王晨菲，張春雪，高靜

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，新疆 烏魯木齊 830000； 2.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院 體檢科，新疆 烏魯木齊 830000)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病的主要并發(fā)癥，具體的發(fā)病機制復(fù)雜[1]。高血糖誘導(dǎo)的雪旺氏細胞(Schwann cells, SCs)凋亡參與DPN的發(fā)病機制，SCs作為外周髓鞘形成細胞，在維持外周神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要作用[2]。高血糖誘導(dǎo)的SCs凋亡是降低神經(jīng)傳導(dǎo)速度和增加熱感知閾值、軸突萎縮及DPN脫髓鞘的關(guān)鍵因素[3]。最近的研究[4]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡參與了DPN的發(fā)病機制。ER應(yīng)激是由ER中未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的積累引起的，可以激活未折疊蛋白元件(unfolded protein response, UPR)以恢復(fù)ER的穩(wěn)態(tài)。但持續(xù)的ER應(yīng)激也可誘導(dǎo)細胞凋亡，因此，本研究探討ER應(yīng)激誘導(dǎo)SCs凋亡的機制，為進一步研究DPN的發(fā)病機制提供新的思路。

G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors, GPCRs)是目前研究最深入的藥物靶點，其中關(guān)鍵原因是GPCRs在人類病理生理學(xué)和藥理學(xué)上的可操作性優(yōu)勢。GPCRs調(diào)節(jié)劑相關(guān)的主要疾病指向糖尿病、肥胖和阿爾茨海默病等[4]。其中GPCRs成員G蛋白偶聯(lián)受體160(G-protein coupled receptor 160, GPR160)的配體可卡因和安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript peptide, CARTp)與神經(jīng)性疼痛和糖尿病嗜食癥密切相關(guān)，因此GPR160信號通路是一個有吸引力的DPN治療靶點。GPR160-CARTp已被確定為神經(jīng)性疼痛的潛在治療靶點[5]。以上研究表明，CARTp和GPR160極有可能參與調(diào)控DPN的髓鞘病變。然而，目前并不清楚GPR160信號通路對DPN的具體調(diào)節(jié)作用。本研究旨在探討GPR160信號通路是否參與高糖誘導(dǎo)的SCs凋亡和ER應(yīng)激損傷。

1 材料和方法

1.1 試劑耗材

兔抗GPR160的一抗購于瑞典Atlas Antibodies公司(HPA006970)；兔抗CARTp的一抗購于美國Santa Cruz生物技術(shù)有限公司(sc-293241)；兔抗C/EBP-同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)相關(guān)的生長阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白34(growth arrest and DNA damage inducing protein 34, GADD34)(ab9869)、兔抗ER氧化還原酶1α(endoplasmic reticulum oxidoreductase1α, Ero1α)(ab223646)、兔抗CHOP上游的蛋白需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme-1α, IRE1α)(ab235171)、兔抗X-框結(jié)合蛋白1(X-frame binding protein, XBP-1)(ab37152)、兔抗β-肌動蛋白(β-Actin)(ab8227)的一抗以及相應(yīng)的二抗均購于美國Abcam公司。GPR160的小干擾RNA重組質(zhì)粒(small interfering RNA recombinant plasmid of GPR160, siGPR160)和小干擾RNA陰性對照(small interfering RNA negative control, siNC)的設(shè)計與合成由上海吉瑪公司完成。大鼠SCs細胞系RSC96(XY-XB-1191)購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)；10%胎牛血清(B7446)購于美國Gibco/英杰公司；Fluo-3(0.5 μmol·L-1)(S1056)購于上海Beyotime公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜(ISEQ00010)和電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence, ECL)(PE0010)試劑購于美國Millipore公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(C1062M)、TRIzol試劑盒(R0016)、逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(D7180M)、M-MLV platinum qPCR試劑盒(D7188L)購于上海碧云天公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

RSC96在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基含10%胎牛血清，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃及5% CO2。Control組培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基。150 mmol·L-1葡萄糖(GLU)組將DMEM培養(yǎng)基中的GLU濃度換為150 mmol·L-1，其余處理與Control組一致。siGPR160組和siNC組分別將siGPR160或siNC轉(zhuǎn)染150 mmol·L-1GLU組的RSC96，其余處理與siGPR160組一致。

