趙 燕， 蘇紫瑩， 楊曉波

腦卒中目前仍是世界范圍內(nèi)威脅生命的疾病，可導(dǎo)致長期殘疾甚至死亡[1]。大多數(shù)腦卒中為缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)，血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的功能異常和破壞是其最核心的病理生理改變之一。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞是BBB的重要組成之一，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在腦卒中的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，但其中的機(jī)制尚未完全闡明。既往研究表明，microRNAs (miRNAs)與缺血性腦卒中相關(guān)，這些內(nèi)源性小RNA在大多數(shù)人體器官和組織中高度保守和豐富，在多種病理生理狀態(tài)下發(fā)生表達(dá)異常，從而引起功能上的改變，參與疾病進(jìn)程[2,3]。Hsa-miR-642b-3p是新近發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的一個miRNA[4]，其在缺血性腦卒中方面的作用尚未報道。為了探討hsa-miR-642b-3p在急性缺血性腦卒中方面的價值，我們通過細(xì)胞模型對缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)條件下hsa-miR-642b-3p對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RNAiso購自Takara公司，使用miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit(上海生工生物)完成逆轉(zhuǎn)錄，使用TB Green?Premix Ex TaqTM(Takara公司)檢測miRNA的表達(dá)，miRNA 抑制劑(inhibitor)及陰性對照由上海吉瑪公司合成，人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其配套培養(yǎng)基購自Sciencell公司，CD31抗體購自碧云天生物公司，claudin5抗體購自Abcam公司，二抗購自上海生工生物公司，引物由上海生工生物公司合成。

1.2 免疫熒光鑒定內(nèi)皮細(xì)胞 培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，加入CD31兔抗人一抗(1∶100)4 ℃孵育過夜，加入FITC標(biāo)記的驢抗兔二抗(1∶100)孵育1 h，DAPI襯染細(xì)胞核，于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)模型 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株及其培養(yǎng)基來自于Sciencell，體外建立H/R模型，主要步驟包括為以低血清的DMEM/F12培養(yǎng)基替代原培養(yǎng)基，在密閉小室中通入乏氧氣體(5% CO2和95% N2，氧含量<0.1%)，培養(yǎng)4 h后更換為原培養(yǎng)基并在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)氣體條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 miRNA inhibitor轉(zhuǎn)染 細(xì)胞接種于6孔板，約每孔2×105個，轉(zhuǎn)染前更換為新鮮培養(yǎng)基，按照說明書加入無血清DMEM培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑、hsa-miR-642b-3p inhibitor或陰性對照(negative control,NC)20 μmol，常規(guī)培養(yǎng)條件繼續(xù)孵育及后續(xù)檢測。hsa-miR-642b-3p inhibitor序列為5’-GGGUCCCUCUCCAAAUGUGUCU-3’，NC序列為5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。

1.5 細(xì)胞死亡檢測 培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，吸取200 μl并加入等體積0.4%臺盼藍(lán)染液，混勻染色3 min。取50 μl染色后的細(xì)胞懸液在細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)藍(lán)染死亡細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞存活率=(細(xì)胞總數(shù)-染色細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 細(xì)胞增殖檢測 細(xì)胞鋪板到96孔板中，按照不同時間點每孔100 μl培養(yǎng)基中加入10 μl CCK8，避光孵育1 h，在酶標(biāo)儀上450 nm檢測吸光度。

1.7 測定內(nèi)皮細(xì)胞相對通透性 參照既往研究[5]，將腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，按照2×105/孔接種于已鋪Matrigel的12孔Transwell上室，下室添加等體積完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長形成單層細(xì)胞層后棄培養(yǎng)基，在上室每孔分別加入miR-642b-3p的inhibitor或NC進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后進(jìn)行H/R建模，在上室加入100 μl FITC-BSA(1 mg/ml)，下室加入600 μl磷酸鹽緩沖液，避光孵育1 h。取100 μl下室中的液體酶標(biāo)儀上機(jī)檢測熒光強度(激發(fā)波長490 nm)，并計算通透系數(shù)：通透系數(shù)=(C下室·V下室/C上室·V上室)，其中C為FITC-BSA濃度，V為體積，以正常組為參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化得到相對通透系數(shù)。

