楊佳純，歐茜文，張文靜，方根強(qiáng)，楊玲

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，上海 200092

研究顯示［1］，胰腺癌在中國(guó)的發(fā)病率及死亡人數(shù)逐年升高，確診患者的中位年齡為70歲，54歲以下的患者僅占11%。 隨著致病機(jī)制及治療方案的研究不斷深入，其他胃腸道惡性腫瘤的生存率不斷增加，而胰腺癌患者的生存率沒有明顯改變，導(dǎo)致這一結(jié)果的重要原因是胰腺癌發(fā)病隱匿，具有極高的侵襲性［2］。

因此，研究胰腺癌轉(zhuǎn)移侵襲的發(fā)生機(jī)制對(duì)改善患者預(yù)后和延長(zhǎng)生存時(shí)間至關(guān)重要［3-4］。 在癌細(xì)胞中，盤狀結(jié)構(gòu)域受體 1（discoidin domain receptor 1，DDR1）通過擾亂細(xì)胞與基質(zhì)之間的正常聯(lián)系，啟動(dòng)癌細(xì)胞遷移與侵襲［5］。 研究發(fā)現(xiàn)DDR1 在胰腺癌組織中高表達(dá)，提示其可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［6］。 本研究旨在探討過表達(dá)DDR1 對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移侵襲和降解細(xì)胞外基質(zhì)能力的影響，明確DDR1 對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移侵襲的調(diào)控作用，為胰腺癌的診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系人胰腺癌細(xì)胞系 PANC-1、 AsPC-1、BxPC-3、 SW1990 由海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科贈(zèng)送，人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞H6C7 由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院普外科提供。

1.2試劑DMEM 高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基、Opti-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal calf serum， FBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)分別為11995065、 11875085、 31985070、 10099141、 25200056）；PMSF、 RIPA 裂解液、 SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、Tubulin 抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為 ST506、 P0013B、 P0012A、 AT819）； LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó) Invitrogen 公司，貨號(hào)11668）； qRT-PCR 試劑盒（中國(guó) Takara 公司，貨號(hào)RR037A）； Transwell 小室（美國(guó) Corning 公司，貨號(hào)3414）； Matrigel 基質(zhì)膠（美國(guó) BD 公司，貨號(hào)354234）；DDR1 抗體（美國(guó) CST 公司，貨號(hào) 5583T）；抗 α-SMA抗體（美國(guó) Sigma 公司，貨號(hào) SAB5500002）； E-cadherin 抗體、 Vimentin 抗體（美國(guó) Santa Cruz 公司，貨號(hào)分別為 sc-7870、 sc-5565）。 載體為 pcDNA3.1 的DDR1表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司。

1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific 公司）； Western Blot 電泳儀、轉(zhuǎn)膜裝置及化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海Tanon 有限公司）； IX73熒光顯微鏡（日本 Olympus 有限公司）； LightCycler?480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（瑞典Roche 公司）。

