張新華，李才偉，張 瑜，黃勝男，石 晗，吳俊楠，任仕杰，劉珂含，高彤璐，史 冰

（1. 海南省生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院, 海南 ?？?570100；2. 海南大學(xué) 計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 海南 ?？?570100）

1 引 言

腫瘤是危害人類(lèi)生命健康的重大疾病，在世界各國(guó)均備受關(guān)注。根據(jù)腫瘤細(xì)胞的不同分子表達(dá)以及細(xì)胞形態(tài)，腫瘤又分為良性與惡性，其中，良性腫瘤并不致病，惡性腫瘤常被稱(chēng)為癌癥。惡性腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)即為病理診斷，其為重大疾病的診斷、預(yù)后和療效評(píng)估提供客觀依據(jù)。傳統(tǒng)的病理診斷依賴(lài)病理醫(yī)生對(duì)病理切片上的細(xì)胞和組織學(xué)病變進(jìn)行閱讀和分析，從而確定腫瘤類(lèi)型[1]。然而，目前病理診斷行業(yè)面臨著病理醫(yī)生數(shù)量少且分布不均、閱片效率低、病理診斷時(shí)間長(zhǎng)、信息傳遞困難等問(wèn)題[2]。

數(shù)字病理（Digital Pathology）將計(jì)算機(jī)、網(wǎng)絡(luò)會(huì)診和病理診斷相結(jié)合，采用技術(shù)手段來(lái)加快和優(yōu)化病理實(shí)驗(yàn)室的工作流程[3]。1980年，數(shù)字病理第一次被應(yīng)用到臨床實(shí)踐中，但是早期數(shù)字病理技術(shù)分辨率低，無(wú)法準(zhǔn)確觀察細(xì)胞及特征[4]。1997年，F(xiàn)urness[5]等人將萬(wàn)維網(wǎng)（World Wide Web,WWW）和數(shù)字病理相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了病理數(shù)據(jù)之間的快速傳輸。2010年，Krupinski[6]等人利用數(shù)字面板（Digital Dashboard）技術(shù)控制病理檢測(cè)系統(tǒng)，改善了檢測(cè)流程，提高了病理診斷效率[7]。近十年，隨著人工智能（Artificial Intelligence, AI）技術(shù)的復(fù)興，基于AI技術(shù)的數(shù)字病理逐步實(shí)現(xiàn)了腫瘤圖像的分割、識(shí)別等。2018年，Niazi[8]等人基于遷移學(xué)習(xí)的Inception v3算法實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌組織中腫瘤細(xì)胞陰性與陽(yáng)性的自動(dòng)識(shí)別。該方法具有很高的靈敏度與特異性。數(shù)字病理從人工閱片轉(zhuǎn)化為計(jì)算機(jī)閱片[9]，該突破有助于計(jì)算機(jī)輔助診斷（Computer Aided Diagnostic, CAD）和遠(yuǎn)程會(huì)診的開(kāi)展，不僅節(jié)省了病理學(xué)家人工診斷的時(shí)間，且避免了主觀誤診、漏診的發(fā)生[10]。同時(shí)，數(shù)字病理解決了時(shí)間和地域原因產(chǎn)生的會(huì)診困難問(wèn)題，提高了病理診斷的準(zhǔn)確性和高效性，有助于醫(yī)療資源更好地合理化分配[11]。

然而，局部病理圖像無(wú)法展示病理組織的全貌。全景數(shù)字病理（Panorama Digital Pathology）技術(shù)通過(guò)對(duì)整張病理切片進(jìn)行邊界重疊的多次掃描采集，并利用快速精準(zhǔn)的圖像拼接技術(shù)實(shí)現(xiàn)了數(shù)字病理的全景成像，即全切片圖像（Whole Slide Imaging, WSI）技術(shù)[12]。早期的WSI技術(shù)可以在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生較高分辨率的數(shù)字圖像，同時(shí)在多倍率及多焦面上進(jìn)行全玻片掃描。但由于成像及圖像處理技術(shù)存在限制，導(dǎo)致全景數(shù)字病理圖像質(zhì)量較差[12-13]。因此，許多研究人員一直致力于全景成像的圖像處理工作。例如，2007年，Ma[14]等人利用Autostitch軟件實(shí)現(xiàn)了小鼠淋巴結(jié)組織的全景成像；2015年，Legesse[15]等人提出基于乘法校正算法，有效解決了全景成像過(guò)程中亮度不均勻問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織的全成像；2022年，Deshpande[16]等人利用SAFRON網(wǎng)絡(luò)模型有效解決了全景圖像處理過(guò)程出現(xiàn)的拼縫和偽影問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了結(jié)直腸癌組織的全景成像。全景數(shù)字病理雖然實(shí)現(xiàn)了全玻片上的整張組織切片（單靶點(diǎn)）成像，但是組織病理的形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)分布復(fù)雜，疾病的診斷需要同時(shí)分析多個(gè)靶點(diǎn)[17-18]。

多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理技術(shù)（Multi-Target Panorama Digital Pathology）可以在單張組織切片上原位檢測(cè)出多種生物標(biāo)記物的表達(dá)水平，借以識(shí)別組織的細(xì)胞表型、功能狀態(tài)及其相互關(guān)系，并給出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)[19]。目前，在多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理系統(tǒng)開(kāi)發(fā)方面，公司的研發(fā)進(jìn)度展現(xiàn)了一定的優(yōu)勢(shì)。Akoya Biosciences、Olympus、Hamamatsu等公司的儀器已經(jīng)投入到基礎(chǔ)、醫(yī)學(xué)研究中。2021年，約翰霍普金斯大學(xué)Janis M. Taube團(tuán) 隊(duì) 利 用Akoya Bioscience公 司的Vectra 3成像系統(tǒng)構(gòu)建多光譜圖像分析平臺(tái)Astro Path，對(duì)接受PD-1抑制劑的黑色素瘤病人進(jìn)行了全景多色數(shù)字病理分析，實(shí)現(xiàn)了黑色素瘤的免疫檢查點(diǎn)抑制劑7種標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和患者生存預(yù)測(cè)[20]。

多靶點(diǎn)全景病理圖像中包含細(xì)胞群體間的“空間信息”，分析這些“空間信息”對(duì)于理解疾病的病理、發(fā)展和預(yù)后至關(guān)重要。本文主要介紹多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理的技術(shù)原理、技術(shù)特點(diǎn)及其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。首先介紹了傳統(tǒng)病理到多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理的發(fā)展過(guò)程。接下來(lái)重點(diǎn)介紹了多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理圖像相關(guān)技術(shù)，涉及組織樣本的準(zhǔn)備、光學(xué)成像以及圖像處理3個(gè)方面的相關(guān)技術(shù)。簡(jiǎn)單介紹了多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理在腫瘤微環(huán)境以及腫瘤分子分型中的相關(guān)應(yīng)用案例。最后，對(duì)多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理的發(fā)展進(jìn)行了總結(jié)與展望。

