喬 丹，楊 濤，艾麗菲熱·庫爾班江，龔婭軍，陳衛(wèi)林，張珍珍

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

‘小芒森’（Petit Manseng），又稱小滿勝、佩特蒙森，在眾多的釀酒葡萄品種之中，‘小芒森’成熟期晚，掛果時(shí)間長，是一種高糖、高酸的釀酒葡萄品種，是釀造天然甜酒的理想品種[1-2]。一般認(rèn)為，來源于釀酒果實(shí)的品種香帶有明顯的品種和產(chǎn)地特征，這都決定著葡萄酒的風(fēng)格，品種香又根據(jù)其代謝路徑分為源于脂肪酸的C6/C9化合物、源于異戊二烯的萜烯類和降異戊二烯類化合物，以及源于氨基酸的芳香族類和甲氧基吡嗪等[3-5]。有研究表明，香氣化合物主要存在葡萄果實(shí)內(nèi)表皮中，在葡萄果實(shí)成熟階段會受到成熟進(jìn)程的調(diào)控[6-8]。

目前‘小芒森’在我國的膠東半島產(chǎn)區(qū)已有種植，其在該地區(qū)的品質(zhì)表現(xiàn)已有報(bào)道[1-2，9]。而‘小芒森’引種到新疆天山北麓產(chǎn)區(qū)的時(shí)間不長，目前只在五家渠中糧長城和瑪納斯中信國安葡萄酒業(yè)有限公司葡萄種植基地種植，眾所周知，新疆天山北麓產(chǎn)區(qū)的氣候特征明顯區(qū)別于其他產(chǎn)區(qū)，如日照時(shí)間長、降雨量少、晝夜溫差大等[10-11]，這些因素都會影響葡萄果實(shí)的成熟進(jìn)程，進(jìn)而影響葡萄果實(shí)的品質(zhì)[12-13]，主要包括顏色和香氣品質(zhì)[13-16]。任瑞華等[17]研究發(fā)現(xiàn)，以‘小芒森’為試材，從花后30 d開始直至完全成熟進(jìn)行采樣，其可溶性固形物含量和pH隨著果實(shí)生長逐漸增大，而可滴定酸、總酚和總單寧含量呈降低趨勢。周鵬輝等[9]研究發(fā)現(xiàn)，小芒森在蓬萊產(chǎn)區(qū)適宜的采收期是在葡萄果實(shí)糖度達(dá)到290 g/L以上，總酸在9 g/L左右，此外如果氣候條件允許，繼續(xù)推遲采收，果粒開始萎縮，出汁率下降，導(dǎo)致總糖上升，其香氣成分也將發(fā)生變化。目前關(guān)于新疆地區(qū)‘小芒森’葡萄果實(shí)品質(zhì)特性研究的報(bào)道很少。

本研究以新疆天山北麓產(chǎn)區(qū)這一特定地域環(huán)境下的‘小芒森’葡萄品種為研究對象，分別測定五家渠和瑪納斯地區(qū)葡萄果實(shí)生長過程中的理化指標(biāo)，通過頂空固相微萃?。╤eadspace solidphase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)檢測其香氣物質(zhì)的組成及含量，并采用偏最小二乘法-判別分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）判斷果實(shí)香氣物質(zhì)組成及含量差異，以期為‘小芒森’葡萄品種的栽培提供一定參考，進(jìn)一步為更好地發(fā)揮其在新疆地區(qū)的利用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘小芒森’釀酒葡萄果實(shí)均來源于天山北麓產(chǎn)區(qū)?！∶⑸咸眩何寮仪屑Z長城葡萄種植基地，樹齡為12年，畝產(chǎn)800 kg?！∶⑸咸眩含敿{斯中信國安葡萄種植基地，樹齡為8年，畝產(chǎn)600 kg。兩地區(qū)都采用南北走向，“廠”字型架勢的種植模式。采樣從盛花期花后第8周開始，每周采樣一次，直至第13周采樣結(jié)束，采樣時(shí)消除邊際效應(yīng)，兼顧陰陽面，葉幕層內(nèi)外和上中下果穗，以及每穗葡萄肩、中、頂部，分散隨機(jī)采取葡萄果實(shí)。新鮮果實(shí)用于測定葡萄果實(shí)理化指標(biāo)，其他用液氮速凍，放到-40 ℃冰箱中待用。

