賴福平，胡杰，陸元蘭，楊登會(huì)，詹江珊，吳瑾，王庭剛，謝智慧

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1.急診科，2.重癥醫(yī)學(xué)科，3.高壓氧科，貴州 遵義 563003)

鵝膏毒肽類毒素是由7～8個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽化合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)差異可分為鵝膏毒肽(amatoxin)、鬼筆毒肽(phallotixin)和毒傘肽(virotixin)3類，其中最主要的致死毒素是鵝膏毒肽[1]。鵝膏毒肽屬于聯(lián)吡啶N-二氧化物，其大環(huán)多肽結(jié)構(gòu)類似致死性極大的敵草快，根據(jù)側(cè)鏈取代基團(tuán)不同可分為多種類型，目前國(guó)內(nèi)外研究類型主要集中在α-鵝膏毒肽(α-amanitin，α-AMA)、β-鵝膏毒肽(β-amanitin，β-AMA)、γ-鵝膏毒肽(γ-amanitin，γ-AMA)，但目前對(duì)鵝膏毒肽中毒機(jī)制研究不足，由于鵝膏毒肽在多個(gè)屬蘑菇均有出現(xiàn)，且不僅只有1種毒素存在，因此這些毒素相互交集作用給臨床診斷及診療帶來(lái)困難[2]。α-AMA作為鵝膏毒肽中含量多、毒性強(qiáng)、致死劑量低(半數(shù)致死量0.05～0.1 mg·kg-1)且最為常見(jiàn)類型，其由8個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成雙環(huán)八肽，分子量約900 g·mol-1[3-4]。根據(jù)α-AMA的毒代動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)，肝臟是最主要的受累靶器官，主要引起肝代謝異常、肝細(xì)胞損害、肝臟合成功能受損、凝血功能障礙等，而持續(xù)性肝損害可進(jìn)展至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)、腸系膜血栓形成等，甚至威脅生命[5-6]。線粒體作為動(dòng)態(tài)的雙膜結(jié)構(gòu)，通過(guò)產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)為細(xì)胞活動(dòng)提供所需能量，而當(dāng)接受線粒體凋亡途徑上游信號(hào)時(shí)線粒體內(nèi)凋亡因子釋放至胞質(zhì)中引起細(xì)胞凋亡。當(dāng)機(jī)體發(fā)生α-AMA中毒可使肝細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)量增多打破細(xì)胞內(nèi)環(huán)境氧化還原平衡，并作為凋亡上游信號(hào)分子促進(jìn)P53過(guò)度表達(dá)和磷酸化，以非轉(zhuǎn)錄依賴方式向線粒體易位介導(dǎo)線粒體凋亡途徑發(fā)生[7]?？梢?jiàn)ROS激活P53調(diào)控線粒體凋亡途徑在致肝細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。作者就ROS激活P53調(diào)控線粒體凋亡途徑與α-AMA中毒肝損害的關(guān)系作一綜述，期望對(duì)α-AMA中毒肝損害有一新的認(rèn)識(shí)，為α-AMA中毒肝損害診治甚至預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 α-AMA抑制RNAPⅡ活性與調(diào)控線粒體凋亡途徑致肝損害的研究進(jìn)展

α-AMA由肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(organic anion transporting polypeptide 1B3, OATP1B3)以Km值(3.7±0.6)mm和鈉離子-牛磺膽汁酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，與RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ, RNAPⅡ)的橋螺旋(bridge helix)和觸發(fā)環(huán)(trigger loop)之間以非共價(jià)結(jié)合形成較強(qiáng)極性作用的氫鍵，降低RNAP Ⅱ活性使mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8-10]。然而在研究中發(fā)現(xiàn)，一種化學(xué)性質(zhì)類似于α-AMA的抗生素可釋放RNAPⅡ，在預(yù)防α-AMA中毒動(dòng)物模型的肝損害和增加存活率方面并未有明顯上升趨勢(shì)[11]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，在α-AMA環(huán)境下的小鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)不同程度的形態(tài)變化，和功能失調(diào)的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)化孔呈不可逆開(kāi)放狀態(tài)，破壞線粒體內(nèi)膜完整性引起離子平衡紊亂和線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C(Cytochrome C, CytC)等凋亡因子釋放至胞質(zhì)中，抑凋亡蛋白Bcl-2和促進(jìn)促凋亡蛋白Bax表達(dá)使Bax/Bcl-2比值上升，進(jìn)而誘導(dǎo)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7,12]。因此，線粒體作為內(nèi)分泌細(xì)胞器，不僅是為發(fā)生氧化應(yīng)激作用直接提供所需要的能量和信號(hào)的細(xì)胞器，還是ROS激活P53調(diào)控線粒體凋亡途徑發(fā)生引起α-AMA中毒肝細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要機(jī)制之一。

