張傳旭，張 藝，宮田潤，韓靖昱，胡大偉，董 琛，*

（1.山東體育學(xué)院 運動營養(yǎng)與智慧配餐實驗室，山東 濟(jì)南 250102；2.山東體育學(xué)院 健康服務(wù)與管理教研室，山東 濟(jì)南 250102；3.北京航空航天大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191）

長期高頻度大量飲酒會引起人體腸道微生物的紊亂，并增加患病風(fēng)險[1-2]。腸道作為人體最重要的菌庫之一，其微生物多樣性是評價健康與否的重要指標(biāo)。酒精對細(xì)菌直接的毒副作用、改變腸道的應(yīng)激反應(yīng)和提供乙醇作為細(xì)菌代謝底物等方式易導(dǎo)致腸道微生物菌群失調(diào)，影響營養(yǎng)吸收效率[3-4]。與體外環(huán)境相比，腸道中可供微生物生長的基質(zhì)無論從種類還是數(shù)量上來看，都是有限的。腸道內(nèi)分泌消化液，其消化是食物消化吸收最重要的環(huán)節(jié)。與體外環(huán)境相比，腸道中可供微生物生長的基質(zhì)無論從種類還是數(shù)量上來看，都是有限的。根據(jù)生態(tài)學(xué)中著名的競爭排斥原理，同一營養(yǎng)級上生物的種類數(shù)目不能多于可利用底物的數(shù)目，否則會產(chǎn)生劇烈的競爭排斥，直到不多于底物數(shù)目的優(yōu)勢種類經(jīng)生態(tài)位分化后，可以最終共存不可能形成和維持生物多樣性[5]。在已有研究基礎(chǔ)上，盡管在酒精刺激下，腸道中發(fā)現(xiàn)了微生物多樣性演替變化的現(xiàn)象，但是其形成和維持背后的演替動力學(xué)機(jī)制目前仍然沒有得到合理的解釋[6]。本研究選擇了人體腸道最常見的糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、羅氏菌屬（Roseburia）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和布勞特氏菌屬（Blautia）5個菌屬，比較它們在有、無長期飲酒干預(yù)下的相對豐度等數(shù)據(jù)，通過系統(tǒng)動力學(xué)的方法建立了隨機(jī)微分方程組描述微生物演替的動力學(xué)機(jī)制，利用大量的Monte Carlo仿真實驗證實了結(jié)果和模型的有效性，為提高飲酒健康建立堅實的營養(yǎng)學(xué)、生理學(xué)基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 對象

本研究的腸道微生物樣本來自山東省的40名志愿者，長期飲酒組和空白對照組各20名，年齡在30～40歲之間。長期飲酒判斷標(biāo)準(zhǔn)：飲酒史超過3年，平均每周超過3次，每次飲用酒精量＞30 g，飲用種類為白酒，白酒品牌不限。空白對照組在監(jiān)測期內(nèi)禁止飲酒。受試者均為漢族，身體強(qiáng)壯，無長期代謝性疾病、無長期吸煙史、無藥物依賴、無毒品成癮史。實驗前，受試者的各項體檢指標(biāo)基本在正常范圍內(nèi)，心理、情緒狀態(tài)良好，無行為障礙，且近1年內(nèi)沒有進(jìn)行過任何其他醫(yī)學(xué)治療。

微生物樣本來自長期飲酒組和空白對照組的新鮮糞便樣本，每隔8～12 d取樣一次。每人每次收集2份相同的糞便，一份用于宏基因組分析，另一份用于實驗室成分分析。針對測試結(jié)果，對腸道中常見的5種菌屬[7-9]，即糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、羅氏菌屬（Roseburia）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和布勞特氏菌屬（Blautia）進(jìn)行了4個月的監(jiān)控。本研究樣本來源于人體糞便，通過了山東體育學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)倫理委員會的審批，并征得了受試志愿者同意。

1.2 微生物的相對豐度和多樣性分析

使用苯酚/三氯甲烷方法進(jìn)行DNA提取，在BGI-SEQ500平臺上進(jìn)行宏基因組學(xué)測序（插入片段350 bp，讀取長度100 bp）。宏基因組裝和預(yù)測、樣本的物種注釋由上海派森諾生物科技有限公司協(xié)助完成。使用DIAMOND軟件將Unigenes與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對（Blastp，e value≤1e-5），共有638 981（63.72%）個基因能夠比對上KEGG數(shù)據(jù)庫，其中，有301 512（30.09%）個基因能夠比對上數(shù)據(jù)庫中的5 111個KEGG ortholog group（KO）。KO的相對豐度是通過使用每個樣品映射上的Reads將每個KO的基因相對豐度相加而確定的[10-11]。為了得到更多的采樣數(shù)據(jù)用于建模、仿真、模型參數(shù)辨識，采用B-樣條插值的方法，生成關(guān)于“時間-數(shù)據(jù)”之間精確的3階B-樣條函數(shù)，保證內(nèi)插預(yù)測是高度精確的。

