張青，熊偉，劉明，張誠實，崔棟慧，馮契靚，趙云峰

1. 上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200125；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，上海 200092

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease， COPD）是常見的一種呼吸道慢性疾病，我國流調(diào)數(shù)據(jù)顯示COPD 患病率占40歲以上人群的14.1%［1］，肺動脈高壓（pulmonary hypertension， PH）是COPD 常見并發(fā)癥，我國由COPD 導(dǎo)致的肺動脈高壓占60%，大大增加了患者的病死率。 目前臨床常用的檢測肺動脈高壓的無創(chuàng)方法是多普勒超聲心動圖，三尖瓣峰值流速＞3.4 m·s-1可診斷為肺動脈高壓［2］，超聲心動圖診斷輕度、中度、重度肺動脈高壓的標準為：輕度 PH［36 mmHg （1 mmHg ＝0.133 kPa） ＜ 肺動脈收縮壓≤50 mmHg）］、中度 PH（51 mmHg ＜ 肺動脈收縮壓 ＜70 mmHg）、重度 PH（肺動脈收縮壓≥70 mmHg）［3］。

微小 RNA（microRNA， miRNA）是短鏈非編碼RNA，在血清中穩(wěn)定表達。 miRNA 參與廣泛的生理及生物過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、代謝、血管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、基因調(diào)控、免疫規(guī)避等［4-7］，在包括COPD、PH 等肺部疾病炎癥、血管重塑過程的諸多方面也發(fā)揮重要作用。 miR-17-92 基因簇為一種典型的含有多順反子啟動子的高度保守的基因簇，位于人染色體 13q31.3 處，包含 7 個成員：miR-17-3p、 miR-17-5p、 miR-18a-5p、 miR-19a-3p、 miR-19b-3p、 miR-20a-5p 和 miR-92a-3p。 在動物模型中， miR-17-92 基因簇參與了低氧誘導(dǎo)下的肺動脈高壓的形成。 Chen 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，平滑肌細胞特異性敲除miR-17-92 的小鼠能減弱缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓，而重建miR-17-92 能夠恢復(fù)平滑肌細胞特異性敲除miR-17-92 的小鼠缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓。 研究發(fā)現(xiàn)血漿中miRNA-19b 參與了肺動脈高壓的形成［9］，但是在慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）相關(guān)肺動脈高壓患者中未見相關(guān)報道，本研究旨在探討血漿miRNA-19b 在AECOPD 相關(guān)肺動脈高壓患者中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院呼吸科病房2020年11月—2021年11月診治的 AECOPD患者。 納入標準： （1）入組患者均符合慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD） 診治中國專家共識 （2017年更新版）制定的 AECOPD 標準［10］； （2）患者年齡≥60歲； （3）簽署知情同意書。 符合以上全部標準的病例納入本研究。 排除標準： （1）肺栓塞、慢性血栓栓塞性肺動脈高壓、下肢深靜脈血栓； （2）肺間質(zhì)纖維化、糖尿病、肝功能不全、腎功能不全； （3）惡性腫瘤；（4）冠心病，心功能不全等； （5）研究者認為不宜納入本項研究的特殊人群。 具備以上任意1 項標準的病例不納入本研究。 采用超聲心動圖診斷輕度、中度、重度肺動脈高壓［3］。 本研究經(jīng)浦南醫(yī)院倫理委員會批準通過（批準號為PNYY2020-19）。

本研究對象分2 組，分別為 AECOPD 組（A 組，n＝45）、 AECOPD 合并 PH 組（B 組，n＝111）；再根據(jù)肺動脈收縮壓（PASP）結(jié)果將B 組分為輕度肺動脈高壓組（B1 組，n＝43）、中度肺動脈高壓組（B2 組，n＝36）、重度肺動脈高壓組（B3 組，n＝ 32）共 3 個亞組。A 組中男 31例，女 14例，中位年齡 69.5歲；B 組中男71例，女 40例，中位年齡 72.7歲。 亞組中 B1 組中男28例，女 15例，中位年齡 69.5歲； B2 組好男 23例，女 13例，中位年齡 73.4歲； B3 組中男 20例，女 12例，中位年齡76.2歲。 性別構(gòu)成比、年齡在以上組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2研究方法

