米彩鋒，趙武斌，李亞利，余儒桓，楊洋

(1.平頂山學(xué)院第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 平頂山 467000； 2.平頂山學(xué)院第一附屬醫(yī)院 醫(yī)教部，河南 平頂山 467000； 3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胸外科，河南 鄭州 450052)

食管癌是一種常見(jiàn)的消化道腫瘤，其主要病理類型有食管腺癌(adenocarcinoma of esophagus，EAC)和食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[1]。EAC在西方國(guó)家很常見(jiàn)，而ESCC是包括中國(guó)在內(nèi)的亞洲地區(qū)的主要病理類型[2]。研究ESCC的分子機(jī)制對(duì)治療和預(yù)后具有重要意義。

最近的研究表明，在某些癌細(xì)胞中存在一種鐵依賴性的細(xì)胞死亡形式，稱為鐵死亡[3]。與細(xì)胞壞死和凋亡不同，鐵死亡的過(guò)程以脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物和鐵代謝產(chǎn)生的致命活性氧(ROS)的積累為特征[4]。值得注意的是，鐵死亡在調(diào)節(jié)多種腫瘤的進(jìn)展中起著重要作用[5]。一些學(xué)者假設(shè)鐵死亡可能是惡性腫瘤的一種治療方法，而這種方法的有效程度有待進(jìn)一步探究。

長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNAs)已受到研究者的廣泛關(guān)注，根據(jù)定義，lncRNAs由200個(gè)核苷酸組成，不具有功能性蛋白質(zhì)編碼能力[6]。越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)，LncRNA靶向下游microRNA(miRNA)和基因誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡[7]。如LINC00336在肺癌中表達(dá)上調(diào)，并作為癌基因抑制肺癌細(xì)胞鐵死亡[8]。本研究借助GEO芯片表達(dá)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)lnc-POTEG-4在ESCC中呈顯著高表達(dá)，而lnc-POTEG-4在ESCC中的功能并未有相關(guān)報(bào)道。因此，有必要對(duì)lnc-POTEG-4在ESCC中的作用及其機(jī)制進(jìn)行探討。miR-498作為lnc-POTEG-4的靶點(diǎn)，已被證實(shí)在ESCC組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，能夠抑制ESCC細(xì)胞增殖、凋亡和遷移[9]。進(jìn)一步找到miR-498的下游靶基因雄激素受體(AR)，根據(jù)以往研究，AR的高表達(dá)與ESCC患者總體生存率較低相關(guān)，沉默AR能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)[10]。

本研究旨在通過(guò)介導(dǎo)鐵死亡，來(lái)確定lnc-POTEG-4在ESCC進(jìn)展中的作用及其潛在的促腫瘤機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

人食管上皮細(xì)胞系Het-1a和ESCC細(xì)胞系Eca9706、Eca109、KYSE150、KYSE450來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，Opti-MEM培養(yǎng)基脂質(zhì)體3000和TRIzol試劑來(lái)自美國(guó)Invitgen公司，miR-498模擬物/抑制劑、pcDNA-AR和對(duì)照載體購(gòu)自上海吐露港生物科技有限公司，Opti-MEM培養(yǎng)基(31985070)和QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒(12943)購(gòu)自上海凌儀生物科技有限公司，ROS檢測(cè)試劑盒-DCFHDA和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(GL2090)來(lái)自北京百奧萊博科技有限公司，鐵比色分析試劑盒來(lái)自深圳市錦賢科技有限公司，KAPATMSYBR?快速定量PCR試劑盒購(gòu)自北京普凱瑞生物科技有限公司，Erastin、NRF2抑制劑、GPNA和化合物968均來(lái)自MCE公司，雙熒光素酶基因檢測(cè)試劑盒(D0010)和CCK-8檢測(cè)試劑盒(CA1210)來(lái)自北京索萊寶科技有限公司，熒光原位雜交試劑盒為上海歌凡生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 組織采集 對(duì)平頂山學(xué)院第一附屬醫(yī)院2018年9月至2020年12月間接受ESCC切除術(shù)但未進(jìn)行術(shù)前放化療的62例患者的ESCC組織和鄰近正常組織進(jìn)行采集。在分析之前，所有樣品都儲(chǔ)存在-80 ℃ 下。所有參與研究的患者都簽署了知情同意書，研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) Het-1a和Eca9706、Eca109、KYSE150、KYSE450在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/鏈霉素和1% L-谷氨酰胺，細(xì)胞在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將Eca109細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過(guò)夜。將lnc-POTEG-4亞克隆到pEGFP-N1載體中，將lnc-POTEG-4 ShRNA序列連接到pGPU6/GFP/Neo載體中，構(gòu)建si-lnc-POTEG-4質(zhì)粒，用QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒提取過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒，將miR-498模擬物/抑制劑、pcDNA-AR、si-lnc-POTEG-4和對(duì)照載體分別用脂質(zhì)體3000試劑和Opti-MEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞。

