余周慶，童國勇，徐佳，王曦，戈春城

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 口腔科，湖北 恩施 445000)

頭頸部鱗狀細胞癌是世界上最致命的癌癥之一，以口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)亞型最為常見[1]，其特點是轉移和復發(fā)率高，對傳統(tǒng)化療耐藥[2]。手術切除是早期OSCC患者的首選治療方法。但對于晚期OSCC患者，主流治療方案是綜合治療，術前誘導緩解、手術及術后放療的效果已得到廣泛認可[3-5]。然而術前誘導化療耐藥問題一直是研究熱點，評估晚期OSCC患者的化療效果和生存率將有助于優(yōu)化治療策略。目前已有多項文獻報道了OSCC化療和預后的生物標志物，但只有少數(shù)生物標志物得到了充分數(shù)據(jù)的驗證和支持[6-8]，例如白細胞介素24高表達與頭頸部鱗狀細胞癌總生存時間較長顯著相關，但是其在早期診斷或監(jiān)測疾病方面效果并不令人滿意[7]。事實上，通過常規(guī)測試(如血液生化)預測化療反應以及識別有效的標志物，將有相當大的臨床益處。胰島素樣生長因子結合蛋白-2(insulin-like growth factor binding protein-2，IGFBP-2)最初被認為是一種結合并調節(jié)胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)-Ⅰ和IGF-Ⅱ生長激素活性的蛋白[9]。最近有研究證實，IGFBP-2通過與整合素結合可激活多條信號通路，導致多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和耐藥[10-12]。然而到目前為止，還沒有研究關注IGFBP-2在OSCC進展和預后中的作用。在本研究中，我們旨在探索IGFBP-2作為潛在的預后和化療生物標志物的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2012年1月至2017年5月，作者從我院耳鼻咽喉科和口腔頜面外科的143例局部晚期OSCC患者(晚期OSCC組，臨床分期為Ⅲ～Ⅳa期，男81例，女62例，年齡25～86歲)、129例臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的OSCC患者(男75例，女54例，年齡24～91歲)和152例健康對照者(男75例，女77例，年齡25～90歲)在獲得機構倫理(倫理批號：201208)批準和患者知情書面同意后獲取血清樣本，此外所有OSCC患者進行了組織活檢。健康對照組包含20例健康口腔組織，取自接受整容手術的志愿者(男6例，女14例，年齡25～57歲)，這些患者沒有任何感染性或炎癥性口腔病變。納入標準：經(jīng)病理組織學證實為OSCC的患者，其臨床資料完整，東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)評分為0～2分，既往未接受過手術或放化療。排除標準：合并其他惡性腫瘤、肺轉移、自身免疫性疾病、內分泌系統(tǒng)疾病、嚴重心腦血管疾病、治療禁忌證、無法配合精神障礙治療、退出實驗或失去隨訪的患者。

1.2 治療方案

所有晚期OSCC患者接受誘導化療方案如下：d1：靜脈滴注多西他賽(中國齊魯藥業(yè)股份有限公司，H20041129)，劑量為75 mg·m-2；d1～3：靜脈滴注75 mg·m-2順鉑(中國齊魯制藥股份有限公司，H20023461)；d1～5：靜脈滴注5-氟尿嘧啶(中國上海旭東海浦制藥有限公司，H31020593)，劑量為750 mg·m-2。每3周給藥1次，共2個周期。誘導完成至少2周后進行手術。隨訪治療：對原發(fā)病灶進行根治性手術和全頸淋巴結清掃，然后進行適當?shù)闹亟āＰg后5周 開始放射治療，標準適形或調強放射治療劑量為1.8或2 Gy·d-1，每周5 d，共6周，總劑量為54～60 Gy。

1.3 治療反應判斷

在誘導化療結束2周后(手術前)，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的實體瘤療效評估標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Version 1.1，RECIST 1.1)[13]評估治療反應。療效評估和相應癥狀如下：完全緩解(completed response，CR)為病變完全消失，部分緩解(partial response，PR)為誘導化療后體積減少30%，疾病進展(progressive disease，PD)為基線病變最長直徑增加至少20%或產(chǎn)生新病變，穩(wěn)定疾病(stable disease，SD)為基線病變的最長直徑減少至小于PR或增加至小于PD。根據(jù)常見不良反應事件評價標準4.0版(Common Terminology Criteria for Adverse Events Version 4.0，CTCAE 4.0版)[14]評估毒性。根據(jù)療效，我們將CR/PR定義為治療有反應，SD/PD定義為治療無反應。

