陳進(jìn)寶，賈琳琳，汪紅平，唐東豪，吳宏磊，殷佩浩

0 引言

結(jié)直腸癌是一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全球分別位列第三和第二[1]。目前在結(jié)直腸癌的治療上，主要以手術(shù)治療為主，結(jié)合放化療等手段進(jìn)行綜合治療。然而化療耐藥與腫瘤轉(zhuǎn)移是目前結(jié)直腸癌治療效果的最大障礙，也是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境（TME）是一個復(fù)雜的環(huán)境，包括細(xì)胞（T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞等）和非細(xì)胞成分，在癌癥進(jìn)展的多個方面發(fā)揮重要作用，而作為TME的重要組成部分，M2型巨噬細(xì)胞可調(diào)節(jié)多個關(guān)鍵的致癌過程，即腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性等[2-3]。大量研究表明傳統(tǒng)中醫(yī)藥可通過調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮抗腫瘤作用[4-5]。近年來，六神丸治療惡性腫瘤的作用被逐漸關(guān)注，其抗腫瘤作用主要體現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)耐藥性等方面[6-7]。但在結(jié)直腸癌中，六神丸抗腫瘤作用機制仍不十分清楚。本研究通過開展動物體內(nèi)實驗，對此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 18只健康6周齡18～22 g雄性BALB/c小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），12 h光照/黑暗循環(huán)，室溫控制在20℃～24℃，相對濕度45%～70%，分籠、自由飲用水飼養(yǎng)。

1.1.2 細(xì)胞株 鼠源結(jié)腸癌細(xì)胞株（CT26）（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所），RPMI 1640培養(yǎng)液（含1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液、10%胎牛血清），細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)（37℃、5% CO2）。

1.1.3 藥品與試劑 IL-10、TGF-β、IFN-γ和IL-12P40的ELISA試劑盒（中國博士德公司）；奧沙利鉑（50毫克/支，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，H20000337）；六神丸（10粒/支×6支/盒，每1000粒重3.125 g，上海雷允上藥業(yè)，Z20020069）；RNA提取試劑盒（湖南艾科瑞生物，AG21022）。

1.1.4 儀器設(shè)備 BioRad-680多功能酶標(biāo)儀（美國BioRad公司）；Leica Dmi1倒置顯微鏡（德國徠卡公司）；臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；HERAcell240iCO2恒溫培養(yǎng)箱（美國ThermoFisher Scientific公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 取生長狀態(tài)良好的1×106個CT26細(xì)胞制備為0.2 ml單細(xì)胞懸液，皮下接種于小鼠背部近右上肢部位，造模成功后將所有BALB/c小鼠隨機分成3組，每組6只：對照組（Vehicle,0.9%氯化鈉溶液200 μl/d）、奧沙利鉑組（OXA,3 mg/（kg·d））、奧沙利鉑（3 mg/（kg·d））聯(lián)合六神丸（19.2 mg/（kg·d））（LSW+OXA）組，給藥劑量為每只0.2 ml，0.9%氯化鈉溶液和奧沙利鉑通過腹腔注射，六神丸灌胃處理（取六神丸顆粒研缽研細(xì)粉末，隨后加入PBS，超聲處理30 min，混勻器充分混勻，4℃靜置3 h，用0.22 μm微孔濾膜過濾），兩天1次，共三周。培養(yǎng)一周后測量腫瘤體積并開始給藥，治療結(jié)束后通過頸椎脫位法處死小鼠，實驗流程圖見圖1。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

圖1 小鼠實驗流程圖Figure 1 Flow chart of mouse experiment

1.2.2 取材 眼球取血，自然條件下靜置血液使其分層，3 000 r/min低溫離心10 min，取上清液，-80℃凍存用于后續(xù)ELISA實驗。將皮下移植瘤剝離并稱重，脾臟取出后濾紙吸干稱重，計算脾臟指數(shù)。將腫瘤組織一部分置于福爾馬林溶液中用于后續(xù)免疫組織化學(xué)實驗，其余腫瘤組織-80℃凍存用于后續(xù)熒光定量PCR實驗。