1.2.4 CCK-8試驗(yàn) CCK-8試劑盒用于檢測(cè)Eca109細(xì)胞的活力。細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板中，并在37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h以使細(xì)胞黏附。向每個(gè)孔中添加10 μl CCK-8溶液并混合，然后再培養(yǎng)細(xì)胞2 h。使用雙波長(zhǎng)微孔板讀取器在450 nm處測(cè)量OD值。

1.2.5 ROS和MDA生成測(cè)定 使用ROS檢測(cè)試劑盒-DCFHDA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS，用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)DCF熒光以確定ROS水平。采用MDA檢測(cè)試劑盒(TBA微板法)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

1.2.6 Fe2+水平的測(cè)定 將細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞·孔-1的密度在6孔板中培養(yǎng)24 h后用Erastin或NRF2抑制劑處理，根據(jù)用戶使用說(shuō)明書使用鐵比色分析試劑盒評(píng)估細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平。

1.2.7 qRT-PCR 使用TRIzol試劑從組織(ESCC及其對(duì)照)和細(xì)胞(Eca109)中純化和提取總RNA，以總RNA作為模板合成互補(bǔ)DNA(cDNA)。使用KAPATMSYBR?快速定量PCR試劑盒按照制造商的使用說(shuō)明混合反應(yīng)溶液，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(對(duì)于lnc-POTEG-4和AR)或U6(對(duì)于miR-498)作為內(nèi)參，lnc-POTEG-4、miR-498和AR的水平通過(guò)2-ΔΔCT方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR序列Tab 1 qRT-PCR sequences

1.2.8 熒光原位雜交 細(xì)胞蓋玻片用4%多聚甲醛固定20 min然后將蓋玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上洗滌3次，每次5 min。用免疫組化筆畫圈，根據(jù)不同組織的特點(diǎn)，蛋白酶K(20 μg·ml-1)處理1～5 min，蓋玻片用PBS洗滌3次，每次5 min。添加預(yù)混合溶液，并在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后倒出。添加雜交溶液，使載玻片在4 ℃下雜交過(guò)夜。將蓋玻片在SSC(2×)中洗滌1次10 min，在SSC(1×)中洗滌兩次各5 min，并在SSC(0.5×)中洗滌1次10 min。加入DAPI染料溶液，將蓋玻片在黑暗中培養(yǎng)8 min，用PBS洗滌并用抗熒光猝滅劑密封。在熒光顯微鏡下觀察lnc-POTEG-4的細(xì)胞定位。lnc-POTEG-4的熒光探針序列為：CTGATATCAAGACGGGAATAATCATAGATGGC。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 含miR-498互補(bǔ)序列的lnc-POTEG-4/AR片段插入熒光素酶的基本載體psiCHECK-2，命名為WT-lnc-POTEG-4/WT-AR。同時(shí)構(gòu)建在miR-498結(jié)合位點(diǎn)含有突變lnc-POTEG-4/AR的載體，命名為MUT-lnc-POTEG-4/MUT-AR。接下來(lái)在miR-498模擬物或其對(duì)照物存在下，將上述野生型或突變型報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。按照用戶使用說(shuō)明書，使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢查熒光素酶活性。

1.2.10 生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥ncbi.nlm.nih.gov)獲取GEO芯片表達(dá)數(shù)據(jù)GSE120356，構(gòu)建全基因組范圍內(nèi)的LncRNAs表達(dá)譜；差異篩選條件為adj.P.Value<0.05和|Log2FC|>1；在LncBook(http:∥bigd.big.ac.cn/lncbook/index)和LncRNASNP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP#!/)獲取lnc-POTEG-4的靶miRNAs；TargetSan(http:∥targetscan.org/vert_72/)和miRDB(http:∥mirdb.org)用于獲取miR-498的下游靶基因；韋恩圖通過(guò)Venn(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制；DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥david.ncifcrf.gov)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行KEGG功能富集分析；DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥disgenet.org/search)用于獲取ESCC的疾病風(fēng)險(xiǎn)基因；STRING(https:∥string-db.org/)用于預(yù)測(cè)基因間的相互作用關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用t檢驗(yàn)分析兩組間的差異，并用單因素方差分析比較多組間的差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)ESCC中可能的分子機(jī)制