1.4 隨訪

第1年每2個月隨訪1次，第2年每3個月隨訪1次，在接下來的3～5年中，每6個月進行1次隨訪。總生存(overall survival，OS)時間定義為從確診日期到死亡的時間。

1.5 檢測指標

1.5.1 資料收集 詳細的臨床病史，包括年齡、性別、癥狀、病程、不良的口腔習慣(如吸煙、咀嚼檳榔)、飲酒、病變的臨床細節(jié)、組織學分級、臨床分期、療程、結果和復發(fā)。腫瘤(T)分期、淋巴結(N)狀態(tài)和臨床分期根據(jù)1997年美國癌癥聯(lián)合委員會系統(tǒng)TNM標準[15]進行分類。

1.5.2 免疫組織化學染色 隨機選取20例晚期OSCC組織、20例Ⅰ～Ⅱ期OSCC組織，年齡、性別構成與20例健康對照組織的來源患者相匹配(P>0.05)。將組織固定在10%中性緩沖福爾馬林中，并按照標準程序進行組織病理學檢查。切下5 μm厚的切片，在二甲苯中脫蠟，然后在梯度遞減的乙醇溶液中水合。使用EZ抗原修復系統(tǒng)(美國BioGenex)在95 ℃的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中加熱樣本15 min進行抗原熱修復，然后用過氧化物酶阻斷劑中和內源性過氧化物酶5 min，之后用標準親和素-生物素過氧化物酶對鼠抗人IGFBP-2(1∶400稀釋度，英國Biorbyt公司)進行免疫染色。通過H評分評估IGFBP-2表達。面積百分比陽性率分級：<10%=0，10%～25%=1，26%～50%=2，51%～75%=3，>75%=4。強度評估分級：0=無，1=輕度，2=中度，3=強染色。面積百分比分數(shù)(0～4)乘以強度分數(shù)(0～3)計算H評分，0～4分為陰性染色，5～12為陽性染色[16]。取5個最佳視野用于解釋免疫組織化學結果。

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附測定 所有確診的OSCC患者術前和健康對照組入組時均采集血樣，另外對于晚期OSCC組患者在評估誘導化療反應時采集血樣。將血樣在室溫下放置60 min，并經(jīng)3 500 r·min-1離心15 min。將上清液等分，然后儲存在-80 ℃，直到使用。使用人IGFBP-2酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測量血清IGFBP-2水平，對每個采集的樣本進行3次重復檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 免疫組織化學結果比較

健康對照組織(n=20)、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期OSCC組織(n=20)和晚期OSCC組織(n=20)中IGFBP-2蛋白陽性表達率分別為0(0/20)、20.0%(4/20)、80.0%(16/20)，其中晚期OSCC組織中IGFBP-2蛋白陽性表達率最高，與其他2組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=31.198，P<0.001)，見圖1。

圖1 免疫組織化學染色典型圖片(×400)Fig 1 Typical picture of immunohistochemical staining(×400)

2.2 3組受試者血清IGFBP-2水平比較

晚期OSCC組患者血清IGFBP-2水平顯著高于152例健康對照者[423.28(338.52，534.36)ng·ml-1vs. 71.80(51.30，80.70)ng·ml-1，P<0.001]和129例Ⅰ～Ⅱ期OSCC患者[423.28(338.52，534.36)ng·ml-1vs. 154.33(138.23，186.71)ng·ml-1，P<0.001]。經(jīng)ROC曲線分析血清IGFBP-2用于診斷OSCC以及區(qū)分局部晚期OSCC的AUC分別為0.844(95%CI0.807～0.880，靈敏度為100.0%，特異度為52.3%)、0.954(95%CI0.932～0.975，靈敏度為84.3%，特異度為91.0%)。然而血清IGFBP-2用于早期OSCC診斷的AUC僅為0.678(95%CI0.627～0.749，靈敏度為72.6%，特異度為47.3%)。見圖2。