1.2.3 熒光定量PCR實驗 將腫瘤組織放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，將組織樣品轉(zhuǎn)移至離心管，加入1 ml TRIzol裂解液，根據(jù)試劑盒說明書中的步驟提取RNA，并完成反轉(zhuǎn)錄：37℃15 min,85℃ 5 s,4℃保存。20 μl PCR反應(yīng)體系（1 μl DNA模板，8 μl dH2O，10 μl的2×Premix，上下游引物各0.5 μl），95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s，45個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實驗 將小鼠血清解凍后，通過鼠源IFN-γ、IL-12P40、IL10和TGF-β的ELISA試劑盒檢測各組不同因子表達(dá)水平。

1.2.5 免疫組織化學(xué)實驗 移植瘤組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，厚度為5 μm。之后脫蠟水化，加入相關(guān)抗體：CD68（ab955，美國Abcam公司），CD206（ab64693,美國Abcam公司）。4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記二抗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine,DAB）顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精對比染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 六神丸對結(jié)腸癌小鼠移植瘤的抑制作用

小鼠給藥三周后，對照組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組的移植瘤體積分別為（1882.30±459.44）、（1148.55±154.23）和（572.15±36.77）mm3；瘤重分別為（4.39±0.53）、（3.29±0.19）和（1.63±0.16）g，見圖2A～B，與對照組相比，六神丸聯(lián)合奧沙利鉑可明顯抑制腫瘤的生長，可降低腫瘤的體積及質(zhì)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0054,P=0.0013）。藥物處理后小鼠體質(zhì)量未明顯降低，同時各組小鼠的相關(guān)血生化指標(biāo)水平之間無明顯差異，一定程度說明藥物處理無明顯不良反應(yīng)，見圖2C～H。

圖2 六神丸對結(jié)腸癌小鼠移植瘤的抑制作用Figure 2 Inhibitory effect of Liu-Shen-Wan on the transplanted tumor of mice with colon cancer

2.2 六神丸對免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

對照組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組的脾臟指數(shù)分別為（4.67±0.52）、（6.48±0.45）和（10.45±0.94）mg/g。與對照組相比，六神丸聯(lián)合奧沙利鉑可明顯提高小鼠的脾臟指數(shù)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0071），見圖3A。對照組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組的血清IFN-γ表達(dá)分別為（112±7.5）、（210±9.5）和（290±10）pg/ml。與對照組相比，六神丸聯(lián)合奧沙利鉑可明顯提高小鼠的血清IFN-γ表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0049），見圖3B。另外對照組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組的血清IL-12P40表達(dá)分別為（110±10）、（240±10）和（380±15）pg/ml。與對照組相比，六神丸聯(lián)合奧沙利鉑可明顯提高小鼠的血清IL-12P40表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0043），見圖3C。這些結(jié)果初步表明六神丸可能具有提高小鼠免疫水平的作用。

圖3 六神丸對免疫相關(guān)指標(biāo)的影響Figure 3 Effects of Liu-Shen-Wan on immune-related indices

2.3 六神丸對M2型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物的影響

對照組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組血清中IL-10的表達(dá)水平分別為（61.60±1.21）、（56.45±2.05）和（32.37±2.75）pg/ml，TGF-β的表達(dá)水平分別為（342.03±10.45）、（308.04±7.32）和（137.42±9.19）pg/ml，與對照組相比，六神丸聯(lián)合奧沙利鉑可明顯降低小鼠血清中的IL-10及TGF-β水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0025,P=0.0046），見圖4A～B；對照組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組的腫瘤組織中IL-10 mRNA相對表達(dá)量分別為1.05±0.04、0.88±0.08和0.62±0.06，TGF-β mRNA相對表達(dá)量分別為1.01±0.06、0.88±0.04和0.52±0.04，聯(lián)合組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0280,P=0.0078），說明六神丸聯(lián)合奧沙利鉑可降低腫瘤組織中IL-10及TGF-β的mRNA水平，見圖4C～D。用CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞，用CD206標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞，免疫組織化學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)對照組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組腫瘤組織中CD68的陽性表達(dá)分別為（19.25±1.25）%、（17.95±0.85）%和（8.5±0.7）%，CD206的陽性表達(dá)分別為（24.1±0.9）%、（22.05±0.85）%和（10.95±0.85）%，聯(lián)合組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0173,P=0.0087），說明六神丸聯(lián)合奧沙利鉑可降低腫瘤組織中CD68及CD206的表達(dá)強度，見圖4E～F。結(jié)果表明六神丸可一定程度降低M2型巨噬細(xì)胞極化水平從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖4 六神丸對M2型巨噬細(xì)胞極化的影響Figure 4 Effect of Liu-Shen-Wan on the polarization of M2 macrophages

