宋旭東，羅波，陳華軒，張逵，王瀟婭

(南充市中心醫(yī)院 神經(jīng)外科，四川 南充 637000)

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見(jiàn)的源自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的原發(fā)性顱腦腫瘤，該病不同病理級(jí)別患者的臨床治療方案存在較大差別，且預(yù)后差異也較大[1]。膠質(zhì)瘤具有惡性程度高、術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，雖然對(duì)腦膠質(zhì)瘤的術(shù)前評(píng)估及治療手段不斷完善，但術(shù)后高復(fù)發(fā)率及高相關(guān)并發(fā)癥仍是臨床難以解決且急需解決的問(wèn)題[2]。腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療以手術(shù)切除為主，并結(jié)合放化療等綜合治療手段[3]。血漿基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)被認(rèn)為對(duì)溶栓后出血有預(yù)測(cè)作用[4-5]，MMP-2為最主要的降解細(xì)胞外基質(zhì)之一，與腦膠質(zhì)瘤之間的關(guān)系最為密切，其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲性均存在密切相關(guān)性[6]。臨床研究[7]表明，降低MMP-2的表達(dá)水平可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移及侵襲。微小RNA(microRNA，miR)是一類(lèi)由18～25個(gè)核苷酸組成的小分子非編碼RNA,通過(guò)與靶基因的mR結(jié)合，抑制其翻譯或促進(jìn)降解,從而起到調(diào)控靶基因表達(dá)的作用[8]。miR在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已有廣泛研究，且有研究[9]表明可通過(guò)部分miR對(duì)MMP-2進(jìn)行調(diào)控。miR-105在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)[10]，miR-105可通過(guò)靶向緊密連接蛋白ZO-1破壞血管內(nèi)皮屏障，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[11]。

本研究通過(guò)選取2018年7月至2021年7月間于我院行手術(shù)治療的腦膠質(zhì)瘤患者，探討腦膠質(zhì)瘤術(shù)后miR-105、MMP-2的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，為臨床評(píng)估患者的預(yù)后及調(diào)整合適的治療方式提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2018年7月至2021年7月間于我院行手術(shù)治療的腦膠質(zhì)瘤患者89例，收集腦膠質(zhì)瘤組織與瘤旁組織?；颊咴l(fā)病灶術(shù)后按照WHOCNS2016病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)6例，Ⅱ級(jí)30例，Ⅲ級(jí)34例，Ⅳ級(jí)19例；其中男47例，女42例；年齡28～73歲，平均(45.95±12.44)歲。術(shù)后對(duì)患者隨訪(fǎng)9個(gè)月，每月隨訪(fǎng)1次，觀(guān)察是否復(fù)發(fā)。腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)診斷：連續(xù)兩次MRI檢查顯示病灶明顯增大。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 初次手術(shù)；(2) 術(shù)后病理檢查證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤；(3) 年齡≥18歲；(4) 術(shù)前無(wú)放療、化療；(5) 既往體檢及精神狀況正常；(6) 病例資料齊全，臨床隨訪(fǎng)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 患其他原發(fā)性腫瘤及癲癇等；(2) 患腦血管疾病(如腦缺血、腦出血、腦梗死等)；(3) 嚴(yán)重感染；(4) 心、肺、肝、腎功能不全等；(5) 患病毒性肝炎、自身免疫性疾??；(6) 既往有顱腦損傷史；(7) 交流障礙及既往有精神病史；(8) 未按時(shí)隨訪(fǎng)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者或其家屬均自愿且簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞株、試劑和儀器

腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251(上海極威生物科技有限公司)；miR提取試劑盒、熒光定量及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)；TRIzol(RNA 提取試劑盒) 試劑(大連寶生物工程有限公司)；MMP-2試劑盒(福州邁新公司)；miR-105、MMP-2 DNA 序列，miR-105、MMP-2熒光定量相關(guān)引物(上海生工生物工程公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔一抗、二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)；RIPA裂解液、PMSF(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海五相儀器儀表有限公司)；轉(zhuǎn)膜儀(江蘇金域國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng))；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD biosciences公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RT-PCR檢測(cè)組織miR-105表達(dá)水平

