王廣慧，魏雅冬，于德涵，張騰霄，王 斌

（綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061）

生物活性肽，也稱(chēng)活性蛋白肽，是指具有生理功能的肽類(lèi)物質(zhì)。其主要的生理功能由氨基酸組成順序決定，是當(dāng)前最被學(xué)術(shù)界熱衷于研究的生物功能因子之一，極具發(fā)展前景[1]。微生物發(fā)酵法是獲得生物活性肽的常用方法，它是利用微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中所產(chǎn)生的蛋白酶將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成具備生物活性的小分子肽的方法，由于微生物自身產(chǎn)生的蛋白酶種類(lèi)豐富，因此，可獲得更多種類(lèi)的活性肽[2]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin convening enzyme，ACE）是存在于人體組織、血漿及肺部中的一種糖蛋白，對(duì)血壓起調(diào)節(jié)作用。ACE過(guò)多會(huì)引起人體血壓升高。ACE抑制肽是一類(lèi)能夠抑制ACE活性，控制和降低血壓的短肽[3-6]。

金針菇（Flammulina velutipes）又名絨毛柄金錢(qián)菌，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，還具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、提高身體免疫力等作用[7-10]，是廣為人知的藥食兩用菌[11-12]。金針菇蛋白質(zhì)含量高，是活性肽開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的極好原料[13]。但目前學(xué)術(shù)界尚未見(jiàn)有關(guān)于利用發(fā)酵法制備金針菇ACE抑制肽的報(bào)道，因此，本研究選擇利用益生菌發(fā)酵法制備金針菇ACE抑制肽。試驗(yàn)以ACE抑制率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和黑曲霉（Aspergillus niger）三種益生菌進(jìn)行了篩選[14-15]，并優(yōu)選出沉淀分離活性肽的最適pH，然后采用單因素和響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，最后采用超濾法對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行了分級(jí)分離和活性比較，以期為金針菇ACE抑制肽的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇：購(gòu)自黑龍江省綏化市北林區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）：由綏化學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）和N-馬尿酰-L-組氨酰-L-亮氨酸水合物（N-Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine，HHL）（均為優(yōu)級(jí)純）：美國(guó)Sigma公司；牛肉膏和蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硼酸、硼砂、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、乙酸乙酯等（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

菌種活化用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基及查氏培養(yǎng)基配方參見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。

1.2 儀器與設(shè)備

LX-100型立式壓力蒸汽滅菌器：深圳良誼實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；JR-750A型萬(wàn)能粉碎機(jī)：浙江金華永康市云達(dá)機(jī)械設(shè)備廠；GZX-9030 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；TGL-20bR型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHA-B型水浴恒溫振蕩器：上海新乘儀器設(shè)備有限公司；pHS-3C型酸度計(jì)：上海雷磁儀器有限公司；超濾離心管（截留分子質(zhì)量分別為3 kDa和10 kDa）：美國(guó)Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制率的測(cè)定

將6μL金針菇活性肽與2μL0.1U/mL的ACE（用0.1mol/L含0.3 mol/L NaCl的硼酸鹽緩沖液（pH8.3）溶解而成）混合，37 ℃預(yù)溫育5 min后混合10 μL的5 mol/L馬尿酰-組氨酰-亮氨酸溶液（用0.1 mol/L含0.3 mol/L NaCl的硼酸鹽緩沖液（pH8.3）溶解而成），混合物于37 ℃溫育30 min，80 ℃加熱10 min終止反應(yīng)。再加入0.24 mL乙酸乙酯并振蕩15 s，3 000 r/min離心10 min，吸取0.2 mL上層反應(yīng)液，在95 ℃熱蒸發(fā)10 min。

將含有馬尿酸的殘余物溶解在2.5 mL去離子水中，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)228 nm處測(cè)量溶液的吸光度值A(chǔ)1[17-19]。以0.1 mol/L含0.3 mol/L NaCl的硼酸鹽緩沖液代替金針菇活性肽，其余組分的添加量不變，所測(cè)吸光度值為A0。以0.1 mol/L含0.3 mol/L NaCl的硼酸鹽緩沖液代替ACE，其余組分的添加量不變，測(cè)金針菇活性肽的本底吸光度值A(chǔ)2。每組測(cè)3次，取平均值。ACE抑制率計(jì)算公式如下：

1.3.2 沉淀分離發(fā)酵液中的活性肽

采用酸度計(jì)在pH3、4、5、6、7、8、9進(jìn)行測(cè)試（利用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)pH值），分別測(cè)定在各pH所獲得的金針菇活性肽沉淀物的ACE 抑制率，篩選出最適合沉淀ACE抑制肽的pH值。