NaCl、NaOH、葡萄糖、二氯甲烷（均為分析純）、二氯甲烷、甲醇（均為色譜純）、4-甲基-2-戊醇（色譜純）：北京化學(xué)試劑公司；D-葡萄糖酸內(nèi)酯、聚乙烯基吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）（純度≥99%）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16A型高速臺式離心機(jī)：北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海星宋科學(xué)儀器有限公司；HZS-H型水浴恒溫振蕩器：上海思爾達(dá)科學(xué)儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵：鄭州華特儀器設(shè)備有限公司；Agilent 7890氣相色譜儀、Agilent 5975B質(zhì)譜儀：美國安捷倫科技公司；聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取頭：北京康林科技有限責(zé)任公司；Cleanert PEP-SPE固相萃取柱（150 mg/6 mL）：天津博納艾杰爾科技有限公司；PAL-2手持折光儀：日本ATAGO公司；JYL-C93T榨汁機(jī)：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄果實(shí)理化指標(biāo)的測定

樣品預(yù)處理：50 g葡萄果實(shí)破碎后擠汁，8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液。采用手持折光儀測定可溶性固形物含量；采用酸堿滴定法測定可滴定酸含量。

1.3.2 葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)的提取

參照楊曉帆[14]的頂空固相微萃?。℉S-SPME）方法提取葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)。100 g葡萄果實(shí)去梗去籽碾碎之后在液氮保護(hù)下加入0.5 gD-葡萄糖酸內(nèi)酯和2 g聚乙烯基聚吡咯烷酮，用打粉機(jī)打成粉末裝入50mL離心管中放入4℃冰箱內(nèi)靜置浸提4 h，然后于4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，得到澄清的葡萄汁。之后吸取5 mL葡萄汁于15 mL的樣品瓶中，再加入1 g NaCl和10 μL內(nèi)標(biāo)（4-甲基-2-戊醇，質(zhì)量濃度1.038 8 g/L的水溶液）：將裝有葡萄汁的樣品瓶放置在磁力攪拌加熱臺上于40 ℃下保持30 min，將已活化過的萃取頭插入樣品瓶的頂部，萃取頭與樣品液面保持1 cm距離，在250 ℃的條件下熱解吸8 min，待GC-MS分析[14]。每個(gè)樣品均做3次獨(dú)立的重復(fù)。

1.3.3 葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)的測定

GC-MS分析：葡萄果實(shí)香氣化合物的分析使用氣相色譜-質(zhì)譜儀，載氣為高純氦氣（He）；流速1 mL/min；柱溫箱在50 ℃保持1 min后以3 ℃/min的速度升溫至220 ℃，之后保持5 min；質(zhì)譜接口和離子源的溫度分別為280 ℃和230 ℃，選擇電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍為20～350 u[14，18]。

定性和定量分析：對于已有標(biāo)準(zhǔn)品的香氣物質(zhì)根據(jù)相同色譜條件下該化合物的保留指數(shù)和離子碎片進(jìn)行定性分析[14，18]。以4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標(biāo)物，利用其獲得的相應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程對已有標(biāo)樣的香氣物質(zhì)進(jìn)行定量，利用化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程對沒有標(biāo)樣的香氣物質(zhì)進(jìn)行半定量[14，18]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

本研究采用Microsoft Office Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)及圖表整理；運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；采用Metabo-Analyst（https：//www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟階段‘小芒森’葡萄果實(shí)理化指標(biāo)的測定結(jié)果