圖2 ROC曲線分析治療前血清IGFBP-2的診斷價值Fig 2 ROC curve analysis of the diagnostic value of serum IGFBP-2 before treatment

2.3 局部晚期OSCC患者血清IGFBP-2水平與誘導化療反應的關系

治療后，143例局部晚期OSCC患者中CR 29例，PR 68例，SD 31例，PD 15例。治療期間主要不良反應為惡心、嘔吐、脫發(fā)、白細胞減少等輕微不良反應。在積極對癥治療后觀察到97例患者病情緩解(有反應亞組)。與治療前相比，治療后血清IGFBP-2水平顯著降低[293.62(216.85，394.77)ng·ml-1vs. 423.28(338.52，534.36)ng·ml-1，Z=-7.374，P<0.001]。此外無反應亞組患者治療前血清IGFBP-2水平顯著高于有反應亞組[508.64(426.92，650.0)ng·ml-1vs. 347.36(253.08，460.20)ng·ml-1，Z=-5.324，P<0.001]。進一步構建ROC曲線，治療前血清IGFBP-2在預測療效方面的AUC值為0.776(95%CI：0.699～0.853)，最佳臨界值為397.54 ng·ml-1，敏感度為89.1%，特異度為59.8%(圖3)。

圖3 ROC曲線分析治療前血清IGFBP-2在預測誘導化療反應方面的價值Fig 3 ROC curve analysis of the value of serum IGFBP-2 in predicting induced chemotherapy response before treatment

2.4 局部晚期OSCC患者血清IGFBP-2水平與生存預后的關系

中位隨訪時間為59.0個月(范圍為1～78個月)，OS率為57.34%(82/143)。以治療前血清IGFBP-2的中位值(423.28 ng·ml-1)為截點，將其分為高表達亞組(≥423.28 ng·ml-1)和低表達亞組(<423.28 ng·ml-1)。生存分析顯示，與低表達亞組患者相比，高表達亞組患者的OS較短(χ2=39.474，P<0.001)(圖4)。單變量COX回歸分析表明BMI、誘導化療反應和血清IGFBP-2表達是晚期OSCC患者的重要預后因素(P<0.05)，另外在多變量COX分析中納入了P<0.01的因素，結果表明血清IGFBP-2水平升高是晚期OSCC患者OS的獨立危險因素(表1)。

表1 單因素和多因素COX回歸分析Tab 1 Single factor and multi factor COX regression analysis

圖4 Kaplan-Meier生存曲線分析局部晚期OSCC患者血清IGFBP-2水平與OS的關系Fig 4 Kaplan-Meier survival curve analysis of the relationship between serum IGFBP-2 level and OS in patients with advanced OSCC

3 討 論

TPF(多西紫杉醇、順鉑和5-氟尿嘧啶)誘導化療方案已被證明對晚期OSCC患者有益[3,5]。然而，一些研究表明，OSCC對這種治療的反應有限；這些報道強調了識別與治療反應相關的生物標志物的重要性[6-8]。在我們的研究中，IGFBP-2在局部晚期OSCC患者血清中表達水平普遍升高，對局部晚期OSCC具有良好的診斷價值。此外，治療后血清IGFBP-2水平顯著降低，且IGFBP-2高表達的OSCC患者化療不敏感的風險增加，這反過來又預示著較差的OS預后。我們的研究首次強調了IGFBP-2作為OSCC輔助化療和預后評估的生物標志物的作用，這對未來的醫(yī)學應用具有重要意義。