2 ROS誘導(dǎo)P53激活線粒體凋亡途徑與α-AMA中毒肝細(xì)胞異常凋亡的相關(guān)性

2.1 α-AMA促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量增加

α-AMA引起肝細(xì)胞內(nèi)高ROS環(huán)境下對(duì)細(xì)胞成分造成不利修飾，通過(guò)氧化修飾對(duì)生物分子如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成損傷，而受損分子可使ROS產(chǎn)量進(jìn)一步增加，形成惡性循環(huán)[19]。進(jìn)一步引起氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、線粒體結(jié)構(gòu)受損，進(jìn)而促進(jìn)Bax表達(dá)和抑制Bcl-2表達(dá)使Bax/Bcl-2值上調(diào)、Caspase-9和Caspase-3激活，α-AMA使ROS產(chǎn)量增多可以向P53基因提供激活信號(hào)，使P53表達(dá)增多和發(fā)生磷酸化向線粒體內(nèi)易位，誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑發(fā)生[7,20-22]。

2.2 α-AMA促進(jìn)ROS產(chǎn)生進(jìn)而誘導(dǎo)P53表達(dá)并磷酸化向線粒體內(nèi)易位

P53作為核轉(zhuǎn)錄因子主要存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，與DNA分子發(fā)生特異結(jié)合，通過(guò)磷酸化修飾發(fā)揮活性，同時(shí)也是細(xì)胞中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)功能的多功能轉(zhuǎn)錄因子，在維持基因組完整性方面占有舉足輕重的地位。P53在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平較低且半衰期短，其降解過(guò)程主要與泛素蛋白連接酶鼠雙微粒體2(murine double minute 2,MDM2)作為E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligases)相互作用降低活性，并通過(guò)泛素蛋白酶體途徑和26S蛋白酶體降解，使P53維持在低水平狀態(tài)[23-25]。而有文獻(xiàn)報(bào)道，α-AMA中毒可使P53作為重要應(yīng)激傳感器調(diào)控線粒體凋亡途徑引起肝細(xì)胞凋亡[16,26-27]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，α-AMA抑制CAT活性使胞內(nèi)產(chǎn)生大量的H2O2，而經(jīng)人類細(xì)胞對(duì)H2O2進(jìn)行降解的微陣列分析得知，H2O2的48個(gè)高度應(yīng)答基因與P53近1/3靶點(diǎn)相吻合，并且ROS和P53之間也存在交叉信號(hào)通路，可使α-AMA中毒誘導(dǎo)P53基因表達(dá)增加，也使P53蛋白多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾激活活性[28-29]。另有研究發(fā)現(xiàn)，由于α-AMA中毒可抑制RNAPⅡ表達(dá)水平，引起非復(fù)制依賴性方式誘導(dǎo)P53絲氨酸-15位點(diǎn)發(fā)生磷酸化和P53積聚，并且由于α-AMA中毒導(dǎo)致胞內(nèi)呈氧化應(yīng)激狀態(tài)，引起MDM2減弱對(duì)P53泛素化能力，進(jìn)而減少P53降解、半衰期延長(zhǎng)、穩(wěn)定性和活性顯著提高[30-31]。

2.3 α-AMA誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生進(jìn)而激活P53調(diào)控線粒體凋亡途徑發(fā)生

線粒體凋亡途徑是通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)部途徑引起凋亡的主要調(diào)節(jié)通路，以激活Caspase-9蛋白為主，α-AMA中毒肝細(xì)胞凋亡正是通過(guò)激活線粒體凋亡途徑導(dǎo)致。ROS不僅作為α-AMA中毒誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體凋亡的上游信號(hào)分子，同時(shí)也誘導(dǎo)P53調(diào)控Bcl-2家族基因和Bax基因表達(dá)觸發(fā)線粒體凋亡途徑發(fā)生。因此，P53在α-AMA中毒誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑的發(fā)生中起到極其重要作用。Chen等[7]研究也加以驗(yàn)證，α-AMA環(huán)境中的L-02細(xì)胞內(nèi)Caspase-9和Caspase-3活性增加，但Caspase-8活性并未發(fā)生變化。眾所周知，促凋亡蛋白Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵啟動(dòng)因子，由于Bax基因第1個(gè)內(nèi)含子中的啟動(dòng)子是P53依賴性轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)元件，當(dāng)磷酸化P53與該內(nèi)含子反應(yīng)元件相互作用時(shí)可促進(jìn)內(nèi)源性Bax的mRNA翻譯，使Bax蛋白含量增加[39]。與此同時(shí)，P53通過(guò)調(diào)控銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)表達(dá)增加，與Bax相互作用定位于線粒體內(nèi)膜上發(fā)生寡聚化，線粒體P53下調(diào)線粒體膜上抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平，使Bax/Bcl-2值增加而引起線粒體孔隙形成，使線粒體膜通透性增加、膜電位降低、Cyt C等促凋亡因子釋放至胞質(zhì)[25,40]。在胞質(zhì)內(nèi)，P53反應(yīng)元件直接上調(diào)凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)表達(dá)水平并與Cyt C形成凋亡復(fù)合體，進(jìn)一步誘導(dǎo)Caspase-9活化并激活效應(yīng)Caspase-3，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)觸發(fā)線粒體凋亡途徑，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞快速凋亡[41-43]。