‘小芒森’葡萄果實(shí)成熟過程中可溶性固形物和可滴定酸含量測定結(jié)果見圖1。

葡萄果實(shí)中糖分是諸多指標(biāo)的基礎(chǔ)，決定著葡萄酒的酒度[19-20]。有研究認(rèn)為，在干旱和半干旱地區(qū)，較少降雨量以及強(qiáng)光照使果實(shí)糖分迅速積累，成熟速度比其他地區(qū)有所加快，果實(shí)品質(zhì)會受到影響[5，21]。由圖1A可知，五家渠、瑪納斯地區(qū)的‘小芒森’葡萄果實(shí)可溶性固形物含量均隨著果實(shí)成熟呈上升的趨勢。從花后第8周至花后第13周，隨著果實(shí)成熟，瑪納斯地區(qū)葡萄果實(shí)可溶性固形物含量的增長幅度較大，在果實(shí)采收時(shí)，可溶性固形物含量高于五家渠地區(qū)葡萄，達(dá)到了30.10°Bx，五家渠地區(qū)葡萄可溶性固形物含量為27.47°Bx。

葡萄果實(shí)中可滴定酸的含量主要是在綠果期大量積累，隨著果實(shí)的成熟可滴定酸含量逐漸降低。由圖1B可知，可滴定酸含量總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在花后第8周，五家渠、瑪納斯地區(qū)的‘小芒森’葡萄果實(shí)可滴定酸含量均為最高值，其值分別為38.11 g/L、28.93 g/L。在花后13周果實(shí)采收時(shí)，五家渠地區(qū)的為11.91 g/L，瑪納斯地區(qū)葡萄果實(shí)可滴定酸含量為10.67 g/L。

圖1 ‘小芒森’葡萄果實(shí)成熟過程中可溶性固形物（A）和可滴定酸（B）含量測定結(jié)果Fig.1 Determination results of soluble solid (A) and titratable acid (B) contents of 'Petit Manseng' grape fruit during ripening process

2.2 ‘小芒森’葡萄果實(shí)成熟過程中香氣成分分析

‘小芒森’葡萄果實(shí)成熟過程中香氣化合物GC-MS分析結(jié)果見表1。由表1可知，兩地區(qū)葡萄果實(shí)成熟過程中香氣成分共檢出46種，其中，醇類10種，醛類16種，酯類3種，酮類4種，酸類1種，烯類6種，苯類6種。以醛類和醇類為主，并含有少量酯類、酸類、酮類和烯類及苯類物質(zhì)，五家渠地區(qū)‘小芒森’葡萄果實(shí)成熟過程中可檢測到香氣化合物43種，主要包括醇類9種，醛類16種，酯類2種，酮類4種，酸類1種，烯類6種，苯類5種?，敿{斯地區(qū)‘小芒森’葡萄果實(shí)成熟過程中可檢測到香氣化合物42種，包括醇類10種，醛類15種，酯類3種，酮類4種，酸類1種，烯類4種，苯類5種。在花后第13周果實(shí)成熟采收時(shí)，兩地區(qū)共有的香氣成分有35種，香氣物質(zhì)的種類組成差異物質(zhì)11種，包括4-萜烯醇、2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇、乙酸葉醇酯、雙戊烯、1,4-二氯苯、辛醛、E-2,6-壬二醛、鄰甲基苯乙烯、苯乙烯、對二甲苯、1-辛烯-3-酮。

表1 不同地區(qū)‘小芒森’葡萄果實(shí)成熟過程中香氣化合物GC-MS分析結(jié)果Table 1 Results of aroma compounds in 'Petit Manseng' grape fruit in different areas during ripening process analyzed by GC-MS

續(xù)表

續(xù)表

2.3 ‘小芒森’葡萄果實(shí)成熟過程中香氣成分的變化

隨著‘小芒森’葡萄果實(shí)的成熟，兩個(gè)地區(qū)的‘小芒森’葡萄果實(shí)香氣化合物均整體呈現(xiàn)上升的趨勢，花后第13周，五家渠地區(qū)葡萄香氣物質(zhì)總含量為57 749.58 μg/L，瑪納斯地區(qū)明顯低于五家渠地區(qū)，為32 828.59 μg/L。在五家渠地區(qū)，花后第13周葡萄果實(shí)中香氣化合物總含量是花后第8周的3.8倍，而同生長期的瑪納斯地區(qū)的‘小芒森’葡萄果實(shí)香氣化合物含量則是2.9倍，在成熟過程中五家渠地區(qū)的葡萄果實(shí)香氣化合物的積累速率高于瑪納斯地區(qū)。通過監(jiān)測葡萄果實(shí)成熟過程中的可溶性固形物含量發(fā)現(xiàn)，果實(shí)成熟后期（花后12周到花后13周），可溶性固形物含量積累速度雖次于成熟早期（花后8周到花后10周），但是香氣化合物含量一直保持快速積累的狀態(tài)，也有研究發(fā)現(xiàn)，香氣化合物的積累量與果實(shí)成熟度不完全相關(guān)[22-23]。進(jìn)一步對‘小芒森’葡萄果實(shí)中各類香氣成分的變化進(jìn)行具體分析。