1.3.3 益生菌的篩選

利用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、黑曲霉菌進(jìn)行篩選，選出能在金針菇發(fā)酵過(guò)程中高效降解金針菇蛋白質(zhì)產(chǎn)生ACE抑制肽的菌株。

菌種活化：將裝有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的錐形瓶滅菌后接入枯草芽孢桿菌，然后放置在水浴恒溫振蕩器中，于37 ℃以120 r/min培養(yǎng)約20 h，取菌懸液于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定，當(dāng)OD值為0.1時(shí)停止培養(yǎng)，此時(shí)菌體濃度約為1×106～1×107CFU/mL。釀酒酵母用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基于28 ℃、120 r/min振搖培養(yǎng)30 h；黑曲霉用查氏培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)3 d，至孢子成熟后用無(wú)菌水制成孢子懸液。適當(dāng)稀釋使釀酒酵母菌體濃度和黑曲霉孢子濃度約為1×108CFU/mL（采用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法）[20]。

準(zhǔn)確稱(chēng)取金針菇干粉（由洗凈的金針菇子實(shí)體于50 ℃烘干后用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎并過(guò)80目篩制得）40 g和蔗糖3 g，加入500 mL錐形瓶中，同時(shí)加入150 mL蒸餾水，充分混勻后，121 ℃滅菌20 min。將活化好的三種菌的菌懸液或孢子懸液2 mL接種至金針菇固體培養(yǎng)基中，均勻混合后放置在32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵72 h。之后轉(zhuǎn)移至45 ℃干燥箱中干燥24 h，加入蒸餾水，充分混合，離心，取上清液，利用上述的沉淀法獲取金針菇ACE抑制肽，將沉淀用蒸餾水復(fù)溶后測(cè)定肽溶液的ACE抑制率，篩選出所產(chǎn)肽ACE抑制性最強(qiáng)的菌株[21-23]。

1.3.4 金針菇ACE抑制肽制備工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

利用篩選出的菌株按照上述方法制備金針菇ACE抑制肽，同時(shí)考察不同的發(fā)酵條件對(duì)其ACE抑制率的影響。

（1）液料比對(duì)發(fā)酵金針菇產(chǎn)ACE抑制肽的影響

取5份每份為40 g的金針菇干粉，各加蔗糖3 g，按照液料比（蒸餾水體積：金針菇粉質(zhì)量）分別為3.25∶1、3.75∶1、4.25∶1、4.75∶1、5.25∶1（mL∶g）加入蒸餾水。將配制好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基裝入500 mL三角瓶中，32 ℃發(fā)酵48 h。之后的處理方法同上，依次測(cè)定肽的ACE抑制率。

（2）發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵金針菇產(chǎn)ACE抑制肽的影響

取5份40 g金針菇干粉于500 mL三角瓶中，各加蔗糖3 g，當(dāng)液料比取值為3.75∶1（mL∶g），發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)，分別將物料發(fā)酵12 h、24 h、36 h、48 h、72 h。依次測(cè)定肽的ACE抑制率。

（3）發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵金針菇產(chǎn)ACE抑制肽的影響

取5份40 g金針菇干粉于500 mL三角瓶中，各加蔗糖3 g，當(dāng)液料比取值為3.75∶1（mL∶g），發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，將物料分別置于23 ℃、28 ℃、32 ℃、37 ℃、40 ℃條件下培養(yǎng)。依次測(cè)定肽的ACE抑制率。

（4）金針菇粉用量對(duì)發(fā)酵金針菇產(chǎn)ACE抑制肽的影響

當(dāng)液料比取值為3.75∶1（mL∶g），發(fā)酵溫度為32 ℃，發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，金針菇粉用量分別設(shè)定為10 g、20 g、40 g、60 g、80 g于500 mL三角瓶中。依次測(cè)定肽的ACE抑制率。

1.3.5 金針菇ACE抑制肽制備工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，挑選出對(duì)ACE抑制率影響較大的因素，通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面分析，以確定益生菌發(fā)酵法制備金針菇ACE抑制肽的最佳條件[24-27]，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽制備條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for angiotensin converting enzyme inhibitory peptide preparation conditions optimization

1.3.6 ACE抑制肽的分級(jí)分離

將在最適發(fā)酵條件下獲得的金針菇ACE抑制肽用沉淀法分離，然后用蒸餾水復(fù)溶后先經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，再用截留3 kDa和10 kDa兩種分子質(zhì)量的超濾離心管進(jìn)行離心，從而把金針菇ACE抑制肽分離成3個(gè)分子質(zhì)量區(qū)間，即＜3 kDa，3～10 kDa，＞10 kDa。研究不同分子質(zhì)量肽的ACE抑制率。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行分析處理并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌篩選結(jié)果