IGF是一種具有多種生物學功能的調節(jié)肽，如細胞增殖、分化和抗凋亡[9-10]。IGF系統(tǒng)由兩個肽配體(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)、6個高親和力IGF結合蛋白(IGFBP-1～IGFBP-6)和兩個IGF受體(IGF-ⅠR和IGF-ⅡR)組成[9]。IGFs的作用由IGFBPs以積極或消極的方式調節(jié)，這具體取決于組織類型和生理狀態(tài)[10-11]。IGFBP家族的蛋白質可同時調節(jié)IGF和整合素信號，并且是其他腫瘤類型中細胞生長、侵襲和抵抗的介質[12,14]。在人體中，IGFBP-3、IGFBP-2是血清中含量最高的2種IGFBP[17]。目前IGFBP-3與OSCC高度相關的結論已基本被證實，但是IGFBP-2是否可作為OSCC診斷和預后生物標志物尚缺乏明確證據(jù)。與IGFBP-3抗腫瘤活性[18]不同，IGFBP-2可促進腫瘤發(fā)生，癌細胞侵襲、轉移和腫瘤干細胞增殖[10-11]。由于IGFBP-2是一種分泌蛋白[10]，之前的研究觀察到，血清IGFBP-2在各種類型癌癥中的表達水平增加，包括膠質瘤[16,18]、肝細胞癌[11]、腎透明細胞癌[12]，本研究結論與之基本相符，在本研究中我們檢測了健康對照組、早中期和局部晚期OSCC患者的血清IGFBP-2水平，其中局部晚期OSCC患者血清IGFBP-2水平顯著升高。這表明IGFBP-2可能參與了OSCC的疾病進展。此外高血清IGFBP-2水平與腫瘤組織IGFBP-2陽性表達有關，而且與治療前相比，治療后血清IGFBP-2水平顯著降低，因此我們推斷血清IGFBP2可能部分來源于腫瘤細胞。但是我們無法測量聯(lián)合治療后殘余腫瘤組織中IGFBP-2的表達水平，因此，需要進一步探討血清IGFBP-2的主要來源。

在已發(fā)表的報道中，IGFBP-2可調節(jié)許多細胞信號通路。例如通過IGFBP-2沉默，口腔癌細胞OC3和OC3-I5的遷移和侵襲能力以及包括轉錄因子Twist和Snail在內的上皮-間充質轉化相關蛋白均降低[19]。在本研究中，我們首次評估了血清IGFBP-2在局部晚期OSCC患者中的預后作用，并證明血清IGFBP-2高水平是局部晚期OSCC患者的一個獨立不良預后因素。此外，我們的臨床研究小組和其他研究小組的研究結果都已經(jīng)表明，絕大多數(shù)OSCC對現(xiàn)有的化療方案有耐藥風險[3-5]。IGFBP-2已被證明在許多器官系統(tǒng)的腫瘤發(fā)生、進展和化療耐藥中起著關鍵作用，并且是OSCC中多個關鍵激活信號通路的已知調節(jié)劑，例如Tsai等[20]利用干擾RNA和重組蛋白技術確認了IGFBP-2在口腔癌轉移中的積極促進作用，尿激酶型纖溶酶原激活劑被證實是IGFBP-2的下游靶點，可促進口腔癌的中期轉移。此外上調IGFBP-2表達可促進細胞增殖、遷移和侵襲，這些都與IGFBP-2促轉移潛能有關[19]。Hur等[21]在一部分原發(fā)性食管腺癌中觀察到IGFBP-2高表達，而且敲除IGFBP-2會以血清依賴性方式增加腫瘤細胞對順鉑的敏感性，這種化學增敏作用機制可能與IGFBP-2沉默可激活IGF1誘導的蛋白激酶B通路，并失活順鉑誘導的胞外信號調節(jié)的激酶通路有關。基于這些臨床前分子機制，我們也研究了其在預測局部晚期OSCC誘導化療耐藥中的效用。雖然IGFBP-2的表達在從健康對照組織到OSCC的進展所代表的疾病譜中有所不同，但本研究納入的局部晚期OSCC組織和血清樣本均有非常高的IGFBP-2表達水平。與獲得治療CR/PR的患者相比，未獲得有效治療反應的患者基線血清樣本中IGFBP-2水平更高，這表明一些腫瘤的化療耐藥機制可能與IGFBP-2高表達有關。

綜上所述，目前的研究表明，血清IGFBP-2在局部晚期OSCC患者中上調，可作為局部晚期OSCC診斷、治療和預后的生物標志物。然而，本研究仍存在一些不足之處，例如IGFBP-2在口腔鱗狀細胞癌細胞耐藥中的作用機制尚不清楚。此外，該研究的樣本規(guī)模較小，需要進一步擴大樣本以驗證我們的結果。