21］。 本研究利用硫胺素缺乏小鼠模型對(duì)Tau 蛋白病理進(jìn)行的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)硫胺素缺乏不僅能顯著誘導(dǎo)Tau 蛋白過(guò)度磷酸化含量增加，還能可引起Tau 蛋白空間構(gòu)建變化及難溶性Tau 蛋白組分增加。 因此，該結(jié)果也為硫胺素代謝障礙致AD 病變提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究首次闡述了硫胺素代謝障礙引起Tau 蛋白異常聚集及難溶性Tau 蛋白組分增加等AD 相關(guān)特征性病變，為硫胺素代謝障礙參與AD 發(fā)病的相關(guān)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 然而，本實(shí)驗(yàn)未明確硫胺素代謝障礙致Tau 蛋白異常聚集的電鏡結(jié)構(gòu)特征及難溶性Tau蛋白組分形成的內(nèi)在機(jī)制，這也是本實(shí)驗(yàn)下一步的研究探索方向。