2 多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理相關(guān)技術(shù)

2.1 樣本準(zhǔn)備

2.1.1 靶點(diǎn)篩選

靶點(diǎn)[21]（生物標(biāo)志物），即在血液、其他體液或組織中發(fā)現(xiàn)的生物分子，可以作為正常（或異常）過(guò)程（或狀況）、疾病的標(biāo)志（如癌癥）。生物標(biāo)記物可以用來(lái)區(qū)分腫瘤的性質(zhì)、確定已診斷癌癥患者的預(yù)后，預(yù)測(cè)疾病發(fā)展等，且已經(jīng)在臨床上廣泛使用。然而，不同疾病或同一疾病不同階段的靶點(diǎn)也不相同（表1）。合適的靶點(diǎn)對(duì)樣本標(biāo)記、定量分析至關(guān)重要，在選擇時(shí)要考慮靶點(diǎn)的功能和表達(dá)部位等。

表1 靶點(diǎn)選擇原則Tab. 1 Target selection principles

2.1.2 組織處理

病理組織切片是組織學(xué)、發(fā)育學(xué)和病理研究的主要實(shí)驗(yàn)方法和重要手段，在科研和臨床診斷實(shí)踐中發(fā)揮著重要作用。組織切片機(jī)的發(fā)明和應(yīng)用允許精確切割具有一致厚度的切片且引起的損傷最小，生產(chǎn)的組織切片可用于多種分析[43]。首先，經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員在手術(shù)病理檢查過(guò)程中進(jìn)行仔細(xì)檢查，選取病變組織進(jìn)行切除。切除下病變組織后立刻送到冰凍切片機(jī)中，加入包埋劑后冰凍，制成冰凍切片進(jìn)行觀察保存。檢查后剩余的冰凍病理組織也可再制成石蠟切片，經(jīng)固定等步驟后觀察保存[44]。

病理組織切片主要包括兩種，石蠟切片和冰凍切片。石蠟切片[45]需將提前確定好的新鮮組織用固定液處理，使組織塊硬化并維持細(xì)胞形態(tài)。接著用乙醇或丙酮等脫水劑去除組織內(nèi)的水分，進(jìn)行浸蠟和包埋，使組織變硬便于切成薄片，最后用石蠟切片機(jī)處理，并置于載玻片中烘干保存[46]。冰凍切片則無(wú)需固定材料，直接取材速凍并加包埋劑，觀察到組織出現(xiàn)白色冰體后使用冰凍切片機(jī)切割即可。制片觀察后需保存于-80 °C冰箱內(nèi)[47]。

2.1.3 組織標(biāo)記

（1）免疫組織化學(xué)/免疫熒光

實(shí)驗(yàn)研究中，為了能夠清楚地觀察到組織或細(xì)胞樣本中的結(jié)構(gòu)特征和成分分布，需要借用熒光基團(tuán)或呈色反應(yīng)定位的染色方式，使目標(biāo)區(qū)域直觀呈現(xiàn)可視化效果。病理診斷研究中使用最廣泛的方法是免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry,IHC）[48]。該方法將酶或熒光基團(tuán)與抗體偶聯(lián)作為標(biāo)記物，能夠在單張病理切片中進(jìn)行某一種蛋白質(zhì)的原位識(shí)別，并定位其分布情況。其中使用的熒光基團(tuán)與抗體偶聯(lián)方法又稱(chēng)為免疫熒光（Immunofluorescence, IF）[49]。IHC/IF可以表征腫瘤免疫微環(huán)境內(nèi)特定的細(xì)胞種類(lèi)、密度和空間分布特征，實(shí)現(xiàn)半定量分析。當(dāng)需要檢測(cè)多種蛋白質(zhì)時(shí)，通常使用多張組織切片，對(duì)每張切片中的每種蛋白質(zhì)單一標(biāo)記，較為依賴(lài)病理學(xué)家的主觀判斷[50]。

常規(guī)的IHC/IF普遍采用間接標(biāo)記方法，其流程如圖1所示。首先，對(duì)樣本上的抗原進(jìn)行預(yù)處理并充分暴露后，選用封閉液將非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉。在基于辣根過(guò)氧化物酶的檢測(cè)系統(tǒng)中，還應(yīng)對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行阻斷，降低非特異性反應(yīng)可能。其次，加入特異性識(shí)別抗原表位的鼠源或兔源的單克隆一抗試劑進(jìn)行孵育。最后，使用抗對(duì)應(yīng)一抗物種來(lái)源的多克隆二抗試劑進(jìn)行孵育，使二抗與一抗結(jié)合[51]。該方法能夠有效放大反應(yīng)信號(hào)，并且基于二抗制備的易得性和通用性可大大降低實(shí)驗(yàn)成本。標(biāo)記完成后，要進(jìn)行復(fù)染和封片操作用于成像觀察和樣本保存。

圖1 常規(guī)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)流程Fig. 1 Conventional immunohistochemistry staining procedures

（2）多重免疫組織化學(xué)/免疫熒光

多重免疫組織化學(xué)/免疫熒光（multiplex Immunohistochemistry/Immunofluorescence, mIHC/IF）[52]

技術(shù)的出現(xiàn)使得免疫細(xì)胞的亞群、豐度、功能狀態(tài)以及它們?cè)谀[瘤微環(huán)境中的空間分布特征等信息更易被量化。該技術(shù)主要是對(duì)一張病理切片上的多種抗原靶點(diǎn)進(jìn)行不同的抗體標(biāo)記。除了酶和熒光基團(tuán)，抗體還能與量子點(diǎn)[53]、DNA條形碼[54]等物質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)。

在mIHC/IF中，單片多重免疫組化連續(xù)染色（Multiplexed Immunohistochemical Consecutive Staining on Single Slide, MICSSS）[55]方法最早被用于組織的多重染色。其單一抗原染色原理和普通IHC一致，區(qū)別在于每次染色后均需要對(duì)組織進(jìn)行化學(xué)洗脫，需要進(jìn)行幾種抗原的標(biāo)記。該方法的問(wèn)題在于,在逐輪的化學(xué)洗脫過(guò)程中，不同抗原信號(hào)可能在洗脫后減弱或者去除，因此還需要對(duì)標(biāo)記流程進(jìn)行優(yōu)化。為了避免信號(hào)的大量損失，以及對(duì)低豐度靶標(biāo)的檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行研究，研究人員提出了基于酪胺信號(hào)放大（Tyramide Signal Amplification, TSA）[56]的間接標(biāo)記法。該方法基于與二抗偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)，在酶催化H2O2過(guò)程中，大量酪胺被激活形成共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)，酪胺上連接著熒光基團(tuán)、顯色染料、生物素等標(biāo)記物，然后與抗原周?chē)陌被釟埢纬衫喂痰墓矁r(jià)鍵，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)數(shù)倍甚至幾何級(jí)倍數(shù)的放大。加熱可以除去抗體并保留共價(jià)結(jié)合的酪胺沉積。其流程如圖2所示。重復(fù)染色操作可以得到多標(biāo)記的病理切片，實(shí)現(xiàn)同時(shí)多色成像。TSA還可以與MCISSS相結(jié)合實(shí)現(xiàn)倍增的多靶點(diǎn)標(biāo)記[57]。