1.3 蛋白質(zhì)印跡試驗

RSC96以3×105個·孔-1接種在6孔板中，按1.2所述進行處理之后，將細胞在RIPA裂解緩沖液中裂解15 min。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將20 μg 蛋白在10%SDS-PAGE凝膠中電泳分離，并經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入PVDF膜上。室溫下將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后與一抗在4 ℃下孵育12 h，與二抗室溫下孵育1 h，之后在ECL試劑中孵育。β-Actin是內(nèi)參蛋白，使用ImageJ軟件對蛋白進行定量分析。

1.4 RNA提取和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

根據(jù)制造商的指南，使用TRIzol試劑盒從組織或細胞中分離和純化總RNA。使用NanoDrop 1000對RNA的質(zhì)量和數(shù)量進行評估。根據(jù)制造商的指南，使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成第1鏈cDNA。在LightCycler480系統(tǒng)上，用M-MLV platinum qRT-PCR試劑盒進行qRT-PCR。qRT-PCR重復(fù)3次，并通過相對定量(2-ΔΔCt)方法計算倍數(shù)變化。

1.5 細胞活力的檢測

將1.2所述各組RSC96以4×103個·孔-1的濃度接種于96孔板培養(yǎng)48 h，加入100 μl四甲基偶氮唑藍(MTT)(5 mg·ml-1，Sigma)溶液，37 ℃孵育4 h，隨后除去MTT溶液并加入DMSO(150 μl·孔-1)室溫孵育10 min，使用SpectraMax Plus384酶標(biāo)儀(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)在490 nm處檢測細胞活力。結(jié)果以GLU細胞吸光度的百分比表示。

1.6 Ca2+水平的檢測

RSC96(4×105個·孔-1，24 h；3×105個·孔-1，48 h)接種在6孔板中，使其貼壁過夜，隨后按1.2所述方法進行處理后RSC96用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶裂解并收集，用0.5 μmol·L-1Fluo-3在37 ℃ 下孵育30 min。用BD LSRFortessaTM流式細胞儀(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)分析Ca2+水平。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。將細胞用冷的細胞染色緩沖液洗滌2次，以1.0×106個·ml-1的濃度重懸于Annexin V結(jié)合的緩沖液中。隨后將細胞渦旋，在黑暗中于25 ℃溫育15 min。之后向每個試管中加入400 μl結(jié)合緩沖液，通過流式細胞儀分析細胞的凋亡。

1.8 ER超微結(jié)構(gòu)觀察

RSC96以合適的濃度(3×105個·孔-1，48 h)接種在6孔板中，使其貼壁過夜，用1.4所述方法處理后，RSC96用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)裂解并以2 000 r·min-1離心5 min，隨后用2.5%戊二醛固定3 h，儲存在磷酸鹽緩沖液中送往透射電子顯微鏡中心進行超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 7.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組之間比較使用t檢驗，3組及以上比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t進行分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GPR160信號通路在高糖誘導(dǎo)的RSC96中的表達

高糖孵育24、48 h后，150 mmol·L-1GLU組中GPR160蛋白和配體CARTp的表達量均明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖1。

* 與Control組比，P<0.05圖1 高糖誘導(dǎo)RSC96中GPR160信號通路蛋白高表達(n=3)

2.2 siGPR160抑制GPR160信號通路改善高糖誘導(dǎo)的細胞毒性

通過MTT法進行細胞活力測試，結(jié)果顯示siGPR160可以抑制GPR160蛋白和配體CARTp的表達量(P<0.05)。另外，高糖孵育24、48 h后，150 mmol·L-1GLU組細胞活力明顯降低(P<0.05)；而siGPR160可以增加高糖環(huán)境下RSC96的細胞活力(P<0.05)。見圖2。

* 與Control組比，P<0.05；# 與150 mmol·L-1 GLU+siNC組比，P<0.05A.qRT-PCR法檢測GPR160和CARTp的mRNA水平；B.MTT法檢測RSC96細胞的增殖活性圖2 GPR160信號通路被siGPR60抑制后改善高糖誘導(dǎo)的RSC96的細胞毒性(n=3)