2.3.1 醇類物質(zhì)的變化

在瑪納斯地區(qū)，葡萄果實(shí)中10種醇類物質(zhì)均可檢出，隨著果實(shí)成熟，3-己烯-1-醇含量變化整體呈下降的趨勢，而己醇呈先下降后上升的趨勢，花后第13周，其含量分別為5.705 μg/L，282.76 μg/L；在五家渠地區(qū)，花后第8周和第9周未檢出E-2-己烯-1-醇、己醇，花后第11周后未檢出4-萜烯醇，成熟過程中均未檢出2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇；具有清草香的E-2-己烯-1-醇、苯甲醇及己醇含量變化整體呈上升趨勢[24]，花后第13周，這3種物質(zhì)的含量分別為209.042 μg/L、74.448 μg/L、926.613 μg/L。

2.3.2 醛類物質(zhì)的變化

在瑪納斯地區(qū)，花后第11周未檢出辛醛，整個(gè)成熟期未檢出E-2,6-壬二醛；具有綠葉清香的己醛、E-2-己烯醛含量明顯上升[24]，花后第13周，這2種物質(zhì)的含量分別為26 497.742 μg/L、2 997.057 μg/L。在五家渠地區(qū)，花后11周可檢出甜花香的苯乙醛，而己醛、E-2-己烯醛含量明顯上升，花后第13周，這2種物質(zhì)的含量分別為50 653.17 μg/L、3 035.452 μg/L。這些醛類化合物在葡萄酒中主要呈‘綠葉’‘青草’氣味，是由不飽和脂肪酸經(jīng)過脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、脂氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）以及乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）等催化產(chǎn)生[25]，在‘赤霞珠’品種中的含量很高。丁燕等[26]分析了蓬萊產(chǎn)區(qū)的小芒森葡萄果實(shí)中香氣物質(zhì)組成及含量，也發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)是葡萄果實(shí)中檢測出的最豐富的一類物質(zhì)。

2.3.3 酯類物質(zhì)的變化

乙酸葉醇酯含量在果實(shí)成熟過程中整體呈先下降后上升的趨勢，花后第13周，其在瑪納斯地區(qū)葡萄果實(shí)中含量為182.901 μg/L，而其在五家渠地區(qū)葡萄果實(shí)未檢出，它在葡萄酒中主要呈青草香以及香蕉氣味[27]。而在兩個(gè)地區(qū)，甲基丙烯酸己酯和水楊酸甲酯含量變化均不明顯。

2.3.4 酮類物質(zhì)的變化

在瑪納斯地區(qū)葡萄果實(shí)中，1-辛烯-3-酮在花后11周之后未檢出，β-大馬士酮在花后第13周略有降低，含量為9.556 μg/L。而五家渠地區(qū)葡萄果實(shí)中，1-辛烯-3-酮整體呈先升高后下降的趨勢，花后第13周，其含量為8.294 μg/L，β-大馬士酮呈上升趨勢，花后第13周，其含量為12.035 μg/L。這些物質(zhì)主要為葡萄酒貢獻(xiàn)花香和果香，其中β-大馬士酮也是降異戊二烯類香氣化合物中主要的組分[13]。

2.3.5 酸類物質(zhì)的變化

在瑪納斯地區(qū)，葡萄果實(shí)成熟過程中乙酸含量整體呈下降趨勢，花后第13周，其含量為1 582.818 μg/L，而五家渠地區(qū)，乙酸含量在葡萄果實(shí)成熟過程中呈上升趨勢，果實(shí)成熟時(shí)，其含量為1 762.108 μg/L。乙酸在葡萄酒中主要呈刺激、尖酸的氣味，因此，有研究利用本土戴爾有孢圓酵母R12與釀酒酵母NX11424同時(shí)接種和順序接種發(fā)酵，來降低甜型葡萄酒中的乙酸，進(jìn)一步增加其香氣復(fù)雜度[28]。