圖2 基于TSA的多重?zé)晒饷庖呓M化流程Fig. 2 Multiplex fluorescent immunohistochemistry based on TSA

（3）染料選擇

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇染料時(shí)應(yīng)考慮理化性質(zhì)、細(xì)胞毒性、色原或熒光強(qiáng)度、穩(wěn)定性等因素。常用的染料有兩種：一種是針對(duì)細(xì)胞器和細(xì)胞區(qū)室的特異性染料，如與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料DAPI[58]；另一種是基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫染色法所需染料，將能夠在成像系統(tǒng)中顯色的物質(zhì)與抗體偶聯(lián)，并通過(guò)間接標(biāo)記的手段來(lái)放大信號(hào)[59]。

明場(chǎng)成像和熒光成像時(shí)的染料選擇方法也各有側(cè)重。選擇明場(chǎng)下可見(jiàn)的染料時(shí)，不需要特定可視化工具和軟件便可評(píng)估，但是進(jìn)行同時(shí)多色成像時(shí)，需要考慮肉眼是否能夠準(zhǔn)確區(qū)分這些顏色。選擇熒光染料時(shí)，應(yīng)考慮以下因素：（i）每種熒光染料具有不同的激發(fā)和發(fā)射光譜，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室擁有的激光器進(jìn)行選擇，并考慮組織自發(fā)熒光帶來(lái)的影響；（ii）同時(shí)多色成像時(shí)，盡量避免所選染料發(fā)射光譜重疊，防止出現(xiàn)光譜串?dāng)_；（iii）盡量避免選擇易光漂白的熒光基團(tuán)或采用抗淬滅劑，光穩(wěn)定性較好的染料包括Alexa Fluor系列[60]、DyLight系列[61]、ATTO系列[62]等。此外，偶聯(lián)抗體的染料在多靶點(diǎn)成像時(shí)需要考慮抗體之間的交叉反應(yīng)。多次復(fù)染時(shí)的循環(huán)洗脫步驟中，需要考慮不同抗原的敏感性和損失程度，從而制定合適的實(shí)驗(yàn)方案。

2.2 光學(xué)成像技術(shù)與設(shè)備

在顯微成像技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的多靶點(diǎn)全景成像技術(shù)，主要包括基于分時(shí)或分光形式的多色成像技術(shù)、基于快速掃描的全景成像技術(shù)以及高通量成像技術(shù)幾類(lèi)。目前，國(guó)內(nèi)外發(fā)展了許多成熟且適合用于多靶點(diǎn)全景成像的光學(xué)成像設(shè)備。下文將主要介紹用于多靶點(diǎn)全景成像技術(shù)的光學(xué)成像技術(shù)與設(shè)備。

2.2.1 關(guān)鍵技術(shù)

（1）多色成像技術(shù)

多色成像主要是利用探針信號(hào)的發(fā)射熒光波長(zhǎng)差異，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同探針的熒光信號(hào)進(jìn)行目標(biāo)區(qū)分。目前常用的多色成像技術(shù)主要有分時(shí)多色、分光多色以及光譜成像幾類(lèi)。

分時(shí)多色成像技術(shù)[63]是通過(guò)依次采集發(fā)射波長(zhǎng)不同的熒光探針信號(hào)，以獲取時(shí)間序列相關(guān)的原始圖像幀。該方法原理簡(jiǎn)單，但由于不同顏色通道圖像的采集時(shí)間存在間隔，難以避免樣品漂移，這需要后期圖像處理的配準(zhǔn)。相比較而言，分光多色成像技術(shù)[64]是采用濾色片組將被同時(shí)激發(fā)的不同探針熒光信號(hào)反射或透射到不同探測(cè)器或同一探測(cè)器的不同區(qū)域以實(shí)現(xiàn)多色成像。該方法雖然解決了分時(shí)成像技術(shù)中的樣本漂移問(wèn)題，但由于信號(hào)發(fā)射光譜分布可能存在頻域上的重疊，使得熒光分子在密度較高、強(qiáng)度差異較大的時(shí)候存在嚴(yán)重的信號(hào)串?dāng)_問(wèn)題。為了避免熒光信號(hào)串?dāng)_問(wèn)題，這兩種多色成像方法通常需要選擇發(fā)射光譜中心間隔遠(yuǎn)的探針進(jìn)行成像，因此，往往只能區(qū)分2 ～ 4種顏色[65]。

然而，數(shù)字病理需要觀察多種細(xì)胞的形態(tài)、功能狀態(tài)并研究他們之間的相互關(guān)系，這需要對(duì)組織進(jìn)行多靶標(biāo)觀察，而2 ～ 4種顏色的多色成像技術(shù)很難滿(mǎn)足數(shù)字病理的多色成像需求。為此，研究人員常采用光譜成像方法來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)多靶標(biāo)的成像。就圖像獲取方式而言，常用的光譜成像方法有掃描式和非掃描式兩類(lèi)；就圖像光譜獲取方式而言，光譜成像又可以分為濾光片光譜解析、干涉儀光譜解析以及棱鏡等色散元件的光譜解析方法[66-68]。例如，Hess研究組[69]利用光學(xué)棱鏡進(jìn)行光譜解析，如圖3所示。在該成像系統(tǒng)中，通過(guò)分光鏡將熒光分為兩路，其中一路圖像記錄熒光分子的位置信息，另一路熒光信號(hào)被棱鏡或光譜相機(jī)進(jìn)行光譜拆分以獲取對(duì)應(yīng)信號(hào)的全光譜信息，最終實(shí)現(xiàn)熒光分子的位置信息和光譜信息的同時(shí)檢測(cè)，并利用光譜信息實(shí)現(xiàn)探針熒光信號(hào)的多重成像[70]。該方法能夠識(shí)別熒光光譜重疊較嚴(yán)重的熒光團(tuán)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)組織樣本上多靶標(biāo)信號(hào)的探測(cè)，很好地解決了傳統(tǒng)分時(shí)和分光多色成像方法中顏色識(shí)別能力不足的問(wèn)題。近年來(lái)，隨著半導(dǎo)體技術(shù)的不斷發(fā)展，各類(lèi)新型快速可調(diào)濾光片器件相繼問(wèn)世，如液晶可調(diào)濾光片（Liquid Crystal Tunable Filter, LCTF）[71]、聲光可調(diào)濾光片（Acousto-Optic Tunable Filter, AOTF）[72]。這些新型濾光片器件正推動(dòng)著光譜成像技術(shù)向圖像獲取速度更快、光譜解析更精細(xì)的方向發(fā)展。另外，隨著光電探測(cè)器制造相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，探測(cè)器量子效率不斷被提高，像素陣列不斷擴(kuò)大，這也讓光譜成像技術(shù)的空間分辨率以及成像速度得到極大提升[73]。