1.4 胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)PANC-1 細(xì)胞使用DMEM 高糖培養(yǎng)基， AsPC-1、 BxPC-3、 SW1990 和 H6C7 細(xì)胞使用RPMI 1640 培養(yǎng)基。 所有細(xì)胞均放置于條件為37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每48 h 更換1 次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度培養(yǎng)至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.5 胰腺癌細(xì)胞DDR1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前，每孔加入 1.5 mL Opti-MEM 培養(yǎng)基。 在 2 個(gè) EP 管中分別加入2 μg 質(zhì)粒 ＋ 250 μL Opti-MEM 以及 8 μL LipofectamineTM2 000 ＋250 μL Opti-MEM，靜置5 min。 將2 個(gè)EP 管中的溶液混合靜置20 min 后，逐滴加入6 孔板中。 6 h 后更換新鮮常規(guī)培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72 h 后提取對(duì)照組 pcDNA3. 1（ ＋ ）-vector 及實(shí)驗(yàn)組 pcDNA3. 1（ ＋）-DDR1 的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，明確轉(zhuǎn)染效果。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)使用含有PMSF 的裂解液裂解細(xì)胞， BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。 通過SDS-PAGE 凝膠樣品槽電泳120 min，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA、100 min。 室溫下5%脫脂牛奶封閉 2 h，分別置于 E-cadherin（1 ∶1 000）、 Vimentin（1∶1 000）、 α-SMA（1∶1 000）、DDR1（1∶1 000）及 Tubulin（1∶1 000）抗體孵育液中， 4oC 孵育過夜。 TBST 洗膜 3次，分別加入對(duì)應(yīng)二抗（1∶2 000），室溫下孵育2 h。 TBST洗膜，發(fā)光劑顯色，并于發(fā)光成像系統(tǒng)中分析蛋白表達(dá)。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以記號(hào)筆在6 孔板背后畫平行橫線做好定位標(biāo)記，將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的PANC-1 細(xì)胞分別接種于6 孔板中，每孔5 ×105個(gè)細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染后用移液槍對(duì)6 孔板底面進(jìn)行十字劃痕， PBS 洗去脫離細(xì)胞。 更新培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)0、24、 48、 72 h 后，在顯微鏡下進(jìn)行拍照， Image J 軟件測(cè)得劃痕面積，劃痕愈合率 ＝ （1～24、 48、 72 h 空白區(qū)域面積／0 h 空白區(qū)域面積） ×100%。

1.8 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的PANC-1 細(xì)胞后，用不含F(xiàn)BS 的相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2 ×105個(gè)／mL。 在6 孔板中放入Transwell 小室，上室加入100 μL 細(xì)胞懸液，下室加入600 μL 含 2%FBS 的培養(yǎng)基。 孵育 36 h 后取出小室，DPBS 清洗，然后甲醇固定30 min，使用結(jié)晶紫染色10 min。 在顯微鏡下觀察，選取8 個(gè)視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞遷移情況。

將Transwell 上室包被 Matrigel 基質(zhì)膠， 37 ℃孵育 4 h。 在上、下室均加入 500 μL 不含 FBS 的培養(yǎng)基，4 ℃孵育過夜，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同，測(cè)定細(xì)胞侵襲情況。

1.9 qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)用TRIzol 法提取PANC-1 細(xì)胞總 RNA，根據(jù)說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參，通過 2-ΔΔCT進(jìn)行半定量分析。 見表1。

表1 引物序列

1.10 原位明膠酶譜法在蓋玻片上涂異硫氰酸熒光素明膠，37 ℃、DMEM 高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h。 將細(xì)胞接種于處理好的蓋玻片上，孵育過夜后進(jìn)行染色。 每個(gè)樣本隨機(jī)選取8 個(gè)區(qū)域拍攝圖像， Image J 定量分析明膠降解水平，以平均降解百分比表示明膠降解指數(shù)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較使用t檢驗(yàn)和單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各細(xì)胞DDR1 mRNA 表達(dá)及DDR1 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞與 H6C7 細(xì)胞（1. 04 ± 0. 05）DDR1 mRNA 比 較，胰腺 癌細(xì)胞 SW1990 （2. 15 ± 0. 14）、PANC-1（2.28 ± 0.11）、 AsPC-1（3.24 ± 0.10）和 Bx-PC-3（3.46 ±0.37）的DDR1 mRNA 表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

將DDR1 表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞PANC-1，72 h 后進(jìn)行 Western blot 檢測(cè)，對(duì)照組 pcDNA3.1（ ＋ ）-vector 的蛋白表達(dá)為（1.01 ±0.42），實(shí)驗(yàn)組 pcDNA3.1（ ＋）-DDR1 的蛋白表達(dá)為（3.51 ±0.48）。 見圖1。

圖1 各細(xì)胞株DDR1 mRNA 表達(dá)及PANC-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后DDR1 蛋白表達(dá)情況

2.2 過表達(dá)DDR1 上調(diào)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲與對(duì)照組比較，劃痕24、 48 h 后實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞愈合率升高，72 h 后實(shí)驗(yàn)組劃痕已完全愈合，轉(zhuǎn)染DDR1 的胰腺癌細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，細(xì)胞遷移數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 與對(duì)照組比較，過表達(dá)DDR1后，胰腺癌細(xì)胞侵襲數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表 2 和圖 2。

