李安杰，何普林，易潤華，王曉洋*

檸檬桉幼葉和頂梢枯死病菌的鑒定及生物學(xué)特性

李安杰1，何普林2，易潤華3，王曉洋3*

(1.廣東省連山林場，廣東 清遠 513200；2.中林集團雷州林業(yè)局有限公司，廣東 遂溪 524348；3.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

通過形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析將檸檬桉幼葉和頂梢枯死病的病原菌鑒定為彼特氏桉座孢()。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，環(huán)境因子(不同培養(yǎng)基、溫度、光照、碳氮源和pH值)對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢影響差異顯著。

檸檬桉；葉斑??；彼特氏桉座孢

檸檬桉()是桃金娘科(Myrtaceae)、傘房桉屬(spp.)的高大喬木，在化工、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域都有著重要的經(jīng)濟價值。檸檬桉原產(chǎn)于澳大利亞，現(xiàn)于我國廣東、廣西和云南等地廣泛種植。

2020年，在廣東省雷州市桉樹種植區(qū)，發(fā)現(xiàn)了一種引起檸檬桉幼葉和頂梢枯死的病害。為確定該病的病原菌，采用形態(tài)學(xué)和DNA序列同源性比較對該病原菌進行鑒定并研究了其生物學(xué)特性，以期為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌

2020年8月，從廣東湛江雷州市紀(jì)家鎮(zhèn)的桉樹林場(20°59'04"N，109°51'11"E)采集的檸檬桉發(fā)病樣品中分離得到菌株EDF，經(jīng)過致病性測定確定該菌株為桉樹幼葉和頂梢枯死病菌，由廣東海洋大學(xué)微生物實驗室提供。

1.2 病原菌鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將菌株EDF孢子懸浮液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，在25 ～ 28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，記錄菌落形態(tài)特征，孢子形態(tài)和孢子大小。

分子鑒定：菌株EDF培養(yǎng)3 d后挑取少量菌絲置于50 μL反應(yīng)體系中，通過PCR反應(yīng)擴增ITS片段，擴增引物為ITS1(5′- TCC gTA ggT gAA CCT gCg g -3′)和ITS4(5′- TCCTCC gCT TATTgATATgC -3′)[1]。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后，在NCBI進行Blast，選取近緣種序列進行Clustal W比對，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)用MEGA軟件[2]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展重抽樣次數(shù)1 000次檢測系統(tǒng)發(fā)育樹的可信度。

1.3 生物學(xué)特性

將菌株EDF活化后，用無菌水制備孢子懸浮液，均勻涂布到培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后測定溫度、pH值、光照、碳源、氮源和不同培養(yǎng)基對病原菌菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響。采用十字交叉法測量菌落直徑后，挑取單菌落放入適量的無菌水中，制備孢子懸浮液，用血球計數(shù)板測量孢子的濃度，計算出病原菌的產(chǎn)孢量。

(1)溫度：使用PDA培養(yǎng)基接種病原菌后，分別置于4、16、20、25、30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，測定菌落直徑和產(chǎn)孢量，重復(fù)5次。

(2)pH值：PDA培養(yǎng)基滅菌后，將pH值分別調(diào)為4、5、6、7、8、9、10，接種病原菌后于25 ℃下黑暗培養(yǎng)7d，測定菌落直徑和產(chǎn)孢量，重復(fù)5次。

(3)光照：將病原菌接種PDA培養(yǎng)基后，分別置于24 h光照、24 h黑暗、12 h光照+12 h黑暗、24 h光照+15 min UV、24 h黑暗+15 min UV條件下，室溫培養(yǎng)7 d后，測定菌落直徑和產(chǎn)孢量，重復(fù)5次。

(4)碳源：將察氏培養(yǎng)基作為碳源的蔗糖分別用等質(zhì)量的木糖醇、甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖和淀粉替代，接種病原菌后于25 ℃下黑暗培養(yǎng)7 d，測定菌落直徑和產(chǎn)孢量，重復(fù)5次。

(5)氮源：將察氏培養(yǎng)基作為氮源的硝酸鈉分別用等質(zhì)量的甘氨酸、水解乳蛋白、硝酸鉀、明膠、牛肉膏和酵母浸膏替代，接種病原菌后于25 ℃下黑暗培養(yǎng)7 d，測定菌落直徑和產(chǎn)孢量，重復(fù)5次。