3 討論

近年來，惡性腫瘤患病者例數(shù)逐年增加，已經(jīng)成為了一個重大公共衛(wèi)生問題。腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞所處微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞極化可促進(jìn)結(jié)腸癌耐藥發(fā)生[8]。中醫(yī)藥治療是以整體觀念為指導(dǎo)的辨證論治，對結(jié)腸癌的治療展現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢。有研究指出傳統(tǒng)中醫(yī)藥可通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤作用，包括抑制腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)耐藥等[9]。

六神丸作為一個傳統(tǒng)藥物，其組成藥物牛黃清熱解毒，與活血散結(jié)藥麝香配伍，發(fā)揮清熱解毒活血功效。雄黃燥濕化痰，冰片辟濁散火，輔以以毒攻毒蟾酥，佐以解毒生肌珍珠，諸藥合用，共奏清熱解毒、消腫止痛功效，在攻毒方面具有獨特作用。六神丸在臨床上應(yīng)用廣泛，包括抗腫瘤、麻醉、強心、增強免疫、抗炎等[10-12]。梁世霞等研究結(jié)果顯示，六神丸能夠使MMP-9基因表達(dá)水平顯著降低，從而抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，同時還能減緩基質(zhì)降解，進(jìn)一步降低血管通透性[13]。還有學(xué)者指出六神丸在治療食管癌方面的作用主要是通過促進(jìn)癌癥細(xì)胞凋亡以及抑制Bcl-2表達(dá)來實現(xiàn)[14]。此外有研究表明人參半夏湯聯(lián)合六神丸可較好改善Ⅲ、Ⅳ期食管癌患者臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，穩(wěn)定并增加體質(zhì)量，是治療中晚期食管癌的有效方法之一[15]。本研究構(gòu)建了結(jié)腸癌移植瘤小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)六神丸聯(lián)合化療藥物奧沙利鉑可明顯降低小鼠腫瘤體積及腫瘤質(zhì)量，表明其可抑制腫瘤生長。我們進(jìn)一步觀察了其對免疫相關(guān)指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)六神丸聯(lián)合奧沙利鉑可明顯提高小鼠的脾臟指數(shù)水平，同時增強血清中IFN-γ及IL-12P40表達(dá)水平，表明其可一定程度增強小鼠的免疫水平。

腫瘤微環(huán)境中M2型巨噬細(xì)胞極化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。此外有證據(jù)表明，M2型巨噬細(xì)胞的表型和浸潤與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后有關(guān)[16]。巨噬細(xì)胞的表型可塑性為治療提供了新的見解。因此，M2型巨噬細(xì)胞靶向治療有利于提高治療效果和改善患者預(yù)后。目前從腫瘤微環(huán)境角度闡述六神丸對結(jié)直腸癌的作用鮮有報道，本研究發(fā)現(xiàn)六神丸聯(lián)合奧沙利鉑可明顯降低小鼠血清及腫瘤組織中M2型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)因子IL10與TGF-β，同時腫瘤組織中CD68及CD206蛋白表達(dá)水平下降，這些結(jié)果表明六神丸可抑制M2型巨噬細(xì)胞極化。由此表明，六神丸對結(jié)腸癌小鼠移植瘤的抗腫瘤作用與抑制腫瘤微環(huán)境中M2型巨噬細(xì)胞極化密切相關(guān)。本研究方案設(shè)計存在一定的不足之處：動物實驗分組缺乏六神丸單獨給藥組，未能直接地觀察到其抗腫瘤療效及與其他分組之間的療效比較，以及其單獨給藥及與聯(lián)合化療藥后對M2型巨噬細(xì)胞極化的作用；未進(jìn)行體外實驗及臨床試驗進(jìn)一步觀察六神丸對M2型巨噬細(xì)胞極化作用的影響。后續(xù)將進(jìn)一步深入研究六神丸調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞極化進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用的具體機制。