圖3 光譜成像示意圖[68]（F：濾光片；BS：分光鏡；M1/M2/M3：反射鏡；P：色散棱鏡）Fig. 3 Schematic diagram of spectral imaging[68] (F: filter;BS: beam splitter; M1/M2/M3: mirror; P: dispersive prism)

利用光譜成像技術(shù)，Alex等人完成了對(duì)6種不同膜結(jié)合細(xì)胞器的相互作用研究[74]；Janis M.Taube團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了腫瘤免疫療法中6個(gè)標(biāo)記物的多靶標(biāo)全景成像[20]。

（2）全景成像技術(shù)

受限于成像設(shè)備的視場(chǎng)大小，一張全景病理圖像的獲取，需要對(duì)切片上眾多單視場(chǎng)區(qū)域進(jìn)行掃描成像，再根據(jù)各個(gè)視場(chǎng)之間的重疊部分進(jìn)行多視場(chǎng)圖像的融合[75]。其中，全景數(shù)字病理成像技術(shù)中的掃描方式主要有3種（圖4）[76]。

圖4 面掃描和線掃描[77]Fig. 4 Area scanning and line scan[77]

一是基于走停模式的面陣掃描：在成像過(guò)程中，載物臺(tái)帶著切片進(jìn)行走停等待的移動(dòng)操作，移動(dòng)操作中相機(jī)采集每個(gè)區(qū)域的熒光圖像。采用該方法成像時(shí)，每切換一個(gè)成像視場(chǎng)都需要重新對(duì)焦。但是，該方案中每次對(duì)焦都需要花費(fèi)數(shù)秒時(shí)間，而一張大小為15 mm×15 mm的切片一般需要掃描上千個(gè)視場(chǎng)，因此，若采用基于走停模式的面陣掃描至少需要數(shù)十分鐘才能完成一張切片的掃描成像[78]。為解決對(duì)焦時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，研究人員提出了許多改進(jìn)方案[79]，如焦面建模方案。該方案中，研究人員會(huì)預(yù)先選取切片上的部分區(qū)域進(jìn)行焦面探測(cè)并建立模型，在成像時(shí)根據(jù)建模結(jié)果直接對(duì)焦。此方法只需花費(fèi)約150秒就可以實(shí)現(xiàn)一張15 mm×15 mm切片掃描成像[77]。

二是基于線陣掃描的成像方法：將切片劃分成若干相同大小、具有部分重疊的條帶區(qū)域，成像系統(tǒng)根據(jù)焦面建模方案進(jìn)行對(duì)焦；成像過(guò)程中，做勻速運(yùn)動(dòng)的載物臺(tái)帶動(dòng)病理切片在線照明條件下與線陣傳感器同步曝光，以實(shí)現(xiàn)對(duì)條帶區(qū)域掃描成像；掃描完當(dāng)前條帶區(qū)域后移動(dòng)至下一個(gè)條帶，直至全切片掃描完成。在線掃描成像過(guò)程中不需要每個(gè)視場(chǎng)切換的走停等待，且圖像拼接過(guò)程所需的計(jì)算量隨著拼接視場(chǎng)區(qū)域減少而降低，因此成像速度較快[77]。例如濱松公司的Nano Zoomer采用的時(shí)間延遲積分線陣傳感器能夠增強(qiáng)圖像信號(hào)，使得等效的曝光時(shí)間更短，同步掃描速度也更快，在40倍放大倍率下對(duì)15 mm×15 mm的病理切片進(jìn)行成像只需45秒[80]。

三是基于線掃描成像的面陣掃描成像：該方法結(jié)合了以上兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，將切片劃分為若干區(qū)域，在每個(gè)區(qū)域分別采用線掃描進(jìn)行圖像采集。該方法能夠在每個(gè)子區(qū)域進(jìn)行更精確的對(duì)焦操作，同時(shí)解決了走停模式間歇時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，加快了掃描速度。目前，采用此設(shè)計(jì)的掃描成像儀主要有3D histech公司的Pannoramic 250 Flash III系統(tǒng)，該系統(tǒng)在40×放大倍率下對(duì)15 mm×15 mm的切片進(jìn)行成像的耗時(shí)少于60秒[81]。

實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)全景成像的必要前提是將上述多色成像技術(shù)和全景成像技術(shù)相結(jié)合。在上述3種多色成像技術(shù)中，分時(shí)多色方式目前在多色數(shù)字病理檢查設(shè)備中使用較少。利用濾光片組進(jìn)行分光全景多靶點(diǎn)成像技術(shù)不僅需要考慮設(shè)備與染料的組合，通過(guò)降低不同熒光波段的串?dāng)_，以獲得高質(zhì)量圖像；而且需要通過(guò)優(yōu)化濾光片組濾除無(wú)用熒光和不匹配的信號(hào)干擾，降低顏色串?dāng)_。基于光譜成像的全景多靶點(diǎn)成像技術(shù)有多種方法可以實(shí)現(xiàn)分光。例如，基于分段式元件或可調(diào)諧濾光片器件的方法，每次成像只能檢測(cè)單個(gè)波段的信息，采集時(shí)間會(huì)隨著檢測(cè)波段的增加而相應(yīng)增加。目前常用方法是濾光片陣列，即將多波段濾光片組集成到探測(cè)器的傳感單元上，同時(shí)探測(cè)多個(gè)波段信息，但由于濾光片尺寸限制，目前最多只能檢測(cè)4個(gè)成像波段。以上方法都需要考慮以下問(wèn)題：（i）將多色技術(shù)和全景技術(shù)結(jié)合時(shí)，要考慮復(fù)雜光學(xué)系統(tǒng)的搭建；（ii）在成像過(guò)程中需要高精度高速率的控制系統(tǒng)。由于近年來(lái)光學(xué)元器件和現(xiàn)代控制技術(shù)的進(jìn)步，全景多靶點(diǎn)成像技術(shù)通過(guò)對(duì)組織樣品的快速成像，獲得了組織樣本病理信息特征。

（3）高通量成像技術(shù)

