潘冬梅，張心青，楊傳倫，王紅霞，楊丹丹，田杰偉，王秀芝，高保軍，馬春峰，于帥帥，牟文杰

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.京博農(nóng)化科技有限公司，山東 濱州 256500）

血栓性疾病是指血液有形成分在血管內(nèi)形成栓子，造成血管部分或完全堵塞，或是血栓脫落，在隨血流移動(dòng)的過(guò)程中部分或全部堵塞某些血管，造成相應(yīng)部位血液供應(yīng)障礙的一種疾病。血栓性疾病嚴(yán)重威脅人類的生命健康，其發(fā)病率高居各種疾病之首，且近年來(lái)還有漸增之勢(shì)[1]，是當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。

納豆激酶（nattokinase，NK）是由納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶[2]，具有溶解血栓作用，同時(shí)還具有多種作用，KAMIYA S等[3]研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶通過(guò)延長(zhǎng)雌性大鼠血管堵塞時(shí)間，達(dá)到機(jī)體不易形成血栓而預(yù)防血栓的作用[4-5]；HSIA C H等[6]研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶可降低心血管疾病且無(wú)副作用；吳杰忱等[7]研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶可治療高血壓、預(yù)防肢體水腫和深靜脈血栓疾病的發(fā)生；JI H R等[8]研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶可預(yù)防和治療糖尿病及骨質(zhì)疏松疾??；FUJITA M等[9]研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶具有避免大腦局部缺血的作用；KIM W等[10]研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶具有抗菌活性；HSU R L等[11]研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶具有治療阿爾茨海默病的潛在醫(yī)學(xué)作用；除此之外，納豆激酶在工業(yè)上的應(yīng)用也有很多研究，WANG S L等[12]納豆激酶可以用于工業(yè)垃圾的處理；WANG S L等[13-15]研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶可以作為工業(yè)添加劑；NGUYEN T T等[16]顯示納豆激酶作為洗滌劑有顯著效果。目前科學(xué)家研究最多的還是納豆激酶的溶栓特性。

納豆激酶已經(jīng)顯示出巨大的應(yīng)用前景，但是納豆激酶目前的發(fā)酵水平不高，造成以納豆激酶為主要成分的產(chǎn)品價(jià)格昂貴，限制了其應(yīng)用。發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化對(duì)提高納豆激酶產(chǎn)量、降低發(fā)酵生產(chǎn)成本發(fā)揮著重要作用，高澤鑫[17]采用高酶活菌株GUJN05固態(tài)發(fā)酵36 h后的納豆激酶活力達(dá)到（141.97±0.64）FU/g，相比KIM J Y等[18]報(bào)道的20～80歲高血壓患者口服納豆激酶膠囊（2 000 FU/d）8周后，舒張壓和收縮壓均較對(duì)照組（服用安慰劑）明顯降低，成品制備所需納豆激酶活力還有一定差距。因此，提高納豆激酶的發(fā)酵水平是當(dāng)前納豆激酶研究領(lǐng)域中亟待解決的問(wèn)題。

本研究在單因素試驗(yàn)優(yōu)化納豆激酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵液納豆激酶活力為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，以期提高酶活，為實(shí)現(xiàn)納豆激酶的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌種

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）：由本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、甘油、無(wú)水氯化鈣、七水硫酸鎂、十二水磷酸氫二鈉、無(wú)水磷酸二氫鉀、L-甲硫氨酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.00 g/L，牛肉膏3.00 g/L，氯化鈉5.00 g/L。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖20.00 g/L，胰蛋白胨20.00 g/L，無(wú)水氯化鈣0.10 g/L，七水硫酸鎂0.60 g/L，十二水磷酸氫二鈉4.00 g/L，無(wú)水磷酸二氫鉀1.00 g/L。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)：科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司；SW-CJ-1FB超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

挑取1環(huán)納豆芽孢桿菌菌株的新鮮斜面接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h（OD600nm值=1.5～1.6）。

1.3.2 發(fā)酵方法

將種子液按5%接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)96 h后，發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min后，取上清液用于納豆激酶活力的測(cè)定。