分別利用三株菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，在金針菇固體培養(yǎng)基中并未見(jiàn)到釀酒酵母的菌落生長(zhǎng)，可見(jiàn)金針菇固體培養(yǎng)基不適合釀酒酵母的生長(zhǎng)，因此將其排除?？莶菅挎邨U菌和黑曲霉發(fā)酵液在不同pH條件下對(duì)ACE抑制率影響的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 枯草芽孢桿菌和黑曲霉發(fā)酵液的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率Table 2 Angiotensin converting enzyme inhibitory rates of fermentation liquid of Bacillus subtilis and Aspergillus niger%

由表2可知，黑曲霉發(fā)酵液的ACE抑制率較低，枯草芽孢桿菌為制備金針菇ACE抑制肽的最佳菌種；最適合沉淀金針菇ACE抑制肽的pH為6。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比對(duì)金針菇肽ACE抑制率的影響

液料比對(duì)金針菇肽ACE抑制率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，金針菇肽ACE抑制率隨液料比的變化呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在液料比4.75∶1（mL∶g）處達(dá)到最大值，可能是由于固態(tài)發(fā)酵時(shí)，物料中水分含量的高低對(duì)微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵影響很大。每一種微生物對(duì)其生長(zhǎng)的物料環(huán)境中的水分含量都有一定的要求。如果環(huán)境中的水分含量過(guò)高，細(xì)胞就會(huì)吸水膨脹，甚至引起細(xì)胞破裂。反之，如果環(huán)境中水分含量過(guò)低，則會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的水分外滲，造成質(zhì)壁分離，使細(xì)胞代謝活動(dòng)受到抑制甚至引起死亡[28]。而微生物的生長(zhǎng)狀態(tài)直接影響到蛋白酶的分泌，從而影響到ACE抑制肽的產(chǎn)生。所以選擇4.75∶1（mL∶g）為最佳液料比。

圖1 液料比對(duì)金針菇肽血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率的影響Fig.1 Effect of liquid-material ratio on angiotensin converting enzyme inhibition rate of Flammulina velutipes peptides

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)金針菇肽ACE抑制率的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)金針菇肽ACE抑制率的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間從12 h延長(zhǎng)至24 h，ACE抑制率增加，并在發(fā)酵24 h時(shí)到達(dá)最大值，超過(guò)24 h后呈下降趨勢(shì)，原因可能是枯草芽孢桿菌在發(fā)酵時(shí)間12～24 h內(nèi)為生長(zhǎng)旺盛期，蛋白酶大量分泌，從而促進(jìn)了ACE抑制肽的積累。而隨著發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，菌體細(xì)胞大量繁殖，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷耗盡，微生物生長(zhǎng)逐漸進(jìn)入衰亡期，造成蛋白酶分泌量減少，從而影響到ACE抑制肽的產(chǎn)生[28]。所以選擇24 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)金針菇肽血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on angiotensin converting enzyme inhibition rate of Flammulina velutipes peptides

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)金針菇肽ACE抑制率的影響

發(fā)酵溫度對(duì)金針菇肽ACE抑制率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，溫度過(guò)低或者過(guò)高都不利于枯草芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵。在溫度逐漸升高至37 ℃的過(guò)程中，ACE抑制率顯著升高。當(dāng)溫度到達(dá)37 ℃時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最大值，但當(dāng)溫度再增高時(shí)，ACE抑制率開(kāi)始下降。原因可能是過(guò)低過(guò)高的溫度都會(huì)影響蛋白酶的活性，從而影響到ACE抑制肽的形成。因此選擇37 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)金針菇肽血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on angiotensin converting enzyme inhibition rate of Flammulina velutipes peptides

2.2.4 金針菇粉用量對(duì)金針菇肽ACE抑制率的影響

金針菇粉用量對(duì)金針菇肽ACE抑制率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，金針菇ACE抑制率隨金針菇粉用量增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，金針菇粉用量為20 g/500 mL時(shí)，ACE抑制率達(dá)到峰值，原因可能是金針菇粉用量適當(dāng)加大，可增加培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物的供給以滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求，但在培養(yǎng)瓶容積和液料比一定的前提下，金針菇粉用量過(guò)多，勢(shì)必引起瓶裝量過(guò)大，導(dǎo)致瓶中供氧量不足，從而影響到菌體的生長(zhǎng)和蛋白酶的分泌以及ACE抑制肽的產(chǎn)生。因此選擇最佳金針菇粉用量為20 g/500 mL。