實(shí)現(xiàn)病理切片的高通量成像能力，提升病理設(shè)備的應(yīng)用能力，是數(shù)字病理技術(shù)應(yīng)用推廣的關(guān)鍵[77]。為此，許多研究人員針對(duì)提升成像通量的方法進(jìn)行了深入的研究與探索。得益于虛擬顯微鏡技術(shù)[82]和高速自動(dòng)化系統(tǒng)的發(fā)展，研究人員目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一系列高通量全景數(shù)字病理成像掃描儀，在實(shí)現(xiàn)高通量成像方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步[12]。數(shù)字病理切片掃描儀是一種集合光學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、控制學(xué)、機(jī)械等諸多學(xué)科知識(shí)技術(shù)的產(chǎn)品，主要包含虛擬顯微鏡軟件系統(tǒng)、光學(xué)成像系統(tǒng)、自動(dòng)化玻片載物臺(tái)系統(tǒng)、圖像探測(cè)系統(tǒng)、光源照明系統(tǒng)等組件[77]。其中自動(dòng)化玻片載物臺(tái)是高速自動(dòng)化成像系統(tǒng)的重要組成部分，高精度載物臺(tái)對(duì)保證成像質(zhì)量與提高掃描成像速度至關(guān)重要[83]。

總體而言，提高成像通量的關(guān)鍵是提高成像系統(tǒng)的掃描速度。在這方面，利用高精度位移臺(tái)進(jìn)行線掃描或連續(xù)面掃描成像的方式能夠極大地提高成像速度。若配合快速對(duì)焦方法，系統(tǒng)能在數(shù)十秒的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)切片的全景成像。其次，病理切片成像結(jié)束后減少新切片的裝載時(shí)間也是提高組織全景成像通量的重要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)今的數(shù)字病理掃描儀可自動(dòng)快速重新裝載切片樣本，有效地避免了人工操作引入的失誤并減少了人工操作時(shí)間。還有部分設(shè)備可進(jìn)行多批次處理，能夠?qū)崿F(xiàn)單次裝載就可實(shí)現(xiàn)數(shù)十至數(shù)百?gòu)埱衅淖詣?dòng)掃描成像[75]，極大地提高了病理切片的掃描成像通量。例如，Olympus公司開(kāi)發(fā)的研究級(jí)全玻片掃描系統(tǒng)VS 200（圖5）采用多托盤(pán)加載器方案，能夠?qū)崿F(xiàn)單次裝載210片，在明場(chǎng)20倍放大倍率下單張切片成像所需時(shí)間約為80秒[84]。

圖5 Olympus VS200 研究級(jí)全玻片掃描系統(tǒng)[84]Fig. 5 Olympus VS200 research-grade slide scanner[84]

2.2.2 全景病理商品化設(shè)備

全景病理成像技術(shù)目前已經(jīng)較為成熟，許多廠商生產(chǎn)的全景數(shù)字病理成像設(shè)備已經(jīng)被廣泛用于生物學(xué)、病理學(xué)、組織形態(tài)學(xué)等相關(guān)的科學(xué)研究及醫(yī)療診斷過(guò)程中。這里，將介紹幾種商品化的全景病理成像設(shè)備，并對(duì)其性能參數(shù)進(jìn)行對(duì)比，見(jiàn)表2。

表2中列出了目前科學(xué)研究和臨床醫(yī)療中使用的大部分全景數(shù)字病理掃描成像設(shè)備。Zeiss公司的Axio Scan.Z1全自動(dòng)數(shù)字玻片掃描系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)樣本的明場(chǎng)及熒光成像。明場(chǎng)模式下，利用20倍放大倍率成像單張切片（15 mm×15 mm）所需時(shí)間為240秒。該系統(tǒng)的熒光成像模式最高可實(shí)現(xiàn)9色成像，且一次最高可裝載100張玻片，采用濾光片式的分光多色方法的數(shù)字病理設(shè)備有Olympus、Zeiss等品牌。Zeiss公司的Axio Scan.Z1全自動(dòng)數(shù)字玻片掃描系統(tǒng)擁有明場(chǎng)、熒光以及偏振光3種成像方式。該系統(tǒng)的熒光成像模式采用高靈敏sCOMS探測(cè)器，配合多個(gè)濾光輪可高速切換通道，最高可實(shí)現(xiàn)9色成像，且一次最高可裝載100張玻片，能夠快速獲取高通量數(shù)據(jù)[85]。Olympus公司推出的全玻片掃描系統(tǒng)VS200[84]的成像模式多達(dá)5種，并可進(jìn)行不同成像模式的組合觀察。該系統(tǒng)使用電動(dòng)濾光片轉(zhuǎn)輪配合不同染色方案實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)全景成像，并能夠支持不同規(guī)格的載玻片。不同成像模式的組合能夠更好地滿(mǎn)足研究人員不同成像需要。采用光譜成像方式的光譜型成像設(shè)備有Akoya公司的Vectra系列和Polaris系列等。Akoya Biosciences公司的Vectra3自動(dòng)定量病理成像系統(tǒng)采用多光譜成像方式，多路復(fù)用能力最多可分離7種顏色，結(jié)合inFORM?軟件分析系統(tǒng)，能夠檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中多個(gè)弱表達(dá)的生物標(biāo)志物[20]。

表2 全景數(shù)字病理設(shè)備產(chǎn)品主要參數(shù)Tab. 2 The main parameters of panoramic digital pathology equipments

2.3 圖像處理技術(shù)

基于多靶點(diǎn)全景高通量成像系統(tǒng)，可以獲得多幅局部多色病理圖像。在同一幅多色病理圖像中包含多個(gè)靶點(diǎn)的病理信息，因此，首先要對(duì)多色病理圖像進(jìn)行顏色解析，然后利用多色拼接算法對(duì)多個(gè)子區(qū)域圖像進(jìn)行拼接構(gòu)成全景數(shù)字病理圖像并可視化，最后對(duì)多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理圖像進(jìn)行定量分析，找出多靶點(diǎn)病理之間的關(guān)聯(lián)。

2.3.1 圖像重建

在當(dāng)前常用的光譜成像方法中，多光譜成像顯微鏡系統(tǒng)先捕獲多光譜圖像，再由多個(gè)圖像平面組成多層圖像“立方體”，這些平面通過(guò)光譜來(lái)對(duì)應(yīng)于液晶可調(diào)諧濾波器所選擇的波長(zhǎng)。然后，使用逆最小二乘擬合將多重染色樣本的圖像解混。解混分離每個(gè)熒光團(tuán)的自熒光和重疊發(fā)射信號(hào)，從而去除自熒光背景，產(chǎn)生各個(gè)信號(hào)特定的“成分”平面[20]，完成多色病理圖像多色解析（靶點(diǎn)解析）。

靶點(diǎn)解析后的圖像是小視場(chǎng)多色熒光圖像，利用圖像拼接技術(shù)提取相鄰小視場(chǎng)多色圖像重疊部分的特征點(diǎn)，通過(guò)匹配相鄰圖像的重疊區(qū)域的特征點(diǎn)，將多張小視場(chǎng)多色圖像拼接成一張全景多色圖像。圖像拼接流程如圖6所示。