用TRIzol法提取組織總RNA，用Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值(A260 nm/A280 nm)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)合成樣品cDNA和進(jìn)行熒光定量 PCR的擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-105相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 免疫組化法檢測(cè)組織中MMP-2表達(dá)水平

取新鮮腫瘤組織，以10%中性甲醛固定24 h后切塊。按照MMP-2試劑盒說(shuō)明書(shū)采用免疫組化SP法進(jìn)行檢測(cè)，切片機(jī)對(duì)石蠟標(biāo)本進(jìn)行4 μm厚切片，將所取腫瘤標(biāo)本先進(jìn)行二甲苯脫蠟，酒精脫水處理，脫水處理完畢后標(biāo)本在pH值為6.0的酸性緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)處理，使用枸櫞酸沖洗液連續(xù)沖洗3次后加10%的過(guò)氧化酶阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶的活性，室溫孵育后再次緩沖液沖洗3次，加血清再次室溫孵育后處理干凈血清，滴加一抗，37 ℃孵育1 h, PBS洗滌3 min 3次，滴加二抗，37 ℃孵育45 min, PBS洗滌3 min 3次，DAB翻譯顯色后自來(lái)水下沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)固定后觀(guān)片。免疫組化閱片：選擇腫瘤組織內(nèi)陽(yáng)性染色密集區(qū)，細(xì)胞核/質(zhì)呈棕黃色顆粒，400倍鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性百分率。未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞為-；≤10%的陽(yáng)性細(xì)胞為+；>10%～≤50%的細(xì)胞陽(yáng)性為++；>50%的細(xì)胞陽(yáng)性為+++。+及以上為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的培養(yǎng)在 5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行；將凍存的細(xì)胞用鑷子從液氮中取出,放入水浴鍋,快速搖動(dòng)至完全消融,解凍后以3 000 r·min-1低速離心5 min,吹打細(xì)胞成細(xì)胞懸液,以1×109L-1接種于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含100 ml·L-1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素，置于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書(shū)上的步驟進(jìn)行：首先制備LipofectAMINETM2000復(fù)合物和DNA復(fù)合物(每孔含4 μg濃度為1 μg·μl-1的質(zhì)粒和246 μl的無(wú)血清培養(yǎng)基)，隨后將二者混勻，溫室靜置20 min。將混合物加入6孔板，溫室培養(yǎng)6 h后更換含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將處理后U251細(xì)胞分為對(duì)照組(NC組)、miR-105組、MMP-2組和miR-105聯(lián)合MMP-2組,對(duì)照組不作任何處理,實(shí)驗(yàn)組中依次加入miR-105、MMP-2和miR-105聯(lián)合MMP-2作用于細(xì)胞48 h。

1.3.3.2 RT-PCR 用TRIzol法促進(jìn)細(xì)胞裂解，添加氯仿0.2 ml，4 ℃條件下12 000 r·min-1離心15 min，取無(wú)色水相上層，添加等體積異丙醇并沉淀。加入適量乙醇(75%)清洗，獲得RNA沉淀，提取總RNA，用Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值(A260 nm/A280 nm)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)合成樣品cDNA和進(jìn)行熒光定量 PCR的擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。存儲(chǔ)在4 ℃條件下。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。將腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U251中的總 RNA 與miR提取后，再以總 RNA 為模板，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，miR則應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-105、MMP-2表達(dá)量。miR-105上游引物5′-TCAAATGCTCAGACTC-3′，MMP-2 上游引物 5′-AGAAGGCTGTGTT-CTTCGCA-3′,GAPDH上游引物5′-TGTTCGACAGTCAGCCGC-3′。

1.3.3.3 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,用RIPA裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以12 000 r·min-1離心10 min，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先將待檢測(cè)蛋白樣品按30 μg·孔-1上樣后行SDS-PAGE電泳，然后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫牛奶粉液封閉2.0 h后，加入相應(yīng)的DIRAS3抗體(1∶1 000)或者β-actin抗體(1∶1 000)，在4 ℃條件下加入相應(yīng)一抗并孵育過(guò)夜，清洗。次日取出膜，在室溫孵育30 min，用TBST溶液(TBS，1 ml·L-1Tween-20)洗膜3次，10 min·次-1，洗去殘余的一抗；分別加HRP標(biāo)記的抗兔或抗小鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。TBST(TBS，1 ml·L-1Tween-20)洗膜3次，10 min次-1，洗去殘余的二抗后最后加入發(fā)光液，曝光處理。ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