3 α-AMA中毒肝損害的治療展望

α-AMA中毒誘導(dǎo)肝細(xì)胞快速凋亡引起肝損害已成為最致命也是最難治療環(huán)節(jié)。然而，目前對(duì)α-AMA中毒導(dǎo)致肝損害具體機(jī)制尚未完全清楚，因此還未有對(duì)含鵝膏毒肽類物質(zhì)中毒的治療國(guó)際共識(shí)和特異性解毒劑。ROS作為誘導(dǎo)人肝細(xì)胞線粒體凋亡的上游介質(zhì)和啟動(dòng)因子之一，可調(diào)控P53表達(dá)及磷酸化激活活性，通過(guò)mPTP向線粒體易位觸發(fā)線粒體凋亡途徑引起肝細(xì)胞凋亡。因此，減弱細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激發(fā)生是最有效的治療選擇。近期研究發(fā)現(xiàn)，海洋蠕蟲海沙躅(marine worm arenicola marina，M101)體內(nèi)提取的胞外血紅蛋白由198條多肽鏈組成，總質(zhì)量為3 682 kDa，在飽和狀態(tài)下可攜帶156個(gè)O2，具有顯著O2結(jié)合能力和抗氧化特性[44]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，α-AMA以不同劑量與人肝臟祖細(xì)胞(HepaRG)共同孵化時(shí)，α-AMA濃度與ROS生產(chǎn)量成正比關(guān)系，并顯著降低HepaRG細(xì)胞活力，當(dāng)加入M101時(shí)線粒體ROS生成量顯著降低、活性增強(qiáng)，抑制線粒體氧化應(yīng)激發(fā)生并發(fā)生逆轉(zhuǎn)效果，從而降低線粒體功能障礙發(fā)生，進(jìn)而引起P53表達(dá)及磷酸化修飾減少，并且凋亡細(xì)胞相關(guān)蛋白酶、Cyt C、Caspase家族都出現(xiàn)可逆性作用，使人肝癌細(xì)胞(HepaRG)死亡率下降，甚至恢復(fù)活性[45]。因此M101可能會(huì)成為α-AMA中毒的有效解毒劑，但還需大量研究加以證實(shí)。對(duì)α-AMA毒性機(jī)制研究對(duì)于開(kāi)發(fā)更加有特異性解毒劑至關(guān)重要。

4 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，α-AMA中毒可影響多種細(xì)胞生命代謝過(guò)程，在肝細(xì)胞內(nèi)可引起大量ROS產(chǎn)生進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生、P53與磷酸化P53表達(dá)增加并向線粒體發(fā)生易位引起線粒體通透性發(fā)生改變?cè)斐晒δ苷系K，還可引起B(yǎng)ax/Bcl-2值增加使Cyt C釋放至胞質(zhì)中激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活線粒體凋亡途徑造成肝細(xì)胞快速凋亡。進(jìn)一步闡述了α-AMA中毒調(diào)控肝細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制，也驗(yàn)證ROS可能作為α-AMA誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡早期上游信號(hào)分子，在誘導(dǎo)P53對(duì)線粒體凋亡途徑調(diào)控肝細(xì)胞凋亡機(jī)制中起到關(guān)鍵調(diào)控作用，使α-AMA、P53、ROS、線粒體凋亡途徑和肝細(xì)胞凋亡產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。因此，臨床上發(fā)生急性α-AMA中毒時(shí)，減少ROS產(chǎn)生進(jìn)而抑制P53過(guò)度表達(dá)和磷酸化將會(huì)是減少α-AMA中毒肝損害的工作重點(diǎn)，也是我們努力的方向，期望進(jìn)一步明確α-AMA中毒肝損害的機(jī)制，為含α-AMA蘑菇中毒患者提供更加有效治療方案、尋求特異性解毒劑提供合理的理論依據(jù)。

聲明：所有作者均不存在利益沖突。