1.8 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 體外培養(yǎng)的細(xì)胞移除培養(yǎng)基后以PBS清洗細(xì)胞，6孔板每孔加入1 ml RNAiso裂解細(xì)胞，按照說明書操作提取總RNA。采用poly-A tail法進(jìn)行miRNA檢測，以hsa-miR-642b-3p序列作為正向引物，通用下游引物由生工生物公司提供，以U6為內(nèi)參(F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACT-3’；R：5’-GCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’)。

1.9 Western blot 培養(yǎng)細(xì)胞棄培養(yǎng)基及清洗后采用RIPA裂解細(xì)胞，超聲破碎后4 ℃離心15 000 rpm 20 min，BCA法測定蛋白濃度后加入loading buffer加熱變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后分別孵育一抗和相對應(yīng)的二抗，經(jīng)免疫化學(xué)發(fā)光檢測、分析目的蛋白的表達(dá)。

1.10 生信學(xué)分析 通過在線數(shù)據(jù)庫miRDB及Targetscan進(jìn)行對hsa-miR-642b-3p靶基因進(jìn)行檢索，取交集后的靶基因通過DAVID在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG富集分析[6～8]。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad進(jìn)行統(tǒng)計計算和繪圖。計量資料兩組樣本間差異比較采用t檢驗，多組樣本間差異比較采用方差分析，并采用Turkey法行兩兩比較。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hsa-miR-642b-3p在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞H/R模型中表達(dá)升高 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障的主要細(xì)胞成分之一，為了研究hsa-miR-642b-3p在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞H/R模型中表達(dá)，在通過免疫熒光證實內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CD31后，我們建立了體外腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞H/R模型，通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，模型組中hsa-miR-642b-3p的表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)，提示hsa-miR-642b-3p在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞H/R模型表達(dá)升高(見圖1)。

2.2 下調(diào)hsa-miR-642b-3p減少H/R條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡 由于發(fā)現(xiàn)hsa-miR-642b-3p在H/R條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)升高，我們進(jìn)一步對hsa-miR-642b-3p進(jìn)行了表達(dá)抑制來探討其作用與功能。通過hsa-miR-642b-3p inhibitor下調(diào)hsa-miR-642b-3p表達(dá)后，經(jīng)臺盼藍(lán)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在給與H/R組hsa-miR-642b-3p inhibitor干預(yù)后，H/R條件下引起的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡減少(P<0.05)(見圖2)。

2.3 下調(diào)hsa-miR-642b-3p促進(jìn)H/R條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖 細(xì)胞增殖對內(nèi)皮細(xì)胞損傷及修復(fù)十分重要，我們進(jìn)一步通過CCK8法檢測內(nèi)皮細(xì)胞H/R后增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在H/R條件下，相較于NC組，hsa-miR-642b-3p inhibitor組顯示細(xì)胞增殖得到一定程度的改善(P<0.05)(見圖3)。

2.4 下調(diào)hsa-miR-642b-3p減少H/R條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性 細(xì)胞通透性是腦微血管內(nèi)皮的重要生理功能之一，我們通過FITC-BSA檢測腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H/R條件下內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，相較于NC組，hsa-miR-642b-3p inhibitor能夠減少內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，同時能增加緊密連接蛋白claudin5的表達(dá)(P<0.05)(見圖4)。

2.5 hsa-miR-642b-3p的分子生物學(xué)功能 為了進(jìn)一步研究hsa-miR-642b-3p發(fā)揮作用的潛在生物學(xué)功能，我們首先通過miRDB與Targetscan兩個數(shù)據(jù)庫分析了hsa-miR-642b-3p可能的靶基因，篩選出二者重疊的共同靶基因共508個，進(jìn)一步通過DAVID在線工具進(jìn)行了這些基因的GO和KEGG富集分析。分析結(jié)果顯示，hsa-miR-642b-3p可能參與了RNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞粘附、TGF-β通路等多種生物學(xué)功能與信號通路，這些通路均與IS存在關(guān)聯(lián)性，提示這些可能是hsa-miR-642b-3p的潛在分子機(jī)制(見圖5)。

圖1 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞H/R模型中hsa-miR-642b-3p的表達(dá)情況。A：免疫熒光證實CD31陽性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，bar=20 μm；B：H/R組hsa-miR-642b-3p表達(dá)水平高于對照組(Ctrl)，*P<0.05