圖6 全景數(shù)字病理圖像拼接流程Fig. 6 Mosaic process of panoramic digital pathological images

圖像配準(zhǔn)和圖像融合是直接影響圖像拼接性能的兩個(gè)步驟?？臻g域中圖像配準(zhǔn)算法一般分為基于區(qū)域的圖像配準(zhǔn)和基于特征的圖像配準(zhǔn)。對(duì)于基于圖像區(qū)域?qū)崿F(xiàn)圖像配準(zhǔn)的方法，Plattard[86]等提出互信息法，通過(guò)重疊區(qū)域的聯(lián)合熵來(lái)評(píng)判兩張圖像的信息相互包含程度，根據(jù)聯(lián)合熵便可以實(shí)現(xiàn)圖像的配準(zhǔn)?；趫D像特征的圖像配準(zhǔn)，提取具有特殊性質(zhì)的特征點(diǎn)集作為匹配依據(jù)，常用的特征檢測(cè)器有Harris、FAST（Features from Accelerated Segment Test）、SURF（Speeded-Up Robust Features）、SIFT（Scale-Invariant Feature Transform）。由于Harris會(huì)產(chǎn)生大量密集角點(diǎn)，F(xiàn)AST難以區(qū)分邊緣點(diǎn)和噪聲點(diǎn)，特征點(diǎn)配準(zhǔn)方法中SIFT和其改進(jìn)算法SURF[87]應(yīng)用最為廣泛。SIFT通過(guò)尺度空間篩選尺度和旋轉(zhuǎn)不變興趣點(diǎn)，根據(jù)圖像局部區(qū)域的梯度方向?qū)M(jìn)一步篩選的關(guān)鍵點(diǎn)賦予方向，然后用一組向量對(duì)特征點(diǎn)及其鄰域像素點(diǎn)信息進(jìn)行描述?；诓煌瑘D像融合方法，拼接算法分為平滑過(guò)渡和最佳拼縫，基于平滑過(guò)渡拼接的方法可進(jìn)一步分為基于羽化、金字塔和基于梯度的拼接[88]。

2.3.2 數(shù)據(jù)存儲(chǔ)及可視化

醫(yī)院掃描產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)量很大，拼接后一張全景圖像大小就為800 M ～ 1 G。以南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院采購(gòu)醫(yī)用設(shè)備招標(biāo)項(xiàng)目為例，要求數(shù)字化病理掃描系統(tǒng)指標(biāo)如下：放大倍率分別為20×和40×，持續(xù)產(chǎn)出量達(dá)到7小時(shí)400片[89]。在醫(yī)院中每年將產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)張病理醫(yī)學(xué)圖像，年存儲(chǔ)增量可達(dá)TB級(jí)。因此，在多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理研究中要重點(diǎn)考慮病理圖像數(shù)據(jù)存儲(chǔ)及可視化方式。

病理數(shù)據(jù)存儲(chǔ)策略需要考慮持續(xù)增長(zhǎng)的容量需求，如蘭烏特勒支大學(xué)醫(yī)學(xué)中心病理系通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)字病理存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)全面數(shù)字病理[90]。其存儲(chǔ)方式主要采用分層策略：第一層為低延遲、高帶寬存儲(chǔ)系統(tǒng)，其將為虛擬存儲(chǔ)集群（操作系統(tǒng)、數(shù)據(jù)庫(kù)）和數(shù)字切片提供本地短期存儲(chǔ)。第二層是存儲(chǔ)于網(wǎng)絡(luò)連接（Network Attached Storage, NAS）上的全院系統(tǒng)，具備高度可擴(kuò)展的存儲(chǔ)容量（最高達(dá)PB級(jí)），數(shù)字圖像在歸檔后將存儲(chǔ)在該層。

全景圖像可視化視野范圍大，存儲(chǔ)信息多，一次可實(shí)現(xiàn)整張全景圖像可視化，但處理時(shí)間久，通常不能進(jìn)行實(shí)時(shí)可視化。在查看大視場(chǎng)圖像時(shí)，由于計(jì)算機(jī)屏幕的限制，不能一次性加載最高分辨圖像。目前的可視化采用多分辨率層次金字塔模型，主要是根據(jù)原始圖像構(gòu)建圖像序列，序列中的每個(gè)圖像稱(chēng)為一個(gè)層，每一層都是原始圖像不同分辨率下的圖像。利用該方法每次可視化只需按需加載部分圖像數(shù)據(jù)，不僅可以減少內(nèi)存加載，而且可以解決文件存儲(chǔ)和帶寬之間的矛盾，實(shí)現(xiàn)快速實(shí)時(shí)可視化，方便醫(yī)生瀏覽整張全景圖像。

2.3.3 定量分析

（1）預(yù)處理

圖像質(zhì)量對(duì)后期定量分析很重要，處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致病理圖像定量分析準(zhǔn)確性下降。降低圖像質(zhì)量的原因可能有疾病異質(zhì)性、切片制備、圖像采集過(guò)程條件不一致等。采用預(yù)處理方法可以在一定程度上減少誤差，如組織偽影檢測(cè)、圖像去噪、染色標(biāo)準(zhǔn)化、增強(qiáng)圖像對(duì)比度等[91]。其中，組織偽影檢測(cè)與染色標(biāo)準(zhǔn)化是常用的預(yù)處理方法。正確檢測(cè)組織學(xué)圖像中的組織和偽影是保證圖像質(zhì)量的前提。常用組織和偽影檢測(cè)方法有濾波器與閾值化相結(jié)合[92]、語(yǔ)義分割算法[93]、特征提取分類(lèi)器[94]等。染色標(biāo)準(zhǔn)化是圖像處理的基礎(chǔ)，Massimo Salv等人總結(jié)了三種染色標(biāo)準(zhǔn)化策略，一是全局顏色歸一化：首先從模板圖像中提取全局信息（例如RGB直方圖、亮度），然后映射到源圖像。二是染色分離后的顏色歸一化：根據(jù)模板圖像的顏色分布，分離單個(gè)染料的權(quán)重以改變?cè)紙D像。三是利用深度網(wǎng)絡(luò)的顏色轉(zhuǎn)移：采用風(fēng)格轉(zhuǎn)移方法將源圖像的染色風(fēng)格更改為模板風(fēng)格[95]。接下來(lái)將從組織形態(tài)識(shí)別、細(xì)胞表型檢測(cè)、空間距離分析方面定量分析多靶點(diǎn)全景病理圖像。

（2）組織形態(tài)識(shí)別

在組織病理分析過(guò)程中，病理學(xué)家通常通過(guò)評(píng)估細(xì)胞核的多形性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間排列來(lái)區(qū)分正常組織、非惡性和惡性病變[96]。針對(duì)某些疾病的病理診斷需求,以淋巴細(xì)胞識(shí)別、有絲分裂數(shù)目檢測(cè)、細(xì)胞核大小識(shí)別為例，從整張病理切片中識(shí)別并分離出上述細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)以進(jìn)行數(shù)字病理分析。