1.3.3.4 CCK-8法檢測(cè)U251細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8試劑盒,將處理過(guò)的U251細(xì)胞以5×103個(gè)·孔-1接種在96孔板中, 37 ℃下孵育24、48、72、96 h。加入 CCK-8試劑,再次孵育1 h。采用分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度,平均OD值用于估計(jì)每個(gè)組的細(xì)胞數(shù)量。

1.3.3.5 Transwell法檢測(cè)U251細(xì)胞侵襲和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將8 μm的Transwell分別放于24孔板中,將處理過(guò)的各組U251細(xì)胞置于培養(yǎng)基中,用胰酶進(jìn)行消化,按照每孔2.0×105個(gè)·ml-1的密度加入Transwell小室內(nèi),每孔加入200 μl的細(xì)胞懸液和RPMI 1640培養(yǎng)基,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),棄去培養(yǎng)基,取出小室,10%的甲醇固定,采用結(jié)晶紫染色15 min,PBS洗去浮色,曬干,顯微鏡(×100)下觀(guān)察,隨機(jī)取3個(gè)視野拍照,計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。劃痕實(shí)驗(yàn)：制備U251細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后將數(shù)量相同的U251細(xì)胞種植到5 cm板中，經(jīng)培養(yǎng)過(guò)夜后每個(gè)孔中均鋪滿(mǎn)了均勻單層細(xì)胞，然后使用大小相同的槍頭進(jìn)行劃痕，每個(gè)孔的劃痕粗細(xì)均勻，劃下的細(xì)胞采用 PBS 進(jìn)行清洗，應(yīng)用沒(méi)有血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，在 37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別于 1、12、24 h在倒置顯微鏡下拍照。

1.3.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡 胰酶消化,分別收集各組的U251細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞的密度為1.0×105個(gè)·ml-1時(shí)接種于6孔板中,然后3 000 r·min-1離心5 min,離心半徑為11 cm,離心完成后棄上清,重懸細(xì)胞,加入Annexin V-FITC/PI雙染色染料,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.3.7 預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線(xiàn)分析 通過(guò)ROC曲線(xiàn)，在患者出院后進(jìn)行為期9個(gè)月的跟蹤隨訪(fǎng)，比較患者腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)情況與檢測(cè)期間患者miR-105、MMP-2表達(dá)量之間是否存在相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-105和MMP-2在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織miR-105表達(dá)量為0.19±0.12，低于瘤旁組織的0.56±0.10，P<0.05。免疫組化法染色顯示，膠質(zhì)瘤組織陽(yáng)性表達(dá)率為73.03%(65/89)，高于瘤旁組織的13.48%(12/89)，P<0.05，見(jiàn)圖1。

A.MMP-2在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)；B.MMP-2在瘤旁組織中的表達(dá)圖1 免疫組化法染色檢測(cè)MMP-2表達(dá)A.The expression of MMP-2 in glioma tissue; B.Expression of MMP-2 in paraneoplastic tissuesFig 1 Immunohistochemical staining was used to detect the expression of MMP-2

2.2 術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素的多因素Logistic回歸分析

Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-105和MMP-2對(duì)腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)存在顯著影響；進(jìn)一步分析可發(fā)現(xiàn)，對(duì)腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的影響從大到小依次是MMP-2、miR-105。詳見(jiàn)表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的Logistic回歸分析Tab 1 Logistic regression analysis of postoperative recurrence of glioma

2.3 miR-105、MMP-2預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線(xiàn)分析

miR-105、MMP-2單一及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值ROC曲線(xiàn)顯示，以復(fù)發(fā)組為陽(yáng)性樣本，以無(wú)復(fù)發(fā)組為陰性樣本，繪制各指標(biāo)預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線(xiàn)，結(jié)果顯示，miR-105、MMP-2單一及聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的曲線(xiàn)下面積(AUC)依次為0.735、0.797、0.894，提示miR-105聯(lián)合MMP-2可預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)，見(jiàn)表2、圖2。