圖2 下調(diào)hsa-miR-642b-3p減少H/R條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡。A：qRT-PCR驗證hsa-miR-642b-3p inhibitor轉(zhuǎn)染效果；B、C：臺盼藍(lán)染色顯示H/R組在給與hsa-miR-642b-3p inhibitor后24 h可減少內(nèi)皮細(xì)胞死亡，bar=50 μm；*P<0.05

圖3 下調(diào)hsa-miR-642b-3p促進(jìn)H/R條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。*P<0.05

圖4 下調(diào)hsa-miR-642b-3p減少H/R條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性。A：下調(diào)hsa-miR-642b-3p 對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響；B：臺下調(diào)hsa-miR-642b-3p對claudin5表達(dá)的影響；*P<0.05

圖5 hsa-miR-642b-3p分子生物學(xué)作用的生信學(xué)分析。A：數(shù)據(jù)庫miRDB及Targetscan中hsa-miR-642b-3p可能的靶基因取交集；B：hsa-miR-642b-3p可能的靶基因KEGG通路分析；C：hsa-miR-642b-3p可能的靶基因GO生物學(xué)功能富集分析

3 討 論

miRNAs是進(jìn)化上保守的非編碼 RNA，由 20～22個核苷酸組成，通過 mRNA 切割或翻譯抑制相關(guān)基因表達(dá)。miRNAs在許多生理和病理活動中發(fā)揮重要作用，包括腦卒中[9]，目前已經(jīng)受到廣泛的關(guān)注。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的進(jìn)展，對miRNAs與缺血性卒中的關(guān)系進(jìn)行了廣泛研究，揭示了多種miRNAs與腦卒中相關(guān)。例如，miR-22-3p可以通過抑制KDM6B保護(hù)大腦免受缺血性損傷[10]，下調(diào)miR-20a可減輕大鼠缺血/再灌注(H/R)損傷[11]。這些miRNAs既有表達(dá)升高的，也存在表達(dá)下調(diào)的，功能呈現(xiàn)多樣化。

缺血性腦卒中時組織常發(fā)生缺血再灌注損傷，BBB破壞是其中的關(guān)鍵之一[12]。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞是BBB的重要組成之一，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在腦卒中的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量和功能上的損害，包括內(nèi)皮細(xì)胞死亡、內(nèi)皮細(xì)胞增殖降低、內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加等，這些損傷可以是一過性的，也可以是持久性損害。如能在這種病理狀態(tài)下給與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)性干預(yù)，可能對減輕腦卒中的病變程度有一定幫助。既往研究顯示miRNA可在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中通過多種方式發(fā)揮調(diào)控作用從而影響腦卒中。例如，miR-27a-3p高表達(dá)可減少內(nèi)皮細(xì)胞間的通透性，改善血腦屏障功能[13]；miR-574-5p通過分子作用軸circPHKA2/miR-574-5p/SOD2減輕腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷[14]；還有研究顯示miR-340-5p可以促進(jìn)氧糖剝奪條件下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生[15]。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞H/R模型中，hsa-miR-642b-3p表達(dá)升高，提示了其與腦卒中可能存在相關(guān)性，尤其是內(nèi)皮細(xì)胞密切相關(guān)。隨后的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)hsa-miR-642b-3p能夠在不同程度上改善H/R造成的內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少通透性，并能夠一定程度上恢復(fù)緊密連接蛋白claudin5的表達(dá)，后者在缺氧復(fù)氧損傷中常出現(xiàn)表達(dá)降低導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加[16]，說明hsa-miR-642b-3p能夠作為一種調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。 同時在本研究中，我們通過對hsa-miR-642b-3p靶基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-642b-3p可能參與多種活動和途徑，包括RNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞粘附、TGF-β通路等等，這些因素與缺血性腦卒中存在不同程度的相關(guān)性[17]， 提示hsa-miR-642b-3p發(fā)揮其生物學(xué)作用具有多種可能的分子機(jī)制。

綜上， miRNA被認(rèn)為在缺血性腦卒中診斷、治療和預(yù)后方面存在較大的發(fā)掘潛力[18]，我們的研究表明hsa-miR-642b-3p可作用于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷，提示其可能通過調(diào)控腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷參與缺血性卒中，為后續(xù)進(jìn)一步研究hsa-miR-642b-3p在缺血性腦卒中的作用提供了前期的實驗基礎(chǔ)。