1.2.1 超聲心動圖測定肺動脈收縮壓 應(yīng)用Philip IE33 超聲診斷檢測儀在彩色多普勒引導(dǎo)下測定肺動脈收縮壓。 探頭頻率 2.5 ～3.5 MHz，患者在靜息狀態(tài)下取仰臥位或者左側(cè)臥位，平靜呼吸，先后在胸骨旁左室長軸、心尖左室長軸切面、心尖四腔或五腔、動脈根部短軸、左室短軸及右室流出道長軸等切面進行探查。 測量各房室大小，大血管內(nèi)徑，室間隔及左、右室厚度，觀察各室壁運動情況、瓣膜結(jié)構(gòu)、活動情況以及有無異常的血流方向及速度，探查有無心臟畸形。對合并三尖瓣反流患者，取右室流出道為標準切面，利用連續(xù)多普勒測量三尖瓣最大反流速度（V），用簡化柏努利方程計算三尖瓣跨瓣壓差。 將測得的三尖瓣跨瓣壓差加上右房壓即為PASP。 若未合并三尖瓣反流者，可利用連續(xù)多普勒測定其分流頻譜的收縮期最大分流速度，計算 PASP［3］。

1.2.2 血漿 miR-19b 、IL-6 水平測定 所有研究對象于入院次日晨起空腹抽取靜脈血10 mL，取6 mL靜置后送至檢驗科生化室檢測；取4 mL 室溫靜置30 min后， 4 ℃ 下 3 000 r／min 離心 10 min，提取血漿，移入Eppendorf 管，置于 -80 ℃冰箱保存待測。血漿miRNA-19b 測定：采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）測定 miR-19b。 按 Trizol 試劑盒說明書步驟提取細胞總RNA 并測定其濃度。 通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA 為模板進行PCR 擴增。 Caspase-3：正義鏈 5ˊ-GAATCCACGAGCAGAGTCAA-3ˊ，反義鏈 5ˊ-TAGCCTTCAACAAGCCAACC-3ˊ； β-actin：正義鏈 5ˊ-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3ˊ， 反 義 鏈 5ˊ-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3ˊ。 反應(yīng)條件： 94 ℃變性5 min， 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s（收集熒光信號）， 40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。 在擴增 miR-19b 的同時，擴增U6RNA（管家基因）作為內(nèi)參照，結(jié)果以 2-ΔΔCt法表示［11］。 血漿 IL-6 測定：應(yīng)用 ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)）依照說明書操作方法對血漿IL-6 進行檢測。

1.2.3 6 分鐘步行距離的測定 在病房內(nèi)用米尺事先測定30 m 距離，標明起始點位置，每5 m 標注數(shù)字，記錄患者6 分鐘所行走的距離。 在6 分鐘內(nèi)患者如果出現(xiàn)疲乏、頭暈、心前區(qū)疼痛、呼吸困難、出冷汗、面色蒼白則停止實驗。 試驗前后記錄患者血壓、心率、呼吸頻率。 6 分鐘步行距離分4 個等級，≥350 m 為輕度、 250～349 m 為中度、 150 ～249 m 為重度、≤149 m 為極重度，級別越低說明心肺功能越差［12］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。 計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較行獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用直線相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺動脈收縮壓、血漿miRNA-19b、血漿IL-6、血漿CRP、NT-ProBNP 比較表 1 結(jié)果顯示， A、B 組兩兩比較，肺動脈收縮壓、血漿miRNA-19b、血漿IL-6、血漿CRP、血漿 NT-ProBNP 各指標之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜ 0.05）； B1、 B2、 B3 組兩兩比較，上述各指標之間的差異，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜0.05）。