獲取ESCC的GEO芯片表達(dá)數(shù)據(jù)GSE120356，構(gòu)建全基因組范圍內(nèi)的LncRNAs表達(dá)譜。我們發(fā)現(xiàn)在配對(duì)的5例ESCC組織和癌旁正常組織中，共有2 366個(gè)lncRNA差異表達(dá)，其中1 032個(gè)顯著上調(diào)，1 334個(gè)顯著下調(diào)。我們?cè)诋惓８弑磉_(dá)的LncRNAs中選取P值校正后(adj.P.Val)顯著差異表達(dá)的10個(gè)LncRNAs繪制熱圖，其中發(fā)現(xiàn)lnc-POTEG-4在ESCC中顯著高表達(dá)，且在LncRNASNP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到lnc-POTEG-4在ESCC中的高表達(dá)。但lnc-POTEG-4在ESCC中的功能性研究尚未有相關(guān)報(bào)道，因此有必要對(duì)lnc-POTEG-4在ESCC中的作用及機(jī)制進(jìn)行探討。

分別在LncBook和LncRNASNP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取lnc-POTEG-4的下游靶miRNAs并取交集，交集結(jié)果為hsa-miR-498、hsa-miR-335-3p、hsa-miR-452-3p、hsa-miR-380-3p和hsa-miR-411-3p。僅hsa-miR-498在ESCC中有較為明確的研究依據(jù)，因此選擇miR-498進(jìn)行后續(xù)分析。在TargetScan和miRDB獲取miR-498的下游靶基因并取交集，共有289個(gè)交集靶基因，將這289個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG功能富集分析，共有7個(gè)輸出結(jié)果，將其繪制為氣泡圖，其中癌癥通路的term較為顯著富集(Fold Enrichment=2.252 966 518 025 84;P=0.011 197)，將其作為候選基因選取范圍。該term中有13個(gè)基因(RB1、TCF7L2、RALA、PTCH1、PTGER3、GNAI3、CBL、GNA13、AR、CDK6、EP300、ITGA6、SKP2)，與ESCC(CUI：C1142025)的疾病風(fēng)險(xiǎn)基因(ADRA1D、LTA、BRCA1和BRAF)在STRING在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)二者間的蛋白相互作用關(guān)系，其中AR與其他基因間的緊密連接作用最強(qiáng)，并根據(jù)以往研究選用AR進(jìn)行后續(xù)研究。見(jiàn)圖1。

A.GSE120356芯片中的差異表達(dá)miRNAs；B.LncRNAs差異表達(dá)的熱圖；C.LncRNASNP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果；D.lnc-POTEG-4在LncBook和LncRNASNP數(shù)據(jù)庫(kù)的交集靶miRNAs；E.lnc-POTEG-4和miR-498的相互作用結(jié)合位點(diǎn)；F.miR-498在TargetScan和miRDB中的交集靶基因；G.KEGG分析結(jié)果氣泡圖；H.蛋白相互作用關(guān)系圖；I.miR-498和AR的特異性結(jié)合位點(diǎn)圖1 生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)ESCC中可能的分子機(jī)制Fig 1 Bioinformatics tools predict possible molecular mechanisms in ESCC

2.2 在ESCC中l(wèi)nc-POTEG-4和AR表達(dá)升高，miR-498表達(dá)降低

為了探討lnc-POTEG-4在ESCC中的生物學(xué)功能，我們采用qRT-PCR方法檢測(cè)lnc-POTEG-4在ESCC組織和細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果顯示，與鄰近正常組織和Het-1a相比，ESCC組織和細(xì)胞中的lnc-POTEG-4和AR明顯上調(diào)，而miR-498在ESCC組織和細(xì)胞中顯著下調(diào)(圖2)。這些數(shù)據(jù)表明，lnc-POTEG-4、miR-498和AR的異常表達(dá)可能參與了ESCC的進(jìn)展。

A-C.lnc-POTEG-4、miR-498和AR在ESCC組織及鄰近正常組織中的表達(dá)；D-H.lnc-POTEG-4、miR-498和AR在Het-1a和Eca9706、Eca109、KYSE150、KYSE450中的mRNA和蛋白表達(dá)。* 與Het-1a相比，P<0.05圖2 lnc-POTEG-4和AR在ESCC中表達(dá)上調(diào)，miR-498表達(dá)下調(diào)Fig 2 Inc-POTEG-4 and AR were up-regulated in ESCC, and miR-498 was down-regulated