1.3.3 納豆激酶活力的測(cè)定

采用紫外分光光度法測(cè)定納豆激酶活力[17]，向試管中加入1.4 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 7.8）緩沖液和0.4 mL纖維蛋白原溶液（7.2 mg/mL），37 ℃溫育5 min后加入0.1 mL凝血酶（20 U/mL），再37 ℃溫育10 min形成人工血栓，加入0.1 mL的待測(cè)樣品，37 ℃溫育60 min，加入2 mL三氯乙酸（0.2 mol/L）溶液靜置20 min終止反應(yīng)，13 000 r/min離心10 min，取上清液于275 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。酶活定義：每分鐘波長(zhǎng)275 nm處吸光度值增加0.01所需要的酶量定義為1個(gè)單位（FU）的纖維蛋白降解酶活力。

1.3.4 培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）單因素試驗(yàn)

碳源對(duì)納豆激酶活力的影響：在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別以20.00 g/L的蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘油為唯一碳源，種子液按5%接種，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)96h后測(cè)定納豆激酶活力，并改變篩選碳源添加量（10.00g/L、20.00 g/L、30.00 g/L、40.00 g/L、50.00 g/L、60.00 g/L）繼續(xù)培養(yǎng)，以確定發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源種類及最佳添加量。

氮源對(duì)納豆激酶活力的影響：在最優(yōu)碳源的基礎(chǔ)上，在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別以20.00 g/L的胰蛋白胨、豆粕粉、酵母粉、魚(yú)粉、玉米漿干粉為唯一氮源，種子液按5%接種，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)96 h后測(cè)定納豆激酶活力，并改變篩選氮源添加量（10.00 g/L、20.00 g/L、30.00 g/L、40.00 g/L、50.00 g/L）繼續(xù)培養(yǎng)，以確定發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源種類及最佳添加量。

無(wú)機(jī)鹽對(duì)納豆激酶活力的影響：以不加無(wú)機(jī)鹽為對(duì)照，在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別添加0.10 g/L的無(wú)水氯化鈣、七水硫酸鎂、七水硫酸鋅、七水硫酸亞鐵、五水硫酸銅、十二水磷酸氫二鈉、無(wú)水磷酸二氫鉀，種子液按5%接種，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)96 h后測(cè)定納豆激酶活力，并改變篩選無(wú)機(jī)鹽添加量繼續(xù)培養(yǎng)，以確定發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽種類及最佳添加量。

氨基酸對(duì)納豆激酶活力的影響：以不加氨基酸為對(duì)照，在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別添加0.10 g/L的酪氨酸、半胱氨酸、L-甲硫氨酸、谷氨酸、色氨酸，種子液按5%接種，37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)96 h后測(cè)定納豆激酶活力，并改變篩選氨基酸添加量（0.10 g/L、0.20 g/L、0.30 g/L、0.40 g/L、0.50 g/L）繼續(xù)培養(yǎng)，以確定發(fā)酵培養(yǎng)基中氨基酸種類及最佳添加量。

（2）Plackett-Burman試驗(yàn)[19]

將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的7個(gè)組分作為影響因素進(jìn)行全面考察，選擇11個(gè)因子及試驗(yàn)次數(shù)N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)際變量包括A（甘油）、B（豆粕粉）、C（無(wú)水氯化鈣）、D（十二水磷酸氫二鈉）、E（無(wú)水磷酸二氫鉀）、F（七水硫酸鎂）、G（L-甲硫氨酸），H、J、K、L作為4個(gè)虛擬變量以估計(jì)試驗(yàn)誤差，每個(gè)因素取高低2個(gè)水平（表1），每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)取平均值。

表1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design for medium formula optimziation

續(xù)表

（3）最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡法以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定步長(zhǎng)長(zhǎng)短，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域[20]。根據(jù)（2）Plackett-Burman篩選的顯著性影響因素，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

（4）響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面分析法確定最佳培養(yǎng)基配方：以爬坡試驗(yàn)結(jié)果確定因素取值進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)（表2），用軟件Design-Expert 8.0.6對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行回歸分析[21]，得出響應(yīng)面分析結(jié)果，進(jìn)而確定最佳培養(yǎng)組分含量，最后依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖。

表2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experimental design for medium formula optimziation

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，采用Excel 2016進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 碳源對(duì)納豆激酶活力的影響

碳源對(duì)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖1。

圖1 碳源對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.1 Effects of carbon sources on nattokinase activity

由圖1可知，不同碳源對(duì)納豆激酶活力的影響為甘油＞葡萄糖＞蔗糖＞麥芽糖＞乳糖，以甘油為發(fā)酵培養(yǎng)基唯一碳源時(shí)納豆激酶活力最高為1 127 FU/mL，所以發(fā)酵培養(yǎng)基碳源選擇甘油。不同甘油添加量對(duì)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖2。