(6)不同培養(yǎng)基：配置各不同培養(yǎng)基并接種病原菌，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，配方如下：PSA培養(yǎng)基：200 g土豆，20 g蔗糖，瓊脂12 g，水1 L，自然pH值；SDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，瓊脂12 g，水1 L，自然pH值；燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OMA)：燕麥30 g，瓊脂12 g，水1 L，自然pH值；玉米粉培養(yǎng)基(CMA)：玉米粉30 g，瓊脂12 g，水1 L，自然pH值；胡蘿卜培養(yǎng)基：胡蘿卜200 g，瓊脂12 g，水1 L，自然pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

病原菌在自然條件下主要侵害幼葉、嫩梢，導(dǎo)致檸檬桉頂梢發(fā)育異常，甚至枯死。病菌從幼嫩葉片邊緣侵染植株，初期形成褐色至黃褐色小點或斑塊，無暈圈，后期顏色轉(zhuǎn)深變黑或變深褐，并在病斑表面形成白色粉層(分生孢子梗和分生孢子)，造成葉片扭曲和干枯(圖1 A)。危害嫩枝梢時初期形成褐色斑點，表層形成白色粉層，病斑逐漸擴大開裂形成潰瘍斑，流膠，嚴(yán)重時導(dǎo)致受害枝條枯死(圖1 B)。

圖1 檸檬桉幼葉和頂梢枯死病癥狀

2.2 病原菌鑒定

形態(tài)學(xué)特征：在PDA培養(yǎng)基上，菌落初期白色、小、隆起，菌絲絨毛狀(圖2A)，菌絲不斷向四周生長，形成中間凸起、邊緣平坦的菌落(圖2B和C)，后邊緣漸漸凸起(圖2D)，有酒香味。菌絲無色，有隔，少分枝；初級分生孢子無色、無隔、透明、光滑、長卵圓形、梨形或近橢圓形，10.0 μm × 3.0 μm，長寬比3.3(圖2E)；由初級分生孢子產(chǎn)生的次生分生孢子較小，5.0 μm × 2.0 μm，長寬比2.5，形態(tài)與初級分生孢子相似(圖2E和F)。綜上所述，菌株EDF與文獻[3]描述的彼特氏桉座孢()形態(tài)特征相符[3]。

分子生物學(xué)鑒定：通過測序獲得菌株EDF的ITS序列長度為672 bp(GenBank 登錄號為OP357927)。序列在GenBank經(jīng)BLASTn，結(jié)果顯示菌株EDF的ITS序列與菌株CERC 9104[4]和模式菌株DAR 19773[5]的ITS序列同源性分別為100%和99.18%(CERC 9104的GenBank 登錄號為KY615033；DAR 19773 的GenBank 登錄號為NR_111242)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示菌株EDF和的菌株聚集在同一分枝上，且與中國的3個菌株聚集在同一個亞分枝，而來自澳大利亞的菌株聚集在另外一個亞分枝(圖3)。依據(jù)形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株EDF鑒定為彼特氏桉座孢()。

2.3 生物學(xué)特性

2.3.1 溫度

菌株EDF的菌落生長速度隨溫度升高加快，最適產(chǎn)孢溫度為20 ℃，產(chǎn)孢量為27.71×106個·cm?2(表1)。菌落形態(tài)在不同溫度下出現(xiàn)差異，溫度越高，菌絲逐漸稀疏、菌落內(nèi)部出現(xiàn)褶皺。

表1 溫度對菌絲生長與產(chǎn)孢量的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母代表差異顯著(<0.05)，下同。

2.3.2 pH值

菌株EDF在培養(yǎng)基pH值>8時不生長，pH值對菌落直徑和產(chǎn)孢量影響顯著(表2)。菌絲生長最適pH值和產(chǎn)孢最適pH值均為6，菌落直徑和產(chǎn)孢量分別為0.84 cm和42.59×106個·cm?2。

表2 pH值對菌絲生長與產(chǎn)孢量的影響

2.3.3 光照

光照對菌株EDF的菌落生長和產(chǎn)孢量影響差異顯著(表3)。菌株在24 h黑暗條件下最適合菌絲生長，菌落直徑最大，達1.95 cm，24 h光照下產(chǎn)孢量最大，達116.77×106個·cm?2。

表3 光照對菌絲生長與產(chǎn)孢量的影響

2.3.4 碳源

碳源對菌株菌落直徑和產(chǎn)孢量影響顯著(表4)。病原菌在無碳源情況下可生長和產(chǎn)孢，但無碳源對其菌絲生長有強烈抑制作用，此外，病原菌對果糖和木糖醇的利用率低，菌絲生長受抑制，但在果糖條件下的產(chǎn)孢量僅次于葡萄糖，達到8.92×106個·cm?2，而在乳糖和淀粉條件下產(chǎn)孢量極低，低于無碳源條件。菌絲生長的最優(yōu)碳源為麥芽糖，菌落直徑達1.81 cm，而產(chǎn)孢的最優(yōu)碳源為葡萄糖，產(chǎn)孢量為21.57×106個·cm?2。