2.3 siGPR160降低高糖誘導(dǎo)的RSC96細胞凋亡和Ca2+水平

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，150 mmol·L-1GLU組細胞凋亡率較Control組明顯升高(P<0.05)，而siGPR160導(dǎo)致凋亡率明顯降低(P<0.05)。另外，150 mmol·L-1GLU組Ca2+水平較Control組明顯升高(P<0.05)，siGPR160導(dǎo)致Ca2+水平明顯降低(P<0.05)。見圖3。

* 與Control組比，P<0.05；# 與150 mmol·L-1 GLU+siNC組比，P<0.05A.通過流式細胞儀檢測RSC96的細胞凋亡和統(tǒng)計結(jié)果；B.通過流式細胞儀檢測RSC96中Ca2+水平的圖像和統(tǒng)計結(jié)果(n=3)圖3 siGPR160降低高糖誘導(dǎo)的RSC96的細胞凋亡率和Ca2+水平

2.4 siGPR160保護高糖環(huán)境下ER形態(tài)的完整性

如圖4所示，48 h Control組ER膜結(jié)構(gòu)清晰完整，而150 mmol·L-1GLU組ER膜形態(tài)部分膨潤且不均勻，并出現(xiàn)ER的碎片形態(tài)。在150 mmol·L-1GLU+siGPR160組中，ER的形態(tài)趨于結(jié)構(gòu)完整。

圖4 GPR160信號通路在高糖環(huán)境下保護ER形態(tài)的完整性48 h ER的超微結(jié)構(gòu)(×8 000)

2.5 GPR160信號通路調(diào)控ER應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達

進一步檢測CHOP相關(guān)蛋白GADD34和Ero1α的表達發(fā)現(xiàn)，150 mmol·L-1GLU組GADD34和Ero1α的表達較Control組明顯增加(P<0.05)；與150 mmol·L-1GLU+siNC組相比，150 mmol·L-1GLU+siGPR160組GADD34和和Ero1α的表達降低。繼續(xù)檢測CHOP上游蛋白IRE1α和XBP-1的表達發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，150 mmol·L-1GLU組中IRE1α和XBP-1的表達明顯增加(P<0.05)，而且與150 mmol·L-1GLU+siNC組相比，150 mmol·L-1GLU+siGPR160組IRE1α和XBP-1的表達明顯降低(P<0.05)。見圖5。

* 與Control組比，P<0.05；# 與150 mmol·L-1 GLU+siNC組比，P<0.05圖5 siGPR160降低高糖誘導(dǎo)的RSC96細胞中GADD34和Ero1α以及CHOP上游蛋白IRE1α和XBP-1的表達(n=3)

3 討 論

全球糖尿病的發(fā)病率一直在上升，每年新增約100萬例[6]。由于DPN患者可用藥物的副作用，導(dǎo)致不得不停止使用[6]。高糖引起ER應(yīng)激與DPN的發(fā)病機制有關(guān)[7]，例如在高糖狀態(tài)下活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生增加[7],長時間接觸會耗盡內(nèi)源性抗氧化防御機制并導(dǎo)致細胞功能障礙和(或)死亡[8]。另外，DPN病理特征是軸突周圍的髓鞘出現(xiàn)腫脹、變性、結(jié)構(gòu)異常，又稱脫髓鞘性病變。SCs作為外周神經(jīng)系統(tǒng)中主要的髓鞘形成細胞，在周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)再生過程中起著關(guān)鍵作用[2]。因此改善高糖引起的SCs損傷有望成為治療DPN的理想策略。