表1 各組研究對象肺動脈收縮壓及血漿miRNA-19b、血漿IL-6 、CRP 、NT-ProBNP 水平的比較（ ）

表1 各組研究對象肺動脈收縮壓及血漿miRNA-19b、血漿IL-6 、CRP 、NT-ProBNP 水平的比較（ ）

注： 與 A 組比較， *P ＜0.05；與 B1 組比較， ＃P ＜0.05；與 B2 組比較， ▲P ＜0.05。

組別 肺動脈收縮壓（mmHg） 血漿miRNA-19b 血漿IL-6（pg·mL-1）血漿CRP（mg·L-1）血漿NT-ProBNP（pg·mL-1）A 組 （n ＝45） 32.3 ±6.7 2.527 ±0.621 32.3 ±10.3 41.2 ±12.6 279.3 ± 65.5 B 組 （n ＝ 111） 60.4 ±15.6* 1.468 ±0.421* 64.1 ±16.4* 60.4 ±17.5* 771.6 ± 168.8*B1 （n ＝ 43） 47.1 ±12.5 1.825 ±0.413 51.7 ±17.8a 49.6 ±14.4a 517.3 ± 103.2a B2 （n ＝36） 62.3 ±16.7＃ 1.411 ±0.372＃ 66.3 ±21.2＃ 62.3 ±20.3＃ 803.5 ±217.7＃B3 （n ＝32） 76.2 ±21.3?！?1.052 ±0.293?！?78.3 ±22.6?！?72.7 ±13.8＃▲ 1077.5 ±277.5?！?/p>

2.2 各組動脈血氣和6 分鐘步行距離的比較表2結(jié)果顯示， A、B 組兩兩比較， pH 值、 PaO2、PaCO2、6分鐘步行距離各指標之間的差異，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜0.05）； B1、 B2、 B3 組兩兩比較，上述各指標之間的差異，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜0.05）。

表2 各組動脈血氣和6 分鐘步行距離的比較（）

表2 各組動脈血氣和6 分鐘步行距離的比較（）

注： 與 A 組比較， *P ＜0.05；與 B1 組比較， ＃P ＜0.05；與 B2 組比較， ▲P ＜0.05。

組別 pH PaO2（mmHg） PaCO2（mmHg） 6 分鐘步行距離（m）A 組 （n ＝45） 7.31 ±0.48 54.6 ± 11.8 55.3 ±12.6 319.6 ±89.8 B 組 （n ＝ 111） 7.27 ±0.42* 42.8 ± 14.1* 62.5 ±14.6* 244.1 ±71.8*B1 （n ＝ 43） 7.34 ±0.77 49.7 ± 13.8 52.7 ±8.1 285.6 ±77.6 B2 （n ＝36） 7.27 ±0.61＃ 40.3 ±8.9＃ 62.5 ±9.9＃ 237.8 ±69.6＃B3 （n ＝32） 7.22 ±0.61?！?36.3 ±9.2＃▲ 75.3 ±15.7?！?195.3 ±51.7＃▲

2.3 相關(guān)性分析表3 結(jié)果顯示， A、 B 兩組研究對象血漿miRNA-19b 與肺動脈收縮壓、血漿IL-6、血漿CRP、血漿 NT-ProBNP、PaCO2均呈負相關(guān)性（P均 ＜0.05）、與 pH 值、 PaO2、 6 分鐘步行距離均呈正相關(guān)性（P均 ＜0.05）； B1、 B2、 B3 3 組研究對象血漿 miRNA-19b 與肺動脈收縮壓、血漿IL-6、血漿 CRP、血漿NTProBNP、 PaCO2均呈負相關(guān)性（P均 ＜0.05）、與 pH 值、PaO2、 6 分鐘步行距離均呈正相關(guān)性（P均 ＜0.05）。