2.3 沉默lnc-POTEG-4誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞鐵死亡

本研究考慮到lnc-POTEG-4在ESCC中高表達(dá)，我們將si-lnc-POTEG-4轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后檢測(cè)到lnc-POTEG-4的表達(dá)顯著降低(圖3A)。使用CCK-8法評(píng)估下調(diào)lnc-POTEG-4后Eca109細(xì)胞的增殖活力，結(jié)果表明si-lnc-POTEG-4較si-NC組顯著抑制細(xì)胞的活力(圖3B)。此外，為了進(jìn)一步證明鐵死亡是否引起Eca109細(xì)胞的這種結(jié)果，我們用幾種細(xì)胞死亡抑制劑處理Eca109細(xì)胞。如圖3C所示，與對(duì)照組相比，沉默lnc-POTEG-4或鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin處理顯著降低Eca109細(xì)胞的活力。此外，用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1(Fer-1)預(yù)處理細(xì)胞可消除沉默lnc-POTEG-4誘導(dǎo)的鐵死亡，但凋亡抑制劑ZVAD-FMK和壞死抑制劑Necro-sulfonamide(Nec)不起作用。此外，我們?cè)u(píng)估了鐵死亡過(guò)程中的兩個(gè)主要過(guò)程，包括脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵積累，發(fā)現(xiàn)沉默lnc-POTEG-4或Erastin處理顯著提高了Eca109細(xì)胞的MDA和ROS生成水平(圖3D、E)，并提高了細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平(圖3F)。綜上所述，沉默lnc-POTEG-4對(duì)Eca109細(xì)胞具有抗增殖作用。

A.qRT-PCR檢測(cè)lnc-POTEG-4的表達(dá)；B、C.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力；D.MDA水平測(cè)定；E.ROS水平測(cè)定；F.Fe2+含量測(cè)定。 與si-NC細(xì)胞相比，P<0.05；& 與Blank組相比，P<0.05圖3 沉默lnc-POTEG-4誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞鐵死亡Fig 3 Silencing lnc-POTEG-4 induces ferroptosisin Eca109 cells

2.4 si-lnc-POTEG-4誘導(dǎo)的Eca109細(xì)胞鐵死亡需要谷氨酰胺代謝的促進(jìn)

圖4A顯示了谷氨酰胺代謝在癌細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化誘導(dǎo)的鐵死亡中的調(diào)節(jié)過(guò)程，用谷氨酰胺代謝關(guān)鍵調(diào)控基因抑制劑(GPNA和化合物968)處理Eca109細(xì)胞，用CCK-8法測(cè)定其活力。如圖4B所示，si-lnc-POTEG-4顯著抑制Eca109細(xì)胞的活力，而GPNA或968預(yù)處理顯著減弱si-lnc-POTEG-4誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè)我們進(jìn)行了研究，結(jié)果表明GPNA和968通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平、MDA生成和ROS水平來(lái)減輕si-lnc-POTEG-4誘導(dǎo)的鐵死亡(圖4C～E)。總之，沉默lnc-POTEG-4通過(guò)調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞鐵死亡。

A.谷氨酰胺代謝在鐵死亡中的示意圖；B.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力；C.MDA水平測(cè)定；D.ROS水平測(cè)定；E.Fe2+含量測(cè)定。& 與Blank組相比，P<0.05圖4 si-lnc-POTEG-4誘導(dǎo)的Eca109細(xì)胞鐵死亡需要促進(jìn)谷氨酰胺的代謝Fig 4 si-lnc-POTEG-4-induced ferroptosis in Eca109 cells requires promotion of glutamine metabolism

2.5 lnc-POTEG-4是miR-498的海綿

lnc-POTEG-4主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，表明它能夠與miRNA相互作用(圖5A)。為了驗(yàn)證lnc-POTEG-4是否能與miR-498結(jié)合，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。我們構(gòu)建了WT-lnc-POTEG-4和MUT-lnc-POTEG-4，分別與miR-498模擬物和miR-NC共轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，結(jié)果顯示，WT-lnc-POTEG-4和miR-498模擬物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(圖5B)。qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-lnc-POTEG-4后細(xì)胞miR-498的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-lnc-POTEG-4的Eca109細(xì)胞miR-498的表達(dá)明顯高于si-NC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(圖5C)。此外，我們進(jìn)一步分析得到lnc-POTEG-4和miR-498在ESCC中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(圖5D)。這些結(jié)果表明lnc-POTEG-4能夠充當(dāng)miR-498的海綿。