傳統(tǒng)方法主要依賴(lài)于數(shù)字圖像處理技術(shù)，采用基于各種特征描述符的手工特征提取方法，例如根據(jù)顏色、紋理、形狀和組合描述符等實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或組織的識(shí)別和分類(lèi)。2013年，Ciresan[97]等人首次使用滑動(dòng)窗在數(shù)據(jù)集中截取大量小樣本，然后采用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Convolutional Neural Network, CNN）分類(lèi)模型對(duì)樣本做有無(wú)有絲分裂的二分類(lèi), 以檢測(cè)有絲分裂數(shù)目。Chen[98]等人使用基于分離色彩通道的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)生成細(xì)胞概率響應(yīng)圖，并在響應(yīng)圖中自動(dòng)檢測(cè)免疫細(xì)胞。回歸/分類(lèi)框架將對(duì)象識(shí)別視為一個(gè)回歸或分類(lèi)問(wèn)題，采用統(tǒng)一框架直接獲得最終結(jié)果（類(lèi)別和位置）。

（3）細(xì)胞表型檢測(cè)

細(xì)胞表型是多個(gè)基因和蛋白表達(dá)的細(xì)胞過(guò)程的集合體，決定了細(xì)胞特定的形態(tài)和功能。了解細(xì)胞表型對(duì)于了解癌癥進(jìn)展和免疫治療反應(yīng)的機(jī)制至關(guān)重要。將細(xì)胞內(nèi)成分檢測(cè)技術(shù)與多色免疫熒光分析方法相結(jié)合，可檢測(cè)不同細(xì)胞亞群合成的細(xì)胞因子，如對(duì)淋巴細(xì)胞亞群和白血病免疫表型分析[99]。

目前有些學(xué)者構(gòu)建了專(zhuān)業(yè)的數(shù)字圖像分析軟件，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法完成細(xì)胞表型檢測(cè)。如Koelzer[100]等人使用多重IHC和數(shù)字圖像分析軟件對(duì)PDL1表達(dá)進(jìn)行識(shí)別和計(jì)算定量，然后利用隨機(jī)森林算法實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞的分類(lèi)和定量分析。Sun團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了新型計(jì)算工具Scissor，可以在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中識(shí)別出與給定表型相關(guān)的細(xì)胞亞群[101]。Scissor首先通過(guò)量化每個(gè)單細(xì)胞和每個(gè)大量樣品之間的相似性，整合與表型相關(guān)的大量表達(dá)數(shù)據(jù)和單細(xì)胞數(shù)據(jù)，然后優(yōu)化與樣本表型相關(guān)的矩陣回歸模型，以識(shí)別相關(guān)亞群?；谏疃葘W(xué)習(xí)（Deep Learning, DL）的圖像分析也被廣泛用于多靶點(diǎn)圖像定量分析中的細(xì)胞表型檢測(cè)。Harder等人使用高精度多分辨率配準(zhǔn)方法和基于網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)GooglieNet的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來(lái)區(qū)分黑色素和IHC標(biāo)記的陽(yáng)性免疫細(xì)胞[102]。

（4）空間距離分析

在組織細(xì)胞表型的基礎(chǔ)上計(jì)算不同細(xì)胞之間的空間關(guān)系，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞之間的相互作用做出推測(cè)，也可以計(jì)算出組織交界面兩側(cè)的細(xì)胞密度，對(duì)細(xì)胞的浸潤(rùn)程度進(jìn)行分析。如觀察免疫T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的聚集傾向和接觸范圍、判斷不同樣本組之間的免疫效果差異等。

將多染色面板和開(kāi)源圖像分析軟件相結(jié)合用以實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞的定量分析。Oguejiofor K等人通過(guò)Vectra自動(dòng)多光譜成像系統(tǒng)[103]、Nuance FX多光譜成像系統(tǒng)軟件和inFORM?高級(jí)圖像分析軟件實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes, TILs）與人乳頭瘤病毒腫瘤狀態(tài)和患者生存率之間的關(guān)系分析[104]。Failmezge[105]等人提出了拓?fù)淠[瘤圖（Topological Tumor Graphs,TTG），其基于自動(dòng)圖像分析提供的細(xì)胞空間映射，將每個(gè)細(xì)胞視為一個(gè)節(jié)點(diǎn)，如果它們?cè)诳臻g上接近35 μm，則繪制細(xì)胞之間的邊緣，由此可得出細(xì)胞類(lèi)型之間的空間相互作用。Barua等利用Gcross空間距離分布方法實(shí)現(xiàn)了每種細(xì)胞類(lèi)型豐度和空間位置以及它們彼此之間接近度的分析，該方法可以在微米級(jí)半徑范圍內(nèi)找到至少一個(gè)任意給定類(lèi)型的免疫細(xì)胞，驗(yàn)證了肺癌細(xì)胞和特定免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的空間鄰近性預(yù)后意義[106]。

3 多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理應(yīng)用

多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理技術(shù)可以標(biāo)記檢測(cè)多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)和環(huán)境，通過(guò)分析位置分布和監(jiān)測(cè)病理特征，有助于進(jìn)一步了解細(xì)胞組織間的相互作用及功能。多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理利用免疫熒光成像技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)部蛋白質(zhì)分子等的分布狀態(tài)進(jìn)行精確觀測(cè)，解決了傳統(tǒng)檢測(cè)手段面臨的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成像視野小、分辨率不足等問(wèn)題，推動(dòng)了醫(yī)療及生物應(yīng)用的后續(xù)研究和發(fā)展。多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用主要包括腫瘤微環(huán)境、腫瘤分子分型等。

3.1 腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境由癌細(xì)胞、惡性上皮細(xì)胞和多種基質(zhì)細(xì)胞等構(gòu)成，癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為受到宿主基質(zhì)細(xì)胞特性的影響[107]，因此，微環(huán)境的相互作用與癌細(xì)胞致病過(guò)程密切相關(guān)。在發(fā)掘生物標(biāo)志物和潛在藥物靶點(diǎn)上，腫瘤微環(huán)境利用其機(jī)制特性，為后續(xù)研究提供關(guān)鍵幫助[108]，腫瘤微環(huán)境如圖7（彩圖見(jiàn)期刊電子版）所示[109]。

圖7 腫瘤微環(huán)境[109]Fig. 7 Tumor micro environment[109]