表3 各組血漿miRNA-19b 與其他指標值的相關(guān)性

3 討論

PH 的發(fā)病機制主要是缺氧、炎癥等各種原因引起的細胞增殖、凋亡，導(dǎo)致肺上皮細胞和內(nèi)皮細胞損傷功能失調(diào)、肺血管重塑。 miR-17-92 簇是控制細胞發(fā)育、凋亡和增殖的最具特征的miRNA 家族之一。miR-17-92 基因簇上調(diào)可導(dǎo)致細胞凋亡的減少（尤其是抗缺氧誘導(dǎo)的細胞凋亡）和細胞增殖增加。 在缺氧所致肺動脈高壓和動脈性肺動脈高壓中， miR-17-92簇表達受P53 負調(diào)控，受原癌基因轉(zhuǎn)錄因子（C-myc）和IL-6／STAT3 通路正向調(diào)控，從而導(dǎo)致miR-17-92 簇靶目標 HIF1α 或 BMPR2 的升高或降低。 P53 介導(dǎo)的miR-17-92 的下降被認為是缺氧介導(dǎo)的細胞凋亡復(fù)雜過程中的一部分，在缺氧條件下， miR-17 和miR-20a的抑制也會導(dǎo)致明顯的細胞凋亡［13］。 miRNA-17-92簇對右心室收縮壓和肺血管重構(gòu)也有作用。 抗miRNA-17-92 可降低右心室收縮壓和肺血管重構(gòu)。 Pullamsetti 等［14］在低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓鼠模型中，抗miRNA-17 治療明顯減少右心室收縮壓和總肺血管抵抗，增加肺動脈加速時間，恢復(fù)心輸出量，減少肺血管重塑。 miRNA-19b 是 miR-17-92 基因簇中的 1 個成員，參與了肺動脈高壓的形成［9］、與 IL-6、TNF-α 等參與肺動脈高壓形成的炎癥因子有關(guān)［15］。 研究發(fā)現(xiàn)血漿IL-6、血漿NT-ProBNP 與COPD 肺動脈高壓密切相關(guān)，血漿NT-ProBNP 水平增高不代表患者一定存在心功能不全，而是存在肺動脈高壓［16］。

本研究結(jié)果顯示：A、B 組兩兩比較以及B1、B2、B3 組兩兩比較，血漿miRNA-19b、肺動脈收縮壓、血漿IL-6、 血 漿 CRP、 血 漿 NT-ProBNP、 pH 值、 PaO2、PaCO2、6 分鐘步行距離各指標之間的差異，均有統(tǒng)計學(xué)意義。 A、 B 組研究對象以及 B1、 B2、 B3 組，血漿miRNA-19b 與肺動脈收縮壓、血漿 IL-6、血漿 CRP、血漿 NT-ProBNP、 PaCO2均呈負相關(guān)性，與 pH 值、PaO2、6 分鐘步行距離均呈正相關(guān)性。 以上研究結(jié)果說明：合并肺動脈高壓的 AECOPD 老年患者血漿miRNA-19b 水平明顯低于不合并肺動脈高壓的AECOPD 老年患者；在AECOPD 相關(guān)PH 老年患者中，隨著肺動脈壓力逐漸增高，血漿miRNA-19b 水平逐漸降低，上述情況具體機制不詳，分析原因可能血漿miRNA-19b 表達受P53 負調(diào)控，與缺氧介導(dǎo)的肺上皮細胞和內(nèi)皮細胞損傷、凋亡的復(fù)雜過程關(guān)系密切。

綜上所述，在AECOPD 相關(guān)PH 老年患者中，隨著肺動脈壓力逐漸增高，血漿miRNA-19b 水平逐漸降低，血漿miRNA-19b 水平與AECOPD 相關(guān)PH 老年患者病情嚴重程度存在一定的關(guān)系。 本研究不足之處是單中心研究，樣本量較小，需要以后進行多中心和大樣本研究。 另外，動態(tài)監(jiān)測AECOPD 相關(guān)PH 老年患者血漿miRNA-19b 的水平可能對輔助診斷AECOPD 合并PH 有一定的臨床價值。