徐亦君，竺明晨

0 引言

胰腺癌（pancreatic cancer,PC）是一種常見的惡性實體腫瘤，其發(fā)病率和死亡率持續(xù)升高[1-3]。手術(shù)是胰腺癌最重要的治療手段。由于癥狀不典型和缺乏有效的篩查工具，許多患者在診斷時已發(fā)展到不可切除的狀態(tài)，據(jù)統(tǒng)計只有20%的病例可以切除病灶[4]。此外，即使在治愈性手術(shù)后，復(fù)發(fā)率也很高，且長期生存率比其他癌癥短[5-6]。因此探索胰腺癌診斷和預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物對于改善胰腺癌患者預(yù)后意義重大。

液體活檢利用外周循環(huán)血液代替組織標(biāo)本進行檢測，可提供腫瘤輔助診斷和治療相關(guān)信息，成為近年來的研究熱點。作為液體活檢之一的游離DNA（cell-free DNA,cfDNA）是一類由壞死或者凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的存在于體液中的DNA，在腫瘤中可由腫瘤細(xì)胞釋放到血液中，因此cfDNA越來越多地引起腫瘤研究者關(guān)注[7-11]。研究顯示cfDNA Stat3在乳腺癌中升高，并與腫瘤體積相關(guān)，cfDNA還可作為非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物和療效預(yù)測指標(biāo)[12-13]。此外，cfDNA檢測在分析腫瘤衍生突變、腫瘤突變負(fù)擔(dān)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、突變特征和體細(xì)胞突變來源等方面提供許多信息[14]。目前有關(guān)cfDNA在胰腺癌中的應(yīng)用價值探討較少，因此本課題擬研究血漿cfDNA檢測在胰腺癌中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 資料

選取江蘇省腫瘤醫(yī)院2018年1月—2021年12月收治的胰腺癌患者467例以及129例健康體檢者（健康對照組），其中男332例，女264例，年齡17～86歲，中位年齡62歲（53～69歲）。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理確診為胰腺癌；均無除胰腺癌外其他惡性腫瘤；均知情同意并自愿參與本次研究；術(shù)前未行任何抗腫瘤藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：有既往腫瘤病史；有嚴(yán)重心、肝、腎等功能不全。收集的胰腺癌患者病理資料包括年齡、性別、腫瘤TNM分期（參照美國癌癥聯(lián)合委員會胰腺癌第八版分期標(biāo)準(zhǔn)）、血清CEA和CA19-9。本研究通過江蘇省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

抽取受試者2 ml靜脈全血，EDTA-K2抗凝，1 900g離心15 min后獲得血漿。使用帝基（南京）生物科技有限公司生產(chǎn)的QuantiDNA Direct cfDNA Test（DiaCarta）試劑盒檢測cfDNA濃度，主要過程如下：在90 μl PBS中加入10 μl血漿，95℃加熱10 min，然后放置冰上5 min，DNA標(biāo)準(zhǔn)品采用相同處理。配置74 μl裂解液、1 μl封閉液、4 μl人類Alu探針、捕獲磁珠和0.1 μl蛋白酶K作為每孔的工作液，然后進行雜交，采用Luminex MAGPIX?儀器讀取結(jié)果，操作步驟詳見試劑說明書。cfDNA的Cut off值為12 ng/ml。使用Roche e 601電化學(xué)發(fā)光儀檢測患者血清CEA和CA19-9水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Spass16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性分布檢驗，偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)和25%～75%百分位形式顯示，組間數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney U檢驗。cfDNA與胰腺癌病理資料的關(guān)系采用卡方檢驗。繪制ROC曲線評估相關(guān)指標(biāo)作為標(biāo)志位的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cfDNA在胰腺癌和健康對照組中的水平

采用cfDNA檢測試劑盒，建立cfDNA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。統(tǒng)計分析467例胰腺癌患者和129例健康對照組血漿cfDNA含量，兩組均不呈正態(tài)分布，健康對照組cfDNA中位數(shù)15.15（9.65～32.48）ng/ml，胰腺癌cfDNA中位數(shù)20.85（12.9～35.96）ng/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0027,Mann-Whitney U=24932）。cfDNA在胰腺癌中的陽性率為77.73%（363/467），高于健康對照組中的陽性率59.68%（77/129）。

圖1 cfDNA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of cfDNA test

2.2 cfDNA與胰腺癌患者病理資料的關(guān)系

分析47例病理資料完整的胰腺癌手術(shù)患者cfDNA水平和患者性別、年齡、TNM、CEA和CA19-9等病理資料關(guān)系，發(fā)現(xiàn)cfDNA水平與這些因素不同分組間無顯著相關(guān)性，見表1。

表1 cfDNA與胰腺癌病理資料的關(guān)系Table 1 Relationship between cfDNA and clinicopathologic features of patients with pancreatic cancer

2.3 cfDNA作為胰腺癌診斷標(biāo)志物的臨床價值

cfDNA、CEA和CA19-9作為診斷標(biāo)志物的敏感度分別為62.65%、64.04%和60.32%，特異性分別為61.05%、70.53%和87.37%，見表2。cfDNA聯(lián)合檢測CEA和CA19-9敏感度為77.26%，特異性為53.58%。cfDNA、CEA、CA19-9和聯(lián)合檢測曲線下面積分別為0.62、0.67、0.74和0.67。cfDNA作為腫瘤標(biāo)志物的敏感度高于CA19-9，但是特異性低于CA19-9，此三項指標(biāo)聯(lián)合檢測敏感度得到顯著提高，見圖2。