圖2 甘油添加量對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.2 Effects of glycerol addition on nattokinase activity

由圖2可知，納豆激酶活力隨著甘油添加量的增加而先上升后下降，甘油添加量為50.00 g/L時(shí)納豆激酶活力最高，為1 512 FU/mL，故選擇發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為50.00 g/L的甘油。

2.1.2 氮源對(duì)納豆激酶活力的影響

不同氮源對(duì)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖3。

圖3 氮源對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on nattokinase activity

由圖3可知，不同氮源對(duì)納豆激酶活力的影響為豆粕粉＞玉米漿干粉＞魚(yú)粉＞胰蛋白胨＞酵母粉，豆粕粉為發(fā)酵培養(yǎng)基唯一氮源時(shí)，納豆激酶活力最高1 786 FU/mL，所以選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為豆粕粉；考察不同豆粕粉添加量對(duì)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，納豆激酶活力隨著豆粕粉添加量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，添加量為30.00 g/L時(shí)納豆激酶活力最高，為1 885 FU/mL，故選擇發(fā)酵培養(yǎng)基氮源為30.00 g/L的豆粕粉。

圖4 豆粕粉添加量對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.4 Effects of soybean meal addition on nattokinase activity

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)納豆激酶活力的影響

不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)納豆激酶活力的影響為無(wú)水氯化鈣、七水硫酸鎂、十二水磷酸氫二鈉、無(wú)水磷酸二氫鉀促進(jìn)了納豆激酶活力，七水硫酸鋅、七水硫酸亞鐵、五水硫酸銅抑制了納豆激酶活力。

圖5 無(wú)機(jī)鹽對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.5 Effects of inorganic salts on nattokinase activity

選擇對(duì)納豆激酶活力有促進(jìn)作用的無(wú)機(jī)鹽：無(wú)水氯化鈣、七水硫酸鎂、十二水磷酸氫二鈉、無(wú)水磷酸二氫鉀逐個(gè)進(jìn)行添加量試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同無(wú)機(jī)鹽添加量對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.6 Effects of inorganic salt addition on nattokinase activity

由圖6可知，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中各無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量濃度為無(wú)水氯化鈣0.20 g/L、七水硫酸鎂0.80 g/L、十二水磷酸氫二鈉3.00 g/L、無(wú)水磷酸二氫鉀1.00 g/L。

2.1.4 氨基酸對(duì)納豆激酶活力的影響

不同氨基酸對(duì)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖7。由圖7可知，L-甲硫氨酸、谷氨酸促進(jìn)了納豆激酶活力，酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸抑制了納豆激酶活力，發(fā)酵培養(yǎng)基氨基酸選擇促進(jìn)納豆激酶活力力度最大的L-甲硫氨酸，納豆激酶活力最高2 101 FU/mL。

圖7 氨基酸對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.7 Effects of amino acids on nattokinase activity

不同添加量的L-甲硫氨酸對(duì)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖8。由圖8可知，隨著L-甲硫氨酸添加量的增加，納豆激酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，添加量為0.2 g/L時(shí)，納豆激酶活力最高為2 165 FU/mL，故選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的氨基酸為0.2 g/L的L-甲硫氨酸。

圖8 L-甲硫氨酸添加量對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.8 Effects of L-methionine addition on nattokinase activity

通過(guò)單因素優(yōu)化試驗(yàn)，得到的納豆激酶發(fā)酵培養(yǎng)基為甘油50.00 g/L、豆粕粉30.00 g/L、無(wú)水氯化鈣0.20 g/L、七水硫酸鎂0.80 g/L、十二水磷酸氫二鈉3.00 g/L、無(wú)水磷酸二氫鉀1.00 g/L、L-甲硫氨酸0.20 g/L。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值（納豆激酶活力R1）見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得到回歸方程（1）。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis results of Plackett-Burman experiments

模型決定系數(shù)R2=0.972 5，模型P值為0.005 7，所得回歸模型極顯著，說(shuō)明模型擬合性良好[22]。表4中P＜0.05為顯著影響因子，發(fā)酵培養(yǎng)基組分對(duì)納豆激酶活力具有顯著影響的因子依次是B＞C＞A，即豆粕粉＞無(wú)水氯化鈣＞甘油，且3個(gè)因素都表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，濃度可適當(dāng)降低，將豆粕粉、無(wú)水氯化鈣、甘油作為發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的主要因素進(jìn)行爬坡試驗(yàn)，其余因素結(jié)果可參考單因素試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)回歸方程（1）中A、B、C因素估計(jì)系數(shù)的效應(yīng)，依次減小甘油、豆粕粉、無(wú)水氯化鈣的濃度，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)[23]，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，隨著甘油、豆粕粉、無(wú)水氯化鈣濃度逐漸減少，納豆激酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油為42.50 g/L、豆粕粉為24.00 g/L、無(wú)水氯化鈣為0.14 g/L時(shí)，納豆激酶活力達(dá)到最高，為A、B、C因素的最大響應(yīng)值區(qū)域。以表5中試驗(yàn)號(hào)4的因素水平為中心值進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest climb experiments