表2 miR-105、MMP-2預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線(xiàn)分析Tab 2 ROC curve analysis of miR-105 and MMP-2 in predicting postoperative recurrence of glioma

圖2 miR-105和MMP-2預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線(xiàn)Fig 2 ROC curve of miR-105 and MMP-2 in predicting postoperative recurrence of glioma

2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組蛋白表達(dá)

對(duì)比轉(zhuǎn)染后NC組、miR-105組、MMP-2組和miR-105聯(lián)合MMP-2組各組細(xì)胞miR-105和MMP-2的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-105聯(lián)合MMP-2組和miR-105組的U251細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)顯著高于NC組(P<0.05), miR-105組和miR-105聯(lián)合MMP-2組的U251細(xì)胞中miR-105的表達(dá)明顯高于NC組。本研究顯示，miR-105聯(lián)合MMP-2組中MMP-2 、miR-105表達(dá)均較低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MMP-2、miR-105水平Fig 3 The detection of MMP-2 and miR-105 levels by Western blot

2.5 miR-105和MMP-2水平對(duì)膠質(zhì)瘤增殖的影響

與NC組相比，miR-105轉(zhuǎn)染后細(xì)胞OD值隨時(shí)間的增加而明顯降低，MMP-2組細(xì)胞OD值隨時(shí)間的增加而明顯升高，表明miR-105明顯抑制U251細(xì)胞增殖能力，而MMP-2可對(duì)細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用(均P<0.05),見(jiàn)圖4。

圖4 MMP-2和miR-105對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用的影響(*P<0.05，**P<0.01)Fig 4 Effects of MMP-2 and miR-105 on proliferation of glioma cells(*P<0.05, **P<0.01)

2.6 miR-105和MMP-2水平對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲和遷移的影響

MMP-2組細(xì)胞侵襲能力明顯高于NC組與miR-105聯(lián)合MMP-2組(P<0.05)，miR-105組侵襲能力與NC組差異較小，但較MMP-2組與miR-105聯(lián)合MMP-2組明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 MMP-2和miR-105對(duì)腦膠質(zhì)瘤侵襲(A)和遷移(B)的影響(*P<0.05)Fig 5 Effects of MMP-2 and miR-105 on invasion(A) and migration(B) of glioma(*P<0.05)

2.7 MMP-2 和 miR-105的表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后凋亡率NC組為11.26±1.56，MMP-2組為9.86±1.29，miR-105聯(lián)合MMP-2組為26.72±1.83，miR-105組為29.67±2.29。與NC組相比，miR-105組細(xì)胞凋亡率明顯升高，而MMP-2組細(xì)胞凋亡率有所降低(P<0.05)，miR-105聯(lián)合MMP-2組同NC組相比凋亡率較高，但較miR-105組較低(P<0.05)。說(shuō)明miR-105能誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡， MMP-2對(duì)細(xì)胞凋亡有所抑制，且miR-105可能通過(guò)作用于MMP-2對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控。見(jiàn)圖6。

A.NC組；B.MMP-2組；C.miR-105聯(lián)合MMP-2組；D.miR-105組圖6 MMP-2和miR-105流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果A.NC group; B.MMP-2 group; C.miR-105+MMP-2 group;D.miR-105 groupFig 6 Flow cytometry results of MMP-2 and miR-105

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是較常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)中將膠質(zhì)瘤通常分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)[12]，大部分患者首次治療后仍會(huì)出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的主要原因在于腫瘤細(xì)胞不能完全手術(shù)清除，復(fù)發(fā)部位多在原部位，膠質(zhì)瘤仍有極高的致殘率和病死率[12]。由于腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤全切除率低，術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，預(yù)后較差。