A.熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)；B.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果；C.qRT-PCR檢測(cè)miR-498的表達(dá)；D.相關(guān)性分析結(jié)果。 與si-NC組相比，P<0.05圖5 lnc-POTEG-4是miR-498的海綿Fig 5 lnc-POTEG-4 is a sponge of miR-498

2.6 抑制miR-498可部分抑制沉默lnc-POTEG-4促進(jìn)的鐵死亡

我們進(jìn)一步評(píng)估lnc-POTEG-4通過(guò)調(diào)節(jié)miR-498在ESCC細(xì)胞鐵死亡中的作用。用miR-498 inhibitor和si-lnc-POTEG-4共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率(圖6A)。miR-498的下調(diào)顯著抑制si-lnc-POTEG-4對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用(圖6B)。此外，miR-498 inhibitor顯著降低si-lnc-POTEG-4誘導(dǎo)的ROS水平、MDA產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平(圖6C-E)。抑制miR-498可部分逆轉(zhuǎn)沉默lnc-POTEG-4誘導(dǎo)的ESCC細(xì)胞鐵死亡。

A.qRT-PCR檢測(cè)miR-498的表達(dá)；B.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力；C.MDA水平測(cè)定；D.ROS水平測(cè)定；E.Fe2+含量測(cè)定。與si-NC細(xì)胞相比，P<0.05；#與si-lnc-POTEG-4+miR-NC組相比，P<0.05圖6 抑制miR-498可部分抑制沉默lnc-POTEG-4促進(jìn)的ESCC細(xì)胞鐵死亡Fig 6 Inhibition of miR-498 partially inhibits ferroptosis in ESCC cells promoted by silencing lnc-POTEG-4

2.7 AR作為miR-498的靶點(diǎn)被si-lnc-POTEG-4抑制

為了驗(yàn)證miR-498是否以AR為靶點(diǎn)，我們采用了雙熒光素酶報(bào)告分析法。結(jié)果表明，WT-AR和miR-498模擬物共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(圖7A)。用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-lnc-POTEG-4和miR-498 inhibitor的細(xì)胞中AR的相對(duì)表達(dá)，結(jié)果顯示，Eca109細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-lnc-POTEG-4細(xì)胞的AR表達(dá)顯著降低，而miR-inhibitor的轉(zhuǎn)染上調(diào)了AR的mRNA和蛋白表達(dá)水平(圖7B～D)。相關(guān)性分析表明，AR的表達(dá)水平與ESCC組織中的miR-498呈負(fù)相關(guān)，與lnc-POTEG-4表達(dá)呈正相關(guān)(圖7E、F)?？傊?，這些結(jié)果表明lnc-POTEG-4通過(guò)miR-498靶向AR。

A.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B～D.qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)AR的mRNA和蛋白表達(dá)；E、F.相關(guān)性分析結(jié)果。 與si-NC組相比，P<0.05；# 與si-lnc-POTEG-4+miR-NC組相比，P<0.05圖7 AR作為miR-498的靶點(diǎn)被si-lnc-POTEG-4抑制Fig 7 AR as a target of miR-498 and inhibited by si-lnc-POTEG-4

2.8 過(guò)表達(dá)AR可部分抑制沉默lnc-POTEG-4促進(jìn)的鐵死亡

我們進(jìn)一步探討AR在沉默lnc-POTEG-4誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用，初步將pcDNA-AR轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率(圖8A)。此外，在Eca109細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)AR顯著抑制了下調(diào)lnc-POTEG-4對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用(圖8B)。過(guò)表達(dá)AR可顯著降低si-lnc-POTEG-4誘導(dǎo)的ROS水平、MDA產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平(圖8C-E)?？傮w而言，沉默lnc-POTEG-4通過(guò)抑制Eca109細(xì)胞中的AR誘導(dǎo)鐵死亡。

A.qRT-PCR檢測(cè)AR的表達(dá)；B.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力；C.MDA水平測(cè)定；D.ROS水平測(cè)定；E.Fe2+含量測(cè)定。 與si-NC細(xì)胞相比，P<0.05；$ 與si-lnc-POTEG-4+pcDNA-NC組相比，P<0.05圖8 過(guò)表達(dá)AR可部分抑制沉默lnc-POTEG-4促進(jìn)的鐵死亡Fig 8 Overexpression of AR partially inhibits ferroptosis promoted by silencing lnc-POTEG-4