1.3 數(shù)學(xué)建模與數(shù)值仿真

本研究基于系統(tǒng)動力學(xué)原理和實驗數(shù)據(jù)，建立腸道微生物群落演替的動力學(xué)模型，每一種微生物表示為一個特征參數(shù)向量，因此通過Monte Carlo實驗法，可以生成大量的微生物物種[12]。在MATLAB/Simulink平臺上建立腸道中微生物群落演替的計算機(jī)仿真模型，服從不同正態(tài)分布的隨機(jī)參數(shù)使微生物種群的隨機(jī)波動具有不同的功率譜密度，分別模擬長期飲酒組和空白對照組兩種環(huán)境下微生物群落演替過程中受到的不同程度擾動[13]。

根據(jù)經(jīng)典的種群Lotka-Volterra競爭方程：

從式（0）中可以看出，種內(nèi)競爭強(qiáng)度取決于xixi，而種間競爭強(qiáng)度取決于xixj，而微生物種群波動隨機(jī)過程的自相關(guān)函數(shù)和互相關(guān)函數(shù)的定義分別為：RXX（t1，t2）=E［xi（t1）xi（t2）］和RXY（t1，t2）=E［xi（t1）xj（t2）］，因此當(dāng)種群變化隨機(jī)過程的自相關(guān)函數(shù)RXX與種群之間的互相關(guān)函數(shù)RXY較大時，意味著種內(nèi)和種間競爭強(qiáng)度xixi與xixj較大，這時會有大量的物種被競爭淘汰掉，反之若種群變化隨機(jī)過程的自相關(guān)函數(shù)RXX與種群之間的互相關(guān)函數(shù)RXY較小時，會有大量的物種免于競爭淘汰而共存，從而形成并維持生物多樣性。因此本研究將重點分析在有、無長期飲酒時，這5種菌屬的自相關(guān)和互相關(guān)函數(shù)，以及其中隱含的影響微生物群落演替的動力學(xué)機(jī)制[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物豐度的動態(tài)特征

經(jīng)過周期性的采樣，腸道最常見的5個菌屬分別在長期飲酒組和空白對照組的腸道內(nèi)相對豐度變化不同，同時計算兩個場景微生物群落的Simpson多樣性指數(shù)結(jié)果見圖1?；?種微生物菌屬相對豐度隨機(jī)過程，得到了它們之間分別在長期飲酒組和空白對照組相對豐度的自相關(guān)函數(shù)結(jié)果見圖2。

由圖1可知，由于受到環(huán)境擾動，這5個菌屬的相對豐度都是具有不同統(tǒng)計特征的隨機(jī)過程?？瞻讓φ战M的菌屬相對豐度波動性較大，其Simpson多樣性指數(shù)（S）定義為：

圖1 5種腸道菌屬在長期飲酒組（a）和空白對照組（b）的相對豐度及群落的Simpson指數(shù)（c）Fig.1 Relative abundance of 5 gut microbial in long-term alcohol consumption group (a) and control group (b) and their Simpson indexes (c)

式中：Pi表示第i個物種的數(shù)量與群落總個體數(shù)量之比；n表示群落中物種的數(shù)目，個。

S越小，生物多樣性越高，反之則越低。長期飲酒組人群中的腸道菌群Simpson多樣性指數(shù)高，物種多樣性則小。

由圖2可知，從統(tǒng)計學(xué)角度發(fā)現(xiàn)長期飲酒組（見圖2a）的受試者腸道內(nèi)5種微生物菌屬相對豐度隨機(jī)過程的自相關(guān)函數(shù)都比較小，說明長期飲酒組人體腸道內(nèi)微生物群落中各菌群的數(shù)量基本處于平臺期，群落結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。與之相反，空白對照組（見圖2b）的受試者腸道內(nèi)5種微生物菌屬相對豐度隨機(jī)過程的自相關(guān)函數(shù)都比較大，說明腸道內(nèi)微生物群落中各菌群的數(shù)量未處于平臺期，群落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，更有利于形成多樣性。