利用腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞結(jié)構(gòu)及組織組成之間層次調(diào)節(jié)的特征，調(diào)控細(xì)胞對(duì)疾病的反應(yīng)。但是一些蛋白標(biāo)記物獨(dú)特地分布于亞細(xì)胞體積中腫瘤塊的不同部分，可以對(duì)這些蛋白標(biāo)記物進(jìn)行定向檢測(cè)。非小細(xì)胞肺癌研究利用Akoya多色免疫熒光技術(shù)，對(duì)新輔助治療前后的腫瘤免疫微環(huán)境進(jìn)行7色多靶標(biāo)標(biāo)記，對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行量化分析，驗(yàn)證了治療前后腫瘤免疫微環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化[110]。目前已有的研究在如何構(gòu)建腫瘤微環(huán)境上仍然有許多無(wú)法克服的問(wèn)題，如大視場(chǎng)成像、分辨率等，而多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理可以通過(guò)對(duì)腫瘤微環(huán)境標(biāo)記出多個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)行多方位的組織成像，成功定位細(xì)胞、產(chǎn)物的位置分布，有利于研究腫瘤微環(huán)境多個(gè)層次的異質(zhì)性。Obradovic等人利用多靶點(diǎn)定量免疫熒光驗(yàn)證了異質(zhì)性疾病腎透明細(xì)胞癌（Clear Cell Renal Cell Carcinoma, ccRCC）微環(huán)境中特異性的TREM2/APOE/C1Q上調(diào)巨噬細(xì)胞亞群，這一關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)可作為預(yù)測(cè)腎透明細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)志物[111]。

3.2 腫瘤分子分型

1999年美國(guó)癌癥研究所提出了腫瘤分子分型的概念，即從形態(tài)學(xué)領(lǐng)域轉(zhuǎn)向分子水平對(duì)腫瘤進(jìn)行系統(tǒng)劃分，其主要是通過(guò)分子水平表達(dá)差異（如抗體表達(dá)、免疫標(biāo)志物）進(jìn)行分型[112]。21世紀(jì)以來(lái)，各個(gè)團(tuán)隊(duì)也一直致力于研究腫瘤分型。2006年，Hu等利用微陣列數(shù)據(jù)針對(duì)乳腺癌分子建立了一個(gè)新的亞型預(yù)測(cè)因子，基于此，提出了一種新型的乳腺癌分子型，為腫瘤前瞻性提供了一種客觀方法[113]。在此基礎(chǔ)上，利用多靶點(diǎn)方法對(duì)腫瘤區(qū)域不同分子表達(dá)進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)一步使用全景數(shù)字病理對(duì)腫瘤分子分型進(jìn)行精確劃分。Helmink等利用多色免疫熒光技術(shù)對(duì)三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)進(jìn)行多靶點(diǎn)標(biāo)記（如圖8（彩圖見(jiàn)期刊電子版）所示），針對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物標(biāo)志物進(jìn)行開(kāi)發(fā)從而對(duì)其中的免疫細(xì)胞進(jìn)行精確分型[114]。

圖8 三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)免疫標(biāo)記熒光成像[114]Fig. 8 Immunolabeling fluorescence imaging of tertiary lymphoid structures[114]

使用全景成像技術(shù)將玻片上的樣本進(jìn)行掃描采集成像生成圖像數(shù)據(jù)集，并對(duì)這些數(shù)據(jù)集圖像進(jìn)行拼接，在大視場(chǎng)和高分辨率條件下觀察多色免疫熒光染色情況[20]，進(jìn)而依據(jù)免疫標(biāo)志物的差異從分子水平進(jìn)行腫瘤分子分型。除此之外，多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理技術(shù)可以根據(jù)腫瘤組織原位來(lái)測(cè)定不同免疫細(xì)胞亞群（如B細(xì)胞、T細(xì)胞）表型、狀態(tài)及相互關(guān)系[115]，為腫瘤分子分型提供分析數(shù)據(jù)和依據(jù)，進(jìn)而為臨床上個(gè)性化治療制定策略和方案[111]。

4 結(jié)束語(yǔ)

多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理是病理學(xué)和形態(tài)學(xué)研究的重要手段，其揭示了細(xì)胞組織之間相互作用以及功能變化。本文從基礎(chǔ)技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用兩方面介紹了多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理。在基礎(chǔ)技術(shù)中介紹了多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理的生物樣本處理、光學(xué)成像和圖像處理3方面相關(guān)技術(shù)：（1）生物樣本準(zhǔn)備，使讀者了解如何選擇靶點(diǎn)、處理組織樣本和樣本標(biāo)記，從而獲得多靶點(diǎn)標(biāo)記的組織樣本；（2）光學(xué)成像，講述了光譜解析的多色成像原理，介紹了面掃描與線掃描的全景成像技術(shù)，以及虛擬顯微鏡技術(shù)和高速自動(dòng)化系統(tǒng)的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了大視場(chǎng)高通量光學(xué)成像技術(shù)；（3）圖像處理，介紹了如何通過(guò)顏色解析和圖像拼接實(shí)現(xiàn)全景多靶點(diǎn)圖像并定量分析多靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)表達(dá)。在應(yīng)用方面簡(jiǎn)單介紹了多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理在腫瘤微環(huán)境和腫瘤分子分型方面的研究。這些研究有助于揭示細(xì)胞組織間的相互作用及功能變化，有助于推動(dòng)多靶點(diǎn)全景病理圖像在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究。

雖然多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理技術(shù)已被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，但是它的發(fā)展還不成熟，仍然有許多待完善的地方。例如在選擇靶點(diǎn)方面，可以結(jié)合多靶點(diǎn)專(zhuān)家知識(shí)庫(kù)，從而獲得針對(duì)某種疾病更合適的靶點(diǎn)；在實(shí)現(xiàn)全景掃描成像方面，可以通過(guò)優(yōu)化復(fù)雜的光學(xué)成像系統(tǒng)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)更高性能的“多色、全景、高通量”光學(xué)成像；在圖像處理方面，可以結(jié)合深度學(xué)習(xí)來(lái)實(shí)現(xiàn)顏色解析和圖像拼接，進(jìn)而為定量分析提供高質(zhì)量的圖像數(shù)據(jù)，通過(guò)優(yōu)化算法減少數(shù)據(jù)處理時(shí)間，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)可視化，方便病理醫(yī)生瀏覽整張全景圖像完成病理診斷等。

然而，通過(guò)調(diào)研該領(lǐng)域目前的研究現(xiàn)狀以及分析實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理的主要影響因素，多靶點(diǎn)全景數(shù)字病理的發(fā)展將面臨的一些關(guān)鍵技術(shù)挑戰(zhàn)如下：樣本多標(biāo)記免疫熒光染色時(shí)如何解決抗體沖突問(wèn)題[116]；光譜成像時(shí)重復(fù)信號(hào)串色干擾問(wèn)題[117]；定量分析時(shí)，如何解決定量分析標(biāo)準(zhǔn)化等問(wèn)題[116]。這些關(guān)鍵問(wèn)題的解決，需要進(jìn)一步的深入研究。