圖2 ROC曲線評估cfDNA、CEA和CA19-9作為胰腺癌診斷標(biāo)志物的效能Figure 2 Performance of cfDNA,CEA and CA19-9 as pancreatic cancer diagnostic biomarkers evaluated by ROC curves

表2 cfDNA、CEA和CA19-9作為胰腺癌診斷標(biāo)志物的效能Table 2 Performance of cfDNA,CEA,and CA19-9 as pancreatic cancer biomarkers

3 討論

胰腺癌惡性程度高，目前缺乏可靠的早期篩查方法，5年生存率僅為9%[15-16]。因此，在臨床治療中，迫切需要找到影響胰腺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物，便于對患者的預(yù)后進行評估，并通過對患者的個體化治療來改善預(yù)后。但目前對于胰腺癌臨床上缺乏特異性的生物標(biāo)志物[17]，常用的主要血清標(biāo)志物是CEA和CA19-9，然而，它們的敏感度不夠理想[18]。

近年來血漿cfDNA檢測作為一種新的液態(tài)活檢方法逐漸成為研究熱點。腫瘤發(fā)生過程中更高的壞死和凋亡率與cfDNA濃度增加有關(guān)[19]。癌癥患者cfDNA攜帶了腫瘤發(fā)生相關(guān)的遺傳改變信息，例如DNA含量、DNA完整性、雜合性缺失及癌基因和抑癌基因的突變等，這些改變與癌癥的發(fā)展、進展和對治療的抵抗有關(guān)，為臨床診斷和治療提供了有用信息[19-22]。據(jù)報道，cfDNA片段的大小對晚期胰腺癌患者具有預(yù)后價值，較短的cfDNA片段與較差的預(yù)后有關(guān)[23]。既往研究證實突變體K-RAS可作為胰腺癌的關(guān)鍵驅(qū)動基因，一項對正在接受手術(shù)/化療的晚期胰腺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)突變循環(huán)K-RAS水平降低，證實了該化療方案的有效性，循環(huán)K-RAS DNA狀態(tài)的改變可以提供預(yù)測治療反應(yīng)的關(guān)鍵信息[24]。何建新等采用實時熒光定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)40例胰腺癌患者血漿cfDNA水平高于健康對照組[25]，本研究采用SuperbDNA?技術(shù)檢測596例樣本，得出結(jié)果與何建新等的相符，胰腺癌患者的血漿cfDNA水平高于健康對照組。此外，結(jié)果顯示cfDNA與胰腺癌病理資料之間無顯著相關(guān)性，雖然cfDNA在16例胰腺癌遠端轉(zhuǎn)移組和31例非轉(zhuǎn)移組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但發(fā)現(xiàn)5例遠端轉(zhuǎn)移的患者cfDNA水平較轉(zhuǎn)移前顯著升高。由于觀察的例數(shù)過少，是否具有統(tǒng)計學(xué)意義還有待驗證，未來需要擴大病例數(shù)進一步論證cfDNA與胰腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

CA19-9是一種低聚糖腫瘤相關(guān)抗原，在胰腺癌患者血清中升高，大量研究表明其在胰腺癌篩查、診斷、預(yù)后和療效評估方面具有重要作用[26]。雖然CA19-9被認(rèn)為是胰腺癌的早期診斷標(biāo)志物，但也有報道其存在一些不足，包括診斷的敏感度和特異性較差，不能滿足臨床需求[27]。CEA主要用于結(jié)腸癌的診斷和療效監(jiān)測，并在約60%的胰腺癌患者血清中升高，但關(guān)于CEA在胰腺癌中的臨床價值討論較少。據(jù)報道其診斷胰腺癌的敏感度僅為30%左右，并存在非特異性結(jié)腸炎和重度吸煙等干擾因素。然而，對于診斷為胰腺癌的患者，CEA可用于評估治療的有效性和復(fù)發(fā)監(jiān)測[28]。值得注意的是，在轉(zhuǎn)移性和局部進展性胰腺癌中，CEA被認(rèn)為是比CA19-9更好的預(yù)測生物標(biāo)志物，但在生存和早期復(fù)發(fā)方面，它的預(yù)測價值不是很理想[29]。這些腫瘤標(biāo)志物單獨應(yīng)用時診斷效能不高，一般推薦聯(lián)合檢測。本研究發(fā)現(xiàn)CA19-9在診斷胰腺癌方面具有較高的特異性，但是敏感度不高，聯(lián)合應(yīng)用CA19-9、CEA和cfDNA后，敏感度顯著提高。此外，到三個指標(biāo)聯(lián)合檢測后特異性相比單個指標(biāo)的特異性有所降低，這可能與采用不同的Cut off值有關(guān)。我們認(rèn)為僅通過監(jiān)測cfDNA濃度得到的信息有限，需要深入挖掘這些DNA突變或者DNA片段完整性等相關(guān)信息，才能充分發(fā)揮cfDNA在胰腺癌診斷和治療監(jiān)測方面的價值。

綜上，腫瘤患者的cfDNA以一種液態(tài)活檢形式在腫瘤診斷和治療方面具有無創(chuàng)、采樣方便可動態(tài)監(jiān)測等特點。本研究發(fā)現(xiàn)cfDNA在胰腺癌患者中水平高于健康對照組，聯(lián)合檢測cfDNA和常規(guī)標(biāo)志物可一定程度地改善胰腺癌的診斷效能。cfDNA在胰腺癌中的臨床生物學(xué)價值需要更多的研究來挖掘，為胰腺癌的診斷和治療提供更好的標(biāo)志物指標(biāo)。