劉楠楠，宋珊珊，李凡

(遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)阜新礦總醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 阜新 123000)

輔助化療(ACT)是目前結(jié)腸癌術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)的治療方案[1-2]。然而眾多臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，即使處于同一病理階段，患者的個(gè)體復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)也存在很大差異[3-4]。因此，考慮到ACT對(duì)結(jié)腸癌(CC)的適度益處和相關(guān)毒性，尋找一種有效的生物標(biāo)志物來前瞻性地區(qū)分能夠從ACT中獲益的患者，具有重要的臨床意義。在ACT過程中，CC中許多重要的信號(hào)通路被解除調(diào)控，例如Wnt、Ras、p53信號(hào)通路。DEAH盒解旋酶(DHX)33是ATP依賴性RNA解旋酶的DEAH-box家族成員之一，對(duì)RNA代謝至關(guān)重要[5]。例如胞質(zhì)DHX33參與mRNA翻譯起始，而細(xì)胞核DHX33在細(xì)胞周期進(jìn)展、遷移和核糖體RNA合成過程中調(diào)節(jié)特定的基因轉(zhuǎn)錄。重要的是，DHX33還被發(fā)現(xiàn)在感應(yīng)dsRNA以啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。然而DHX33在人類癌癥中的作用仍然難以確定。本研究旨在分析組織DHX33表達(dá)與可切除CC患者術(shù)后ACT預(yù)后的關(guān)系，從而為探索DHX33對(duì)癌癥進(jìn)展的影響提供一些線索。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本研究納入了215例CC手術(shù)切除患者的甲醛固定-石蠟包埋(FFPE)組織。所有患者均于2014年1月至2018年9月期間在我院接受CC根治性切除。該研究由當(dāng)?shù)蒯t(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)審查和批準(zhǔn)。在采集樣本之前，獲得每位患者的知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根 據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟/美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第八版癌癥分期系統(tǒng)(至少由兩名我院病理學(xué)專家審查)，經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)為原發(fā)性CC[7-8]；(2) 接受腫瘤根治性切除，然后接受標(biāo)準(zhǔn)化療方案；(3) 之前沒有接受過化療或放療者。在免疫組識(shí)化學(xué)染色前，通過蘇木精和伊紅染色對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行鑒定，以確保腫瘤細(xì)胞富集。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 術(shù)前接受新ACT和(或)輔助放療者；(2)因肉眼可見的殘留病灶或接受非根治性切除手術(shù)而接受R2切除術(shù)的患者以及未接受ACT的患者；(3)術(shù)后短期內(nèi)(≤3個(gè)月)死亡者。

1.2 治療及隨訪

進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的CC根治性切除后，由內(nèi)科腫瘤學(xué)專家考慮患者術(shù)后恢復(fù)時(shí)間，個(gè)體化啟動(dòng)ACT。包括FOLFOX(奧沙利鉑130 mg·m-2，d1，靜脈滴注；亞葉酸鈣200 mg·m-2，d1～d2，靜脈滴注；5-氟尿嘧啶，d1～d2，靜脈推注；5-氟尿嘧啶600 mg·m-2，靜脈持續(xù)滴注，d1～d2。每2周為1個(gè)療程)、FOLFIRI(伊立替康180 mg·m-2，d1，靜脈滴注；亞葉酸鈣400 mg·m-2，d1，靜脈滴注；5-氟尿嘧啶400 mg·m-2，d1,靜脈推注；之后給予5-氟尿嘧啶靜脈泵入，2 400 mg·m-2，持續(xù)46 h。每2周為1個(gè)療程)、XELOX(奧沙利鉑130 mg·m-2，d1，靜脈注射；希羅達(dá)1 000 mg·m-2，d1～d14，口服，每日2次。每3周為1個(gè)療程)、sLV5FU2(亞葉酸鈣400 mg·m-2，d1，靜脈滴注；5-氟尿嘧啶400 mg·m-2，d1，1 200 mg·m-2，d2～d3，靜脈輸注，總量2 400 mg·m-2，輸注46～48 h。每2周為1個(gè)療程)或希羅達(dá)(希羅達(dá)1 000 mg·m-2，d1～d14，口服，每日2次，休息7 d。每3周為1個(gè)療程)治療。選定的患者在腫瘤位置、腫瘤浸潤(rùn)深度、直腸周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、環(huán)切緣、合并癥和術(shù)后表現(xiàn)評(píng)分方面評(píng)估后接受術(shù)后放療。所有手術(shù)患者在前5年內(nèi)每隔3個(gè)月或6個(gè)月進(jìn)行1次隨訪，此后每年進(jìn)行1次。從手術(shù)到第1次確診復(fù)發(fā)的時(shí)間，或最后1次接觸時(shí)沒有復(fù)發(fā)的存活時(shí)間被定義為無病生存時(shí)間，從手術(shù)到最后1次隨訪或死亡的時(shí)間被定義為總生存時(shí)間。