圖2 長期飲酒組（a）及空白對照組（b）5種腸道菌屬相對豐度的自相關(guān)函數(shù)Fig.2 Autocorrelation function of relative abundance of 5 gut microbial in long-term alcohol consumption group (a) and control group (b)

從生態(tài)學(xué)的角度來看，腸道中微生物之間主要的生態(tài)關(guān)系是競爭，基于生態(tài)學(xué)著名的Lotka-Volterra競爭方程和隨機(jī)過程理論，各個微生物菌屬的自相關(guān)函數(shù)和它們之間的互相關(guān)函數(shù)可以反應(yīng)出種內(nèi)和種間競爭關(guān)系的強(qiáng)度，兩者數(shù)值越大，意味著種內(nèi)和種間競爭與種群動態(tài)特征的相關(guān)性越強(qiáng)。在得到5種菌屬自相關(guān)函數(shù)后，為研究在不同條件下腸道菌群相互間的影響和群落演替規(guī)律，基于實驗數(shù)據(jù)和菌群豐度得到長期飲酒組和空白對照組相對豐度的互相關(guān)函數(shù)分別見圖3。

由圖3可知，長期飲酒組（見圖3a）人體腸道內(nèi)5種微生物菌屬相對豐度隨機(jī)波動之間的互相關(guān)函數(shù)都比較小，說明受試者腸道內(nèi)微生物群落中各菌群之間存在較弱的相互關(guān)系和相互作用。相反，空白對照組（見圖3b）的受試者腸道內(nèi)5種微生物菌屬相對豐度隨機(jī)過程之間的互相關(guān)函數(shù)都比較大，說明腸道內(nèi)微生物群落中各菌群之間存在較大的相互關(guān)系和相互作用。

空白對照組各個微生物菌屬的自/互相關(guān)函數(shù)比較大、整個微生物群落的Simpson指數(shù)都比較小（圖1和圖3a），說明微生物群落內(nèi)種內(nèi)和種間競爭關(guān)系強(qiáng)，微生物多樣性程度較高。從圖1和圖3b中可以看出，長期飲酒組的情況恰恰相反，這意味著微生物種群的動態(tài)特征基本上與它們的種內(nèi)和種間競爭無關(guān)，微生物多樣性程度較小。

圖3 長期飲酒組（a）及空白對照組（b）5種腸道菌屬之間相對豐度的互相關(guān)函數(shù)Fig.3 Cross-correlation function of relative abundance of 5 gut microbial in long-term alcohol consumption group (a) and control group (b)

2.2 腸道中微生物群落演替過程的系統(tǒng)動力學(xué)解釋

2.2.1 微生物種群生長的速率方程

假設(shè)腸道中有M種不同類型的微生物，有m種不同類型的底物可供微生物群落利用，且滿足M＞m，模擬底物種類缺乏引起將導(dǎo)致競爭排斥的情況。

因此模型的狀態(tài)變量是第i種微生物種群的數(shù)量（xi）和由微生物群落分解大分子有機(jī)物所產(chǎn)生的第k種底物的濃度（Sk），基于微生物學(xué)中經(jīng)典的Monod種群生長方程[15]，因此第i種微生物種群增長的速率（vbi）可以表示為：

式中：μi表示第i種微生物種群的比生長速率；ε1（t）是服從正態(tài)分布的隨機(jī)數(shù)表示環(huán)境擾動對μi的影響；Kik表示第i種微生物種群生長對第k種底物濃度的半飽和常數(shù)。

2.2.2 微生物種內(nèi)和種間競爭的速率方程

根據(jù)經(jīng)典的Lotka-Volterra競爭模型，第i種微生物種內(nèi)競爭的速率方程（vai）可以表示為：

式中：αi表示第i種微生物的種內(nèi)競爭系數(shù)；ε2（t）是服從正態(tài)分布的隨機(jī)數(shù)表示環(huán)境擾動對αi的影響。

類似地，第i種微生物和第j種微生物之間的種間競爭的速率方程（vei）可以表示為：

式中：βij表示第j種微生物對第i種微生物種群生長的種間競爭系數(shù)；ε3（t）是服從正態(tài)分布的隨機(jī)數(shù)表示環(huán)境擾動對βij的影響。