MMP-2是MMP家族中重要的一員，主要來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，是一種酶活性鋅離子依賴(lài)性肽鏈內(nèi)切酶家族，MMP與腫瘤發(fā)生及癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移等有關(guān)。相關(guān)研究[13-17]結(jié)果顯示，在多種腫瘤細(xì)胞中均存在 MMP-2的表達(dá)；正常腦組織細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)可能是因?yàn)槟X組織遭到損傷所引起，因陰性對(duì)照組均為腦外傷后行內(nèi)減壓手術(shù)的新鮮腦組織，可能腦組織本身已經(jīng)出現(xiàn)了水腫，損傷到了血腦屏障，導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增加，因此致使非正常生理狀態(tài)下的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌 MMP-2。MMP-2基因有可能作為判斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤的侵襲性和預(yù)后情況的參考指標(biāo),可作為其預(yù)測(cè)指標(biāo)和干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)其診斷及治療提供重要的指導(dǎo)作用[18]。

目前對(duì)miRNA功能的研究主要包括對(duì)其進(jìn)行過(guò)表達(dá)與抑制這兩種方式，通過(guò)脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到生物體內(nèi)，從而使內(nèi)源性 miRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展主要與miRNA調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常有關(guān)，但是一個(gè) miRNA 可對(duì)多個(gè)靶基因產(chǎn)生調(diào)控作用，一個(gè)靶基因又可能被多個(gè) miRNA 所調(diào)控，使得難以完全弄清 miRNA 的功能。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞的 miRNA 表達(dá)水平有著明顯的差異性，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)，因此在腫瘤的治療中，miRNA 成為了重要的靶點(diǎn)[19]。現(xiàn)有研究表明，miRNA-105與肝癌、結(jié)腸癌和卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系[20-21]，如在直腸癌中可通過(guò)miR-105-5p/RAB22A軸加重結(jié)直腸癌的惡性發(fā)展，而在心臟缺血性損傷中卻又可通過(guò)多重途徑程序性抑制細(xì)胞凋亡。Guan等[22]發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，miRNA-105在腦膠質(zhì)瘤組織中異常低表達(dá)。在惡性腫瘤中，有l(wèi)et-7、miR-105、miR-124、miR-154等下調(diào) miRNA，且均已經(jīng)證實(shí)在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、增殖凋亡過(guò)程中起到了明顯的調(diào)控作用[23-24]。

本研究通過(guò)采用免疫組化法檢測(cè)MMP-2蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，主要在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中存在MMP-2蛋白的表達(dá)，少許腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞周?chē)軆?nèi)皮細(xì)胞中也存在MMP-2的表達(dá)。MMP-2高表達(dá)者復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)者，提示MMP-2高表達(dá)是腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，其可能原因在于MMP-2在細(xì)胞基底膜的降解中起著積極的作用，腫瘤細(xì)胞侵襲[25]，降解細(xì)胞外基質(zhì)，影響細(xì)胞與細(xì)胞和基質(zhì)之間的信號(hào)傳遞，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、遷移、黏附、損傷及修復(fù)等方面產(chǎn)生影響。miR-105在復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者中呈低表達(dá)，提示miR-105低表達(dá)是腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。各組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi) MMP-2蛋白均高表達(dá)，miR-105 的 mRNA 表達(dá)水平與 MMP-2呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，MMP-2可能為 miR-105 下游靶基因。通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)與劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移顯示，miR-105可抑制腫瘤侵襲遷移，并對(duì)MMP-2增強(qiáng)的侵襲遷移能力進(jìn)行抑制。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)其可能原因在于miR-105靶向負(fù)調(diào)控，抑制表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-105對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，這與現(xiàn)有研究結(jié)果有所呼應(yīng)[26-27]。后續(xù)或可通過(guò)miR-105對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移機(jī)制進(jìn)行研究，可以提高腫瘤的臨床治療效果，延長(zhǎng)腫瘤患者的生存期。

綜上所述，miR-105在復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者中呈低表達(dá)，MMP-2是在復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者中高度表達(dá)。miR-105、MMP-2均參與膠質(zhì)瘤的侵襲、遷移和凋亡，二者對(duì)膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)有一定價(jià)值，可能成為膠質(zhì)瘤的生物學(xué)標(biāo)志物。