1.3 組織DHX33表達(dá)檢測(cè)

樣本在離體20 min內(nèi)采集，確保樣本新鮮。在癌灶處取CC組織，在離癌灶遠(yuǎn)側(cè)或近側(cè)15 cm處取正常結(jié)腸組織作為對(duì)照。用甲醛固定，制備石蠟切片。取FFPE組織切片后，在二甲苯和分級(jí)乙醇溶液中脫蠟，水化，并在PBS中洗滌。在微波爐中預(yù)處理后，內(nèi)源性過氧化物酶在3%過氧化氫/甲醇溶液中抑制20 min，然后使用生物素阻斷試劑盒阻斷親和素。之后將載玻片與DHX33抗體(1∶400，貨號(hào)sc-137424，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)在4 ℃潮濕室內(nèi)孵育過夜，PBS洗滌，并與生物素化的山羊抗兔/小鼠抗體孵育。玻片用DAB顯影，蘇木精復(fù)染。半定量免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)用于確定DHX33蛋白質(zhì)水平。使用H評(píng)分法，將百分比評(píng)分乘以染色強(qiáng)度評(píng)分。陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分比評(píng)分為0(0)、1(1%～25%)、2(26%～50%)、3(51%～75%)、4(76%～100%)。強(qiáng)度評(píng)分為0(陰性染色)、1(弱染色)、2(中度染色)、3(強(qiáng)染色)。對(duì)于每種情況，隨機(jī)選擇1 000個(gè)細(xì)胞并進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分由兩名病理學(xué)專家獨(dú)立決定。H評(píng)分≥4分被判斷為高表達(dá)。

1.4 其他檢測(cè)指標(biāo)

采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)FFPE組織錯(cuò)配修復(fù)蛋白[人類Mutl同源物1(hMLH1)、人類減數(shù)分裂后分離增強(qiáng)蛋白2(hPMS2)、人類MutS同源物(hMSH)2、hMSH6]，任意1個(gè)以上蛋白表達(dá)缺失則視為微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)狀態(tài)；抗體購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。提取FFPE組織DNA，采用ARMS-PCR法檢測(cè)BRAF V600E基因突變、KRAS基因外顯子2第12、13位密碼子突變，QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒和基因突變檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 DHX33在腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平

IHC顯示DHX33主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，在CC細(xì)胞中多呈陽(yáng)性染色(圖1)。與癌旁正常組織(17.67%，38/215)相比，53.95%(116/215)的腫瘤組織樣本中DHX33呈高表達(dá)(χ2=61.545，P<0.001)。

圖1 腫瘤組織和癌旁正常組織中DHX33蛋白表達(dá)(×400)Fig 1 DHX33 protein expression in tumor tissues and normal tissues adjacent to cancer (×400)

2.2 CC組織中DHX33表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

對(duì)比不同臨床病理特征的DHX33不同表達(dá)狀態(tài)，與DHX33低表達(dá)亞組相比，DHX33高表達(dá)亞組CC組織MSI比例、cTNM Ⅲ～ⅣA期比例及癌旁正常組織DHX33蛋白高表達(dá)比例更高(P<0.05)。見表1。

表1 CC組織中DHX33表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 The relationship between the expression level of DHX33 in CC tissues and clinical pathological characteristics

(續(xù)表)

2.3 COX回歸模型分析CC患者遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)/生存預(yù)后

隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)65例(30.23%)，死亡44例(20.47%)。Kaplan-Meier分析(LOG-RANK檢驗(yàn))顯示DHX33低表達(dá)者無病生存時(shí)間(χ2=12.566，P<0.001)和總生存時(shí)間(χ2=13.986，P<0.001)更長(zhǎng)(圖2)。此外，單因素及多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，年齡、術(shù)前血清CEA水平、cTNM分期、病理分級(jí)、CC組織DHX33蛋白表達(dá)是影響手術(shù)+ACT治療后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)期死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，表2、3)。

圖2 腫瘤組織DHX33表達(dá)狀態(tài)與CC患者生存時(shí)間的Kaplan-Meier生存曲線Fig 2 Kaplan-Meier survival curve between DHX33 expression status in tumor tissue and survival time of CC patients