2.2.3 微生物自然代謝速率方程

第i種微生物的自然代謝速率（vdi）可以表示為：

式中：di第i種微生物的自然代謝系數(shù)。

2.2.4 基質(zhì)的生長與消耗速率

第i種微生物分解大分子有機(jī)物，產(chǎn)生第k種底物的速率（vpki）可以表示為[16]：

式中：ci表示第i種微生物的內(nèi)稟分解制造底物的能力；Zi表示底物生產(chǎn)速率對自身種群數(shù)量的半飽和常數(shù)；ε4（t）是服從正態(tài)分布的隨機(jī)數(shù)表示環(huán)境擾動對ci的影響；rk表示腸道的微生物群落制造的所有底物中第k種底物所占的比例。

類似地，第i種微生物在種群生長過程中，消耗的第k種底物的速率（vcki）可以表示為：

式中：γi表示第i種微生物在種群生長過程中，對底物的消耗系數(shù)；ε5（t）是服從正態(tài)分布的隨機(jī)數(shù)表示環(huán)境擾動對γi的影響；hk表示微生物群落消耗的所有底物中第k種底物所占的比例。

2.2.5 腸道微生物群落演替的總動力學(xué)模型

基于以上速率方程，采用自下而上的耦合方法建立腸道微生物群落演替的總動力學(xué)模型，它由M+m個一階非線性常微分方程構(gòu)成的狀態(tài)方程機(jī)理模型：

根據(jù)式（1）、（2）、（3）和（4），第i種微生物種群動態(tài)變化的一階動力學(xué)方程表示為：

根據(jù)式（1）、（5）和（6），第k種底物濃度變化的一階動力學(xué)方程表示為：

因為腸道微生物群落演替模型式（7）和式（8）中的各個參數(shù)都有明確的生物學(xué)意義，它們與微生物的基因型密切相關(guān)，因此第i種微生物可以表示為一個參數(shù)向量［μi，αi，βij，Kik，di，ci，γi，Zi］，而第k種底物可以表示為［rk，hk］，這兩個參數(shù)反映了底物自身及其對微生物的特性。

在腸道微生物群落演替動力學(xué)模型的基礎(chǔ)上，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，通過非線性最小二乘法和遺傳算法對模型中參數(shù)進(jìn)行了有效地辨識，結(jié)果如表1所示。

表1 微生物群落演替動力學(xué)模型中的參數(shù)Table 1 Parameters in microbial community succession dynamics models

續(xù)表

2.3 腸道微生物群落演替過程的Monte Carlo實驗

本研究通過數(shù)學(xué)模型，模擬產(chǎn)生了20～50種微生物，5～15種可直接利用的基質(zhì)，在進(jìn)行數(shù)值仿真之前，根據(jù)本研究問題的復(fù)雜性、求解精度和收斂速度等，對仿真的方法進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)置，結(jié)果見表2。

表2 Monte Carlo仿真實驗的設(shè)置Table 2 Settings of Monte Carlo simulation experiment

由于微生物群落在人體腸道內(nèi)的演替模型（式（7）、式（8））是非線性的，不存在解析解，因此本研究在Matlab/Simulink平臺上建立它的計算機(jī)模型，通過Monte Carlo仿真獲得模型的數(shù)值解，模擬腸道微生物群落的演替過程[17]。當(dāng)模型（式（7）、式（8））中表示環(huán)境擾動的參數(shù)（ε1～ε5）的設(shè)置為表1中較大功率時，得到的結(jié)果見圖4。

圖4 長期飲酒組腸道微生物群落演替的基本模式Fig.4 Basic pattern of gut microbial community succession in long-term alcohol consumption group

由圖4可知，在長期飲酒干預(yù)下，腸道中的微生物種群數(shù)量經(jīng)過一段時間混沌狀態(tài)的瞬態(tài)響應(yīng)后，微生物群落達(dá)到低物種多樣性的穩(wěn)定狀態(tài)，達(dá)到平臺期的微生物種群呈現(xiàn)出穩(wěn)定的弱相關(guān)波動，即波動的自相關(guān)性和互相關(guān)性均大大減小，這說明在瞬態(tài)響應(yīng)過程中，大量的微生物被競爭排斥掉，只有少數(shù)微生物物種可以穩(wěn)定共存[18]。

然而當(dāng)模型（式（7）、式（8）中表示環(huán)境擾動的參數(shù)（ε1～ε5）的設(shè)置為表1中較小功率時，得到結(jié)果見圖5。由圖5可知，空白對照組腸道中的微生物種群數(shù)量一直在正常的環(huán)境背景擾動下，呈現(xiàn)出隨機(jī)波動的特征，微生物群落達(dá)到高物種多樣性的非穩(wěn)定平衡狀態(tài)--周期或非周期波動，達(dá)到平臺期的微生物種群呈現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)的波動，即波動的自相關(guān)性和互相關(guān)性均大大增加，避免了強(qiáng)烈的競爭排斥，可以使大量微生物物種得以穩(wěn)定共存。值得一提的是，通過計算機(jī)仿真充分證明了圖4和圖5呈現(xiàn)的微生物群落在人體腸道中的演替模式是相當(dāng)穩(wěn)健的，它對模型的初始條件和參數(shù)相當(dāng)不敏感，演替模式具有良好的普適性[19]。