表2 過表達(dá)DDR1 后的細(xì)胞劃痕愈合率（%）

圖2 過表達(dá)DDR1 對(duì)PANC-1 細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2. 3DDR1 促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解與對(duì)照組（0.75 ±0.14）比較，過表達(dá)DDR1 使 PANC-1 細(xì)胞中的明膠基質(zhì)降解指數(shù)（1.14 ±0.20）升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 過表達(dá)DDR1 促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解

2.4DDR1 通過上調(diào)Snail2 和Twist的表達(dá)促進(jìn)EMT 的發(fā)生與對(duì)照組比較，過表達(dá)DDR1 后Vimentin、 α-SMA 蛋白表達(dá)水平升高，但 E-cadherin 蛋白表達(dá)水平下降。Snail2 和Twist的表達(dá)上調(diào)，可能與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）相關(guān)。 見圖 4。

圖4 DDR1 對(duì)EMT 的調(diào)節(jié)作用

3 討論

研究證明，對(duì)經(jīng)過評(píng)估后選擇的老年胰腺癌患者進(jìn)行新輔助或轉(zhuǎn)化化療可獲得一定治療效果，但在藥物的選擇和劑量方面需要更為精準(zhǔn)，以減少化療的不良反應(yīng)［7-8］。DDR1 是一種受體酪氨酸激酶，在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常。 其通過多種途徑參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲，還可以使細(xì)胞外基質(zhì)高度有序，在腫瘤周圍包裹形成屏障，妨礙免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及殺傷腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［9-12］。 本研究表明，胰腺癌細(xì)胞中DDR1 mRNA 表達(dá)水平高于正常人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。 通過劃痕、遷移侵襲試驗(yàn)和原位明膠酶譜法證實(shí)，過表達(dá)DDR1 的胰腺癌細(xì)胞遷移侵襲和細(xì)胞外基質(zhì)降解能力明顯增加。 因此，本研究預(yù)測(cè)在胰腺癌中，DDR1 可以作為治療靶點(diǎn)進(jìn)行抗腫瘤治療，但其作用機(jī)制需要進(jìn)一步明確。

EMT 是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要過程，細(xì)胞失去上皮細(xì)胞特性而轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型，獲得侵襲和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力。 主要特征為細(xì)胞黏附分子，如E-cadherin，表達(dá)減少，具有間質(zhì)特征的N-cadherin、 Vimentin 等表達(dá)升高，并由Snail1、Snail2、Twist、Zeb1 和Zeb2 等 EMT活化轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)［13-15］。 本研究對(duì) PANC-1 細(xì)胞中DDR1 與EMT 的發(fā)生及相關(guān)分子進(jìn)行了檢測(cè)。 與對(duì)照組比較，過表達(dá)DDR1 的PANC-1 細(xì)胞中，上皮標(biāo)志物E-cadherin 蛋白表達(dá)下降，間質(zhì)標(biāo)記物α-SMA、 Vimentin 蛋白表達(dá)水平升高，轉(zhuǎn)錄因子Snail2 和Twist的mRNA 表達(dá)水平上調(diào)。 近年來，圍繞EMT 對(duì)胰腺癌發(fā)展過程中的作用存在爭(zhēng)議，有學(xué)者認(rèn)為Snail并非胰腺癌 EMT 發(fā)生的必要因素［14］。 Hotz 等［15］報(bào)道Snail2 在正常胰腺組織中無表達(dá)，在胰腺癌組織中表達(dá)率為50%，特別是在發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中表達(dá)明顯，干擾Snail2 表達(dá)可抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移。 因此，Snail2是胰腺癌發(fā)生發(fā)展的重要靶點(diǎn)。 綜上所述，DDR1 高表達(dá)于胰腺癌細(xì)胞，可能通過轉(zhuǎn)錄因子Snail2 和Twist誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞EMT 的發(fā)生，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移及侵襲能力。然而，DDR1 促進(jìn)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜，今后擬通過其抑制劑和基因沉默干擾技術(shù)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，從而更好地了解DDR1 在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控機(jī)制。