圖4 金針菇粉用量對(duì)金針菇肽血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率的影響Fig.4 Effect of Flammulina velutipes powder addition on angiotensin converting enzyme inhibition rate of Flammulina velutipes peptides

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以A（液料比）、B（發(fā)酵時(shí)間）、C（發(fā)酵溫度）、D（金針菇粉用量）為自變量，以ACE抑制率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽制備條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of response surface experiments for angiotensin converting enzyme inhibitory peptide preparation conditions optimization

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface tests results

利用軟件Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程為：

由表4可知，模型的P＜0.000 1，表明該回歸方程模型極顯著，且模型失擬項(xiàng)P值=0.085 8＞0.05不顯著，決定系數(shù)R2=0.996 0，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.992 0說(shuō)明模型擬合程度較好，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備金針菇ACE抑制肽的工藝條件。從表4還可以看出A、B、C、D、AB、AD、BD、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)金針菇肽ACE抑制率的影響極顯著（P＜0.001），BC的影響顯著（P＜0.01）。反映各因素對(duì)響應(yīng)值影響的曲面圖見(jiàn)圖5。

從以上6個(gè)曲面圖中可以看出，4個(gè)影響因素的曲面都非常陡，除A、C交互作用影響的曲面圖中等高線(xiàn)近于圓形，從而說(shuō)明A、C兩個(gè)因素交互作用影響不顯著外，另5個(gè)曲面圖中的等高線(xiàn)均為橢圓形，說(shuō)明圖中兩個(gè)因素交互作用影響顯著，又由于等高線(xiàn)通常向影響相對(duì)大的因素軸向聚集，所以綜合來(lái)看，4個(gè)因素的影響程度排序?yàn)锳＞D＞C＞B。

由Design Expert 8.0.6軟件預(yù)測(cè)此工藝的最優(yōu)條件為液料比為5.13∶1（mL∶g）、發(fā)酵時(shí)間為16.19 h、發(fā)酵溫度為36.75 ℃，金針菇用量為35.55 g。在此條件下預(yù)測(cè)金針菇肽的ACE抑制率預(yù)測(cè)值為50.75%。為了實(shí)際操作可行性，將條件修正為液料比為5∶1（mL∶g），發(fā)酵時(shí)間為16 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，金針菇粉用量為35 g/500 mL。為檢驗(yàn)該預(yù)測(cè)條件的可靠性，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到金針菇肽的ACE抑制率實(shí)測(cè)值為（51.25±1.02）%。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值偏差（0.85±0.52）%，表明所建模型與實(shí)際情況高度擬合，此響應(yīng)面法優(yōu)化的枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備金針菇ACE抑制肽的工藝可靠。

2.4 ACE抑制肽分級(jí)分離的結(jié)果

不同分子質(zhì)量區(qū)間肽的ACE抑制率見(jiàn)表5。由表5可知，肽分子質(zhì)量越小，ACE抑制率越高。截留分子質(zhì)量＜3 kDa的肽ACE抑制活性最強(qiáng)。

表5 三個(gè)分子質(zhì)量區(qū)間內(nèi)肽的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率Table 5 Angiotensin converting enzyme inhibition rates of peptides in three molecular mass ranges

3 結(jié)論

該研究對(duì)益生菌發(fā)酵金針菇基質(zhì)制備ACE抑制肽的條件進(jìn)行了優(yōu)化，還對(duì)金針菇ACE抑制肽進(jìn)行了分級(jí)分離和活性比較。試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌為最適發(fā)酵菌種；沉淀法分離ACE抑制肽的最適pH為6；最佳發(fā)酵條件為液料比5∶1（mL∶g），發(fā)酵時(shí)間16 h，發(fā)酵溫度37 ℃，金針菇用量35 g/500 mL，在此條件下得到金針菇ACE抑制肽的ACE抑制率為（51.25±1.02）%。截留分子質(zhì)量＜3 kDa的肽ACE抑制活性最強(qiáng)。此研究成果將為金針菇的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用，尤其是在ACE抑制肽領(lǐng)域的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。在下一步的工作中，本課題組將擴(kuò)大益生菌的篩選范圍，并對(duì)沉淀法分離ACE抑制肽的pH篩選范圍進(jìn)一步細(xì)化，還將重點(diǎn)對(duì)截留分子質(zhì)量＜3 kDa的金針菇ACE抑制肽的相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步的分析鑒定。