圖2 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

注：A-D，菌落形態(tài)；E，分生孢子和次生分生孢子；F，菌絲；E和F箭頭所指為次生分生孢子；標(biāo)尺：A=5μm，B=10μm。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

注：EDF為檸檬桉幼葉和頂梢枯死病菌菌株，RB2042為外群菌株。

表4 碳源對菌絲生長與產(chǎn)孢量的影響

2.3.5 氮源

氮源對菌株EDF菌落直徑和產(chǎn)孢量影響顯著(表5)。病原菌在無氮源條件下可生長，但其正常生長、產(chǎn)孢均被抑制，同時甘氨酸對菌絲生長的抑制作用強于對照，但其最適合病原菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量可達34.77×106個·cm?2。最有利于菌絲生長的氮源為牛肉膏和酵母浸膏，菌落直徑分別為1.71和1.73 cm。

表5 氮源對菌絲生長與產(chǎn)孢量的影響

2.3.6 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基對菌株EDF菌落生長影響不顯著，但對產(chǎn)孢量影響顯著(表6)。以燕麥培養(yǎng)基最適合菌絲生長，菌落直徑可達到1.59 cm；而PSA培養(yǎng)基最適合產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為18.30×106個·cm?2，玉米粉培養(yǎng)基不利于病原菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量僅為0.32×106個·cm?2。

表6 培養(yǎng)基對菌絲生長與產(chǎn)孢量的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

根據(jù)形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析，在雷州地區(qū)桉樹林中引起檸檬桉幼葉和頂梢枯死的病原菌被鑒定為彼特氏桉座孢。生物學(xué)特性試驗結(jié)果顯示該病原菌喜溫暖、不耐寒，溫度、pH值、碳氮源、培養(yǎng)基和光照對病原菌生長影響差異明顯。在20 ～ 30 ℃下菌絲生長快，pH值= 6時適合菌落生長和產(chǎn)孢，黑暗條件利于菌絲生長，而光照利于病原菌產(chǎn)孢。

3.2 討論

彼特氏桉座孢()是一個寄主范圍較窄的植物病原菌，目前報道僅危害傘房桉屬桉樹，如檸檬桉、美葉桉()、榕葉桉()，大葉斑皮桉()和托里桉()[6]等，未見危害其他寄主。檸檬桉是澳大利亞的本土樹種，常受彼特氏桉座孢侵染而引起頂梢枯死，對桉樹的材質(zhì)、產(chǎn)量和應(yīng)用價值有較大的影響，阻礙了桉樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[7-8]。在澳洲，桉樹對彼特氏桉座孢的抗性在種源、種間和種內(nèi)存在較大的差別，即桉樹品種對病原菌的敏感性有明顯不同[9]，這為桉樹抗病育種提供理論基礎(chǔ)。在我國，陳帥飛等[3]報道了引起檸檬桉頂梢枯死和葉白枯萎的，其形態(tài)特征與菌株EDF一致。在我國引起桉樹幼葉和頂梢枯死的菌株與澳洲的菌株均為，但在系統(tǒng)發(fā)育樹上分別位于不同的亞分枝，這意味著不同地理位置的菌株存在遺傳差異。本文研究了環(huán)境因子(包括溫度、光照條件、pH值和營養(yǎng)條件)對病原菌生長以及產(chǎn)孢的影響，確定該菌在20 ℃下有利于病原菌生長和產(chǎn)孢，光照利于刺激孢子產(chǎn)生的生物學(xué)特性。研究結(jié)果為檸檬桉幼葉和頂梢枯死病害的防控提供了一些基礎(chǔ)信息。

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Identification and Biological Characteristics of Pathogen Causing Leaf and Shoot Blight on

LI Anjie1, HE Pulin2, YI Runhua3, WANG Xiaoyang3*

()

Based on morphological and phylogenetic analysis, the pathogen causing leaf and shoot blight disease onwas identified as. The research results of biological characteristics showed that environmental factors, including different media, temperature, light, carbon and nitrogen sources and pH, had significant effects on the mycelial growth and spore production of this pathogen.

; leaf and shoot blight;a

S763.15

A

10.13987/j.cnki.askj.2022.04.002

李安杰(1975— )，男，工程師，從事桉樹培育及病蟲害防治研究。E-mail: honglin923@sohu.com

通信作者：王曉洋，E-mail:974992084@qq.com