最新研究表明，GPCR的調(diào)制藥物主要針對糖尿病、肥胖和阿爾茨海默病[5,9]。CARTp是一種GPCR的配體，研究表明廣泛表達于大腦區(qū)域的CARTp可參與人體食欲調(diào)控，在糖尿病型肥胖大鼠中CARTp的表達明顯高于非糖尿病肥胖大鼠，說明CARTp可能具有糖尿病治療方面的臨床應(yīng)用潛力，但由于CARTp肽受體的缺失，基于CARTp的合適療法的發(fā)展一直處于停滯狀態(tài)[10-11]。最新研究將GPR160鑒定為CARTp的同源受體，并證明其在疼痛調(diào)節(jié)中的重要性[12]，但有關(guān)GPR160和其配體CARTp在DPN中的調(diào)節(jié)作用還不清楚。本研究通過體外建立高糖誘導(dǎo)SCs模型，我們觀察到GPR160和配體CARTp的表達在高糖誘導(dǎo)的SCs中表達明顯上調(diào)，我們進一步深入探討了GPR160對高糖誘導(dǎo)的SCs凋亡和ER應(yīng)激損傷的調(diào)節(jié)機制。

SCs細胞凋亡是DPN的主要發(fā)病機制之一，而之前的研究已經(jīng)證明GPR160信號通路參與誘導(dǎo)前列腺癌細胞的凋亡并且與細胞周期的阻滯有關(guān)[13]。另外，ER是鈣的主要儲存細胞器，細胞內(nèi)Ca2+對于ER的發(fā)育是必不可少的。鈣過載被確定為細胞凋亡的一個因素[14]，并參與ER應(yīng)激[15]。本研究中150 mmol·L-1GLU組Ca2+水平較Control組明顯升高，這表明細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞并導(dǎo)致細胞凋亡，而當(dāng)使用siGPR160沉默GPR160表達后可以明顯降低Ca2+水平。我們利用Annexin V/PI染色的研究同樣得到類似結(jié)果，提示GPR160信號通路可以抑制高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡。

CHOP是ER應(yīng)激的標(biāo)志信號，CHOP的上調(diào)可以誘導(dǎo)Ero1α和GADD34的表達，Ero1α甚至可以直接引發(fā)細胞凋亡，而GADD34導(dǎo)致ER中錯誤折疊蛋白的合成，因此GADD34/Ero1α激活或高表達可以直接或間接誘導(dǎo)ER應(yīng)激和細胞凋亡[16-18]。因為GPR160信號通路被siGPR160抑制后降低了高糖誘導(dǎo)的GADD34和Ero1α表達，我們假設(shè)這是由于下調(diào)CHOP上游蛋白的表達所致。IRE1α是3種未折疊蛋白反應(yīng)跨膜蛋白之一，可以通過誘導(dǎo)XBP-1的表達來誘導(dǎo)CHOP蛋白的表達，當(dāng)ER應(yīng)激發(fā)生時，游離IRE1α被二聚化和磷酸化激活，并通過轉(zhuǎn)錄因子XBP-1 mRNA的裂解誘導(dǎo)下游XBP-1表達，最終激活下游凋亡蛋白CHOP[19-21]。因此，我們進一步檢測了IRE1α和XBP-1的表達，結(jié)果表明抑制GPR160信號通路能顯著下調(diào)高糖SCs模型中的IRE1α和XBP-1的表達。

當(dāng)ER應(yīng)激持續(xù)時間較長時，ER穩(wěn)態(tài)不能及時恢復(fù)；ER凋亡機制被激活。為了探討GPR160對ER應(yīng)激損傷的影響，我們利用電子顯微鏡分析了亞細胞超微結(jié)構(gòu)，觀察ER的形態(tài)發(fā)現(xiàn)150 mmol·L-1GLU組的ER形態(tài)部分腫脹甚至破碎，表明ER中蛋白過度積累和細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞，進而誘發(fā)ER應(yīng)激，然而150 mmol·L-1GLU+siGPR160組中ER形態(tài)趨于結(jié)構(gòu)完整，說明抑制GPR160信號通路可以保持ER形態(tài)的完整性。

綜上所述，沉默GPR160抑制GPR160信號通路降低了高糖誘導(dǎo)的SCs Ca2+水平和細胞凋亡，并且與抑制ER應(yīng)激細胞凋亡通路中CHOP相關(guān)通路有關(guān)。本研究表明高糖環(huán)境下抑制GPR160信號通路對SCs具有保護作用，GPR160信號通路是DPN中SCs凋亡的潛在治療靶點。