圖5 空白對照組微生物群落演替的基本模式Fig.5 Basic pattern of gut microbial community succession in control group

由于對微生物來說長期飲酒是一種逆境因子[20]，根據(jù)對生態(tài)系統(tǒng)擾動的頻率、強(qiáng)度和嚴(yán)重程度，長期飲酒在腸道可以被視作一種對微生物群落的中度擾動[21-23]。生態(tài)學(xué)中的中度擾動假說結(jié)果表明，相比于對生態(tài)系統(tǒng)的低擾動或強(qiáng)擾動，中度擾動下可以有效地對生態(tài)系統(tǒng)的物種產(chǎn)生影響，既不滅絕也不零干擾[13]。從仿真結(jié)果中可以看到，微生物在演替開始時，多個種群幾乎都呈指數(shù)增長，其增長速度決定于它們各自的最大瞬時增長率。然而隨著腸道生態(tài)位真空逐漸被填滿，各個種群實際增長率會越來越小，由于它們各自的增長率、競爭能力和環(huán)境容量不可能完全相同，因此必然會出現(xiàn)這樣一個時刻，此時某些種群的實際增長率已下降為零，而另一些種群卻在繼續(xù)增長，成為優(yōu)勢種，這是競爭過程的轉(zhuǎn)折點，對于優(yōu)勢種來說，它的繼續(xù)增長不僅會強(qiáng)化對衰退種群的競爭排斥作用，而且會使衰退種群的實際增長率為負(fù)值。此時衰退種群已經(jīng)開始下降，而增長種群仍繼續(xù)擴(kuò)大，這樣下去，衰退種群就會走向滅絕，產(chǎn)生劇烈地競爭排斥現(xiàn)象，最后只有少數(shù)的優(yōu)勢種可以共存，大多數(shù)菌種都滅絕掉，無法形成與維持腸道微生物的多樣性。

從統(tǒng)計學(xué)角度來看，腸道的微生物種群動態(tài)可以看作是一個隨機(jī)過程。根據(jù)隨機(jī)過程原理，如果對某一隨機(jī)過程進(jìn)行一次長時間的觀測和記錄，那么從這些時間序列的數(shù)據(jù)中，就可以得到該隨機(jī)過程精確的統(tǒng)計特征，如過程的均值、方差、自相關(guān)和互相關(guān)函數(shù)，以及功率譜密度等。因此，觀測和記錄這5個菌屬的相對豐度動態(tài)，4個月的監(jiān)控是一個足夠長的時間，在實驗期間菌屬的相對豐度動態(tài)可以遍歷它所有可能的相對豐度值，所獲得的時間序列可以精確地得到它們動態(tài)隨機(jī)過程的統(tǒng)計特征[25]。

3 結(jié)論

本研究在微生物生態(tài)學(xué)理論、實驗數(shù)據(jù)和觀測現(xiàn)象的基礎(chǔ)上，對長期飲酒者腸道微生物多樣性形成和維持機(jī)制進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)作為中度擾動因子，長期飲酒可以有效地加強(qiáng)微生物的隨機(jī)生長響應(yīng)，并伴隨著強(qiáng)烈的微生物種內(nèi)和種間競爭隨機(jī)過程、基質(zhì)的生產(chǎn)和消耗隨機(jī)過程，它們有效地減弱了各個微生物種群波動的自相關(guān)性和互相關(guān)性，腸道菌群多樣性降低且有紊亂的趨勢。通過建立具有正態(tài)分布隨機(jī)參數(shù)的系統(tǒng)動力學(xué)模型，在大量的Monte Carlo仿真實驗基礎(chǔ)上確證了研究結(jié)果。腸道內(nèi)得到的微生物群落演替模式具有魯棒性的，即它對模型的初值始和參數(shù)不敏感，所得到的微生物演替模式具有相當(dāng)?shù)钠者m性。本研究為理解飲酒對腸道微生物的生態(tài)學(xué)效應(yīng)提供了理論基礎(chǔ)，同時為酒精攝入性疾病防控建立科學(xué)依據(jù)。