2.3.6 烯類物質(zhì)的變化

在瑪納斯地區(qū)，Z-4-蒈烯在果實(shí)發(fā)育過程中有所下降，花后第13周，其含量為3.391 μg/L，鄰甲基苯乙烯、苯乙烯未檢出，其他物質(zhì)含量變化不明顯。在五家渠地區(qū)，松油烯、Z-4-蒈烯、鄰甲基苯乙烯在果實(shí)成熟過程中有所下降，此外，雙戊烯在花后11周后葡萄果實(shí)中未檢出。其中，雙戊烯又稱檸檬烯，在葡萄酒中呈現(xiàn)柑桔香、檸檬香[24]。

2.3.7 苯類物質(zhì)的變化

在瑪納斯地區(qū)，乙基苯、鄰-異丙基甲苯的含量在葡萄果實(shí)成熟采收時(shí)有所增加，其他物質(zhì)變化不明顯，對二甲苯未檢出。而在五家渠地區(qū)，乙基苯在葡萄果實(shí)成熟采收時(shí)有所增加，花后第13周，其含量為11.291 μg/L，鄰-異丙基甲苯含量有所下降，1,4-二氯苯在成熟過程中均未檢出。

2.4 ‘小芒森’葡萄香氣成分的偏最小二乘法-判別分析

為了更加直觀反映五家渠和瑪納斯地區(qū)‘小芒森’葡萄成熟過程中果實(shí)香氣物質(zhì)的差異，進(jìn)行了偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），結(jié)果見圖2。由圖2A可知，PLS-DA在提取出來的2個(gè)主成分中，主成分1和主成分2累積方差貢獻(xiàn)率為96.1%，可基本反映出樣品中的香氣物質(zhì)信息，隨果實(shí)成熟，瑪納斯地區(qū)樣品點(diǎn)的分布從X軸的負(fù)半軸向正半軸排列，對于五家渠地區(qū)，雖然其樣品點(diǎn)分布隨果實(shí)成熟未呈現(xiàn)規(guī)律性分布，但部分的樣品點(diǎn)與瑪納斯地區(qū)可以較好地分離。由圖2B可知，通過變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1.0，確定導(dǎo)致兩地區(qū)葡萄果實(shí)組分含量差異的主要物質(zhì)為己醛（b2）、E-2-己烯醛（b4）、乙酸（e1）、己醇（a9）。

圖2 五家渠和瑪納斯地區(qū)‘小芒森’葡萄果實(shí)成熟過程中香氣化合物的偏最小二乘法-判別分析結(jié)果Fig.2 Partial least squares-discriminant analysis results of aroma compounds during ripening process of 'Petit Manseng'grape fruit in Wujiaqu and Manas regions

3 結(jié)論

在新疆天山北麓產(chǎn)區(qū)，持續(xù)的高溫會加快‘小芒森’葡萄果實(shí)的成熟。隨著果實(shí)的成熟，可溶性固形物含量整體呈上升趨勢，而可滴定酸含量呈下降趨勢，香氣化合物總量呈現(xiàn)上升的趨勢。五家渠、瑪納斯地區(qū)葡萄果實(shí)在成熟過程中共檢出香氣物質(zhì)46種，其中，醇類10種，醛類16種，酯類3種，酮類4種，酸類1種，烯類6種，苯類6種，以醛類、醇類物質(zhì)為主。花后第13周，兩地區(qū)葡萄果實(shí)共有香氣成分有35種，通過偏最小二乘法-判別分析發(fā)現(xiàn)，葡萄成熟過程中香氣物質(zhì)的組分含量差異主要在于己醛、E-2-己烯醛、乙酸、己醇。本研究為認(rèn)識新疆天山北麓地區(qū)‘小芒森’葡萄果實(shí)香氣品質(zhì)表現(xiàn)特性提供了依據(jù)，更好地發(fā)揮其在新疆地區(qū)的利用價(jià)值。