3 討 論

ESCC是常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤[11]。本研究探討了lnc-POTEG-4通過(guò)調(diào)節(jié)鐵死亡促進(jìn)ESCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制。lnc-POTEG-4在ESCC組織和細(xì)胞中均異常高表達(dá)，沉默lnc-POTEG-4可明顯誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞鐵死亡，抑制細(xì)胞增殖活力。從機(jī)制上看，lnc-POTEG-4海綿miR-498上調(diào)AR的表達(dá)，以抑制ESCC細(xì)胞鐵死亡，發(fā)揮促腫瘤作用。

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，鐵死亡在放療、化療以及多發(fā)性惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用，如阿帕替尼通過(guò)靶向ELOVL6/ACSL4信號(hào)通路促進(jìn)大腸癌細(xì)胞鐵死亡[12]。此外，谷氨酰胺分解途徑是細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、鐵死亡、自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，抑制谷氨酸代謝能夠有效阻斷細(xì)胞鐵死亡進(jìn)程[13]。

本研究借助GEO數(shù)據(jù)庫(kù)并采用limma包進(jìn)行差異性分析，得到lnc-POTEG-4在ESCC中顯著高表達(dá)，且在LncRNASNP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到同樣的趨勢(shì)。有報(bào)道[14]發(fā)現(xiàn)lnc-POTEG-4在ESCC中異常高表達(dá)，但對(duì)于其在ESCC中發(fā)揮的功能尚未有相關(guān)探索。本研究證實(shí)了lnc-POTEG-4在ESCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)均顯著高于癌旁正常組織和Het-1a細(xì)胞，沉默lnc-POTEG-4顯著降低Eca109細(xì)胞的增殖活力，并能夠提高ROS、MDA和細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平，以及阻斷谷氨酰胺的攝取進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡。

越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)，miRNA作為一種新型的調(diào)控因子，在包括ESCC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，同時(shí)也證實(shí)了癌基因或抑癌基因的作用[15]。此外，一些研究已經(jīng)探索了miRNA在癌癥中的治療靶點(diǎn)，miRNAs引起的鐵死亡已經(jīng)得到證實(shí)，如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)通過(guò)分泌miR-522靶向ALOX15并阻斷ROS積聚來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的鐵死亡[16]。以往的研究[17-18]表明，miR-498在ESCC中顯著低表達(dá)，并對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、克隆和侵襲具有抑制作用。本研究首先驗(yàn)證了miR-498在ESCC中顯著低表達(dá)，并采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-498和lnc-POTEG-4的相互作用關(guān)系，lnc-POTEG-4能夠顯著抑制miR-498的表達(dá)。敲減miR-498能夠部分逆轉(zhuǎn)沉默lnc-POTEG-4降低的Eca109細(xì)胞活力，降低ROS、MDA和Fe2+水平，抑制細(xì)胞鐵死亡。

我們進(jìn)一步利用TargetScan和miRDB靶向關(guān)系與網(wǎng)站篩選得到miR-498的下游靶基因AR。AR在ESCC中的作用已得到初步證實(shí)，AR的高表達(dá)與ESCC患者總體存活率較低相關(guān)，沉默AR能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)[19]，AR拮抗劑能夠有效誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞鐵死亡[20]。姜黃素類似物能夠抑制谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX4)進(jìn)而誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞鐵死亡，而在GPX4存在的情況下，過(guò)表達(dá)AR能夠防止鐵死亡[21]。本研究首先采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了AR和miR-498的靶向結(jié)合關(guān)系，其次qRT-PCR法驗(yàn)證了AR在ESCC中為顯著高表達(dá)，與lnc-POTEG-4在ESCC中的表達(dá)呈正相關(guān)，與miR-498呈負(fù)相關(guān)。lnc-POTEG-4可海綿miR-498上調(diào)AR的表達(dá)。功能性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默lnc-POTEG-4能夠誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生，而過(guò)表達(dá)AR能夠?qū)@一結(jié)果部分逆轉(zhuǎn)。這表明lnc-POTEG-4可能通過(guò)上調(diào)AR抑制ROS、MDA和Fe2+水平，并阻斷谷氨酰胺的代謝來(lái)抑制ESCC細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。

綜上所述，我們的研究結(jié)果證實(shí)了lnc-POTEG-4在ESCC的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。此外，lnc-POTEG-4還通過(guò)海綿miR-498上調(diào)AR的表達(dá)，顯著地抑制鐵死亡，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)為ESCC的治療提供了新的靶點(diǎn)。