表2 單因素分析影響CC患者預(yù)后不良的臨床因素Tab 2 Univariate analysis of clinical factors affecting poor prognosis of CC patients

表3 多因素分析影響CC患者預(yù)后不良的臨床因素Tab 3 Multivariate analysis of clinical factors affecting poor prognosis of CC patients

3 討 論

CC的發(fā)病是一個(gè)多基因相關(guān)、多步驟的復(fù)雜過程[9-11]。根治性切除手術(shù)后的ACT是Ⅱ期和Ⅲ期CC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，可大大降低局部復(fù)發(fā)率并提高患者的生存預(yù)后。然而一部分患者無法在ACT中獲益[12]。既往有很多與CC術(shù)后ACT預(yù)后相關(guān)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物研究[13-15]，然而靈敏度和特異度有限。在本研究中，我們調(diào)查了可切除CC中DHX33蛋白的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)DHX33高表達(dá)的腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高。據(jù)我們所知，這是第1項(xiàng)證明DHX33可以作為術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的研究。

DEAD/H盒蛋白屬于RNA解旋酶中最大的一類，具有多種保守基序，包括Asp-Glu-Ala-Asp/His(DEAD/H)。已發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)在涉及RNA/DNA結(jié)構(gòu)改變的許多細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，例如翻譯起始、核/線粒體mRNA剪接、核糖體/剪接體組裝、miRNA生物發(fā)生和RNA衰變。DHX33是DEAD/DEAH盒蛋白家族的成員，在肺癌、肝癌和淋巴瘤中高度表達(dá)[16-17]。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)，DHX33基因下調(diào)可導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖和遷移顯著降低。在機(jī)制上，DHX33可調(diào)控一組參與細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的關(guān)鍵基因，以促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展，這也強(qiáng)調(diào)了其在治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的潛力[18]。此外DHX33缺乏可導(dǎo)致Bcl-2下調(diào)和BAD上調(diào)，以支持CC細(xì)胞凋亡[19]?；谏鲜鰯?shù)據(jù)分析，我們推斷DHX33在CC中的過度表達(dá)對(duì)于維持CC的惡性表型至關(guān)重要，并且可能參與CC的發(fā)生和發(fā)展。這一點(diǎn)也解釋了本研究中組織DHX33過表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。

最近Wang等[20]發(fā)現(xiàn)，DHX33基因消融消除了大多數(shù)由Ras驅(qū)動(dòng)的肺腺癌發(fā)展。但在少數(shù)情況下，仍然能觀察到DHX33基因敲除小鼠出現(xiàn)惡性病變，盡管效率和速度都要低得多，這可能是由于替代上游信號(hào)的激活。Wnt途徑中的β-連環(huán)蛋白可隨著DHX33基因敲除而顯著下調(diào)，這意味著DHX33在調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)中起著關(guān)鍵作用[5]。RNA解旋酶DHX33已被證明是細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，其功能背后的潛在機(jī)制仍不完全清楚，目前的一些證據(jù)表明DHX33轉(zhuǎn)錄控制參與細(xì)胞周期的基因表達(dá)，尤其是細(xì)胞周期蛋白、E2F1、細(xì)胞分裂周期和微染色體維持基因。DHX33與這些基因的啟動(dòng)子發(fā)生物理關(guān)聯(lián)，并控制活性RNA聚合酶Ⅱ在這些啟動(dòng)子上的裝載。DHX33缺乏會(huì)破壞細(xì)胞周期進(jìn)程和DNA復(fù)制，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。例如Yuan等[21]發(fā)表的一項(xiàng)來自肺組織的RNA測(cè)序分析表明，DHX33缺乏可導(dǎo)致基因表達(dá)的整體變化。由于這些RNA是從具有異質(zhì)細(xì)胞起源的肺組織中提取的，我們不能排除許多基因在癌癥發(fā)展過程中受到DHX33間接調(diào)控或僅受Ras調(diào)控的可能性。盡管如此，DHX33顯然在Ras驅(qū)動(dòng)的腫瘤發(fā)生過程中起著關(guān)鍵和多方面的作用。這也解釋了為何CC腫瘤被根治性切除后，組織DHX33高表達(dá)仍然能夠預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，本研究表明，原發(fā)性腫瘤組織中DHX33高表達(dá)可能是CC患者根治性手術(shù)+ACT治療后復(fù)發(fā)和死亡的強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子。因此DHX33可作為一種臨床生物標(biāo)志物，用于識(shí)別可從ACT積極管理策略中獲益的患者。