2.4 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，選擇試驗(yàn)號(hào)4各因素水平作為Box-Behnken中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)點(diǎn)共包括12個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)零點(diǎn)重復(fù)，Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見(jiàn)表6和表7。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

表7 Box-Behnken試驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 7 Regression analysis results of Box-Behnken experiments

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)中心組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到納豆激酶活力（R2）對(duì)甘油（A）、豆粕粉（B）、無(wú)水氯化鈣（C）的多元二次回歸方程（2）：

模型決定系數(shù)R2=0.956 1，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.899 7，模型P值為0.000 6，表明模型顯著（P＜0.05），模型可以很好的預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果[24]。由表7可知，因素A、B、C對(duì)納豆激酶活力的線性效應(yīng)均不顯著；因素A2、B2、C2對(duì)納豆激酶活力的線性效應(yīng)均顯著（P＜0.05）；因素A、B之間對(duì)納豆激酶活力的交互影響顯著（P＜0.05），因素A、C和B、C之間對(duì)納豆激酶活力的交互影響不顯著（P＞0.05）。

2.4.2 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)分析

利用Design-Expert 8.0 軟件根據(jù)多元二次回歸方程繪制了相應(yīng)的三維響應(yīng)曲面圖（見(jiàn)圖9）。甘油和豆粕粉對(duì)納豆激酶活力的影響，等高線接近橢圓說(shuō)明兩者交互作用顯著（P＜0.05），甘油和無(wú)水氯化鈣對(duì)納豆激酶活力的影響，等高線接近圓形說(shuō)明兩者交互作用不顯著（P＞0.05），豆粕粉和無(wú)水氯化鈣對(duì)納豆激酶活力的影響，等高線接近圓形說(shuō)明兩者交互作用不顯著（P＞0.05），用該圖對(duì)影響納豆激酶活力的任何兩種因素之間的交互效應(yīng)進(jìn)行分析，進(jìn)而確定因素最佳水平[25]。

圖9 各因素間交互作用對(duì)納豆激酶活力影響的響應(yīng)面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on nattokinase activity

2.5 模型驗(yàn)證

回歸方程（2）對(duì)納豆激酶活力Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)擬合良好，采用Design-Expert 8.0.6軟件分析，當(dāng)培養(yǎng)基甘油添加量43.28 g/L，豆粕粉添加量23.60 g/L，無(wú)水氯化鈣添加量0.14g/L時(shí)，發(fā)酵納豆激酶活力預(yù)測(cè)值為4 242 FU/mL。為了驗(yàn)證納豆激酶活力模型的有效性，同時(shí)為了實(shí)際操作可控，設(shè)置甘油添加量為43 g/L，豆粕粉添加量為24 g/L，無(wú)水氯化鈣添加量為0.14 g/L。在該優(yōu)化條件下進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，納豆激酶活力實(shí)際值為（4 281±103）FU/mL與預(yù)測(cè)值基本一致。利用最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵納豆激酶活力是優(yōu)化前（2 164 FU/mL）的1.97倍。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)，快速有效地從7個(gè)影響納豆激酶含量的因素中篩選出3個(gè)顯著性影響因素：甘油、豆粕粉、無(wú)水氯化鈣，然后利用最陡爬坡試驗(yàn)得到最大響應(yīng)值區(qū)間并用Box-Behnken設(shè)計(jì)得出最佳培養(yǎng)基為：甘油43 g/L，豆粕粉24 g/L，無(wú)水氯化鈣0.14 g/L，七水硫酸鎂0.80 g/L，十二水磷酸氫二鈉3.00 g/L，無(wú)水磷酸二氫鉀1.00 g/L，L-甲硫氨酸0.20 g/L。在最佳培養(yǎng)基組合下，發(fā)酵納豆激酶活力含量達(dá)到（4 281±103）FU/mL，是優(yōu)化前的1.97倍。