＊基輝 程濟(jì)南 程錦春 楊曉燕 關(guān)基鳳 秦波*

（1.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中國(guó)科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅 730000 2.煙臺(tái)中科先進(jìn)材料與綠色化工產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 山東 264006 3.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 甘肅 730000 4.西北民族大學(xué)化工學(xué)院 甘肅 730000 5.內(nèi)蒙古通遼市市場(chǎng)檢驗(yàn)檢測(cè)中心 內(nèi)蒙古 028000）

植物根系、根際微生物和根際土壤的相互作用，構(gòu)成了植物根際微生態(tài)系統(tǒng)。外來植物入侵會(huì)引起土壤生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生改變，形成有利于入侵植物生長(zhǎng)的土壤生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)而形成單優(yōu)勢(shì)植物群落并快速擴(kuò)張蔓延[1]。在這一過程中，化感作用發(fā)揮著不可替代的作用?；凶饔檬且环N生物體相互干擾的生態(tài)現(xiàn)象，主要用于控制雜草、抗病蟲害以及改善土壤營(yíng)養(yǎng)與微生物的相互作用[2]。入侵植物在入侵過程中產(chǎn)生一系列化感物質(zhì)，從而發(fā)揮較強(qiáng)的化感作用，成為植物和土壤之間相互作用的調(diào)節(jié)者[3]。近些年，許多入侵成功的植物在入侵過程中都伴隨著強(qiáng)烈的化感作用，化感作用成為入侵植物加速擴(kuò)張、抑制本土植物生長(zhǎng)的有力武器[4]。入侵植物的化感作用，在學(xué)者探究外來植物入侵機(jī)制中得到越來越多的關(guān)注。

瑞香狼毒為瑞香科狼毒屬多年生草本植物，在中國(guó)廣泛分布于甘肅、新疆、寧夏等地區(qū)，是我國(guó)西北高寒草地的主要有毒雜草之一，近年來，瑞香狼毒由于強(qiáng)大的生態(tài)適應(yīng)性和高度的競(jìng)爭(zhēng)性，目前已成為中國(guó)草地退化的標(biāo)志性植物之一[5]?，F(xiàn)今對(duì)于瑞香狼毒的研究，多集中在形態(tài)學(xué)、化學(xué)活性、生物防治等方面，而瑞香狼毒的化感作用研究報(bào)道較少。在前期研究中，共分離鑒定出瑞香狼毒的7種化感物質(zhì)，并明確了瑞香狼毒化感物質(zhì)隨地理分布的變化規(guī)律。然而對(duì)于瑞香狼毒化感物質(zhì)的報(bào)道，更多的是集中在單個(gè)化感物質(zhì)的提取及活性測(cè)定等方面[6]。迄今為止，未見有對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同蓋度下，瑞香狼毒根際土壤和根中化感物質(zhì)種類、含量及變化規(guī)律的研究報(bào)道。本文采用高效液相色譜測(cè)定瑞香狼毒根際土壤及根中化感物質(zhì)，探究化感物質(zhì)種類和含量的時(shí)空變化規(guī)律。本研究對(duì)于控制瑞香狼毒種群蔓延，治理瑞香狼毒引起的草地退化問題具有重要意義，也為瑞香狼毒的生物防控提供理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

(1)材料和樣地

實(shí)驗(yàn)樣地位于祁連山東麓天然草原，甘肅省天祝藏族自治縣抓喜秀龍鄉(xiāng)炭窯溝村（37°7′36″N，102°50′3″E），屬于亞高山和高山屬寒冷濕潤(rùn)氣候。選擇5月中旬—6月中旬瑞香狼毒展葉期（Leaf emergence，LE），6月中下旬—8月初盛花期（Full bloom，F(xiàn)B），8月中旬—9月中下旬果實(shí)成熟期（Seed maturation，SM），10月初—第二年5月中旬休眠期（Dormancy period，DP），共4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行樣品采集。依據(jù)瑞香狼毒生長(zhǎng)蓋度分別為0%、25.1%、52.6%以及89.7%選擇樣地，每個(gè)樣地重復(fù)四次，樣地信息見表1。不同樣地之間間隔50m以上。每個(gè)樣地挖取6株健康瑞香狼毒植株，先輕輕抖落根圍土塊，再用無菌毛刷收集粘附在根表的土壤，即為瑞香狼毒根際土壤，每個(gè)重復(fù)的根際土壤和根樣品分別混合成一個(gè)樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣地信息表

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

瑞香狼毒7種化感物質(zhì)傘形花內(nèi)脂、狼毒色原酮、西瑞香素、異新狼毒素A、新狼毒素B、二氫瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于武漢天植生物技術(shù)有限公司（www.chemfaces.com）。將單個(gè)化感物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶于色譜甲醇，配置成2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL以及100μg/mL的6個(gè)質(zhì)量濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液，再配置7種化感物質(zhì)混合液一份。通過對(duì)洗脫程序、檢測(cè)波長(zhǎng)、流速的篩選，最終確定瑞香狼毒化感物質(zhì)高效液相色譜條件如下：色譜柱：250mm×4.6mm、5μm粒徑的Symmetry C18反相柱；檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm；流動(dòng)相流速：1mL/min；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為含0.2%乙酸的水；進(jìn)樣量：20μL；洗脫梯度：0～6min：20%～30% A；6～8min：30%～35% A；8～15min：35～45% A；15～18min：45～60% A；18～20min：60～80% A；20～25min：80% A。將6個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)液通過高效液相色譜儀進(jìn)行峰面積測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次。以各質(zhì)量濃度峰面積平均值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2在0.999以上滿足要求。建立7種化感物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=ax+b；其中：x為所測(cè)樣品質(zhì)量濃度，單位μg/mL；y為高效液相色譜儀器檢測(cè)出的峰面積（表2）。在上述色譜條件下，傘形花內(nèi)脂、狼毒色原酮、西瑞香素、異新狼毒素A、新狼毒素B、二氫瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素A的出峰保留時(shí)間分別為：8.5min、15.6min、16.1min、16.6min、18.6min、19.4min、20.4min。

表2 瑞香狼毒化感物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

(3)瑞香狼毒根際土壤和根中化感物質(zhì)的測(cè)定

瑞香狼毒根際土壤于室內(nèi)陰干后，過40目篩（孔徑0.425mm）除去石頭、草根等雜質(zhì)。瑞香狼毒根際土壤樣品中按照每100g土樣加入300mL的甲醇溶液（m:v=1:3），超聲提取30min以上，重復(fù)3次；經(jīng)抽濾除雜后，獲得根際土壤粗提溶液A；所述根際粗提溶液A使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去甲醇后，即得根際土壤粗提物B。瑞香狼毒植株根室內(nèi)陰干后，通過粉樣機(jī)粉碎后，稱取50g根粉末，加入150mL甲醇溶液（m:v=1:3），超聲提取30min以上，重復(fù)3次，得到根粗提溶液E；所述根粗提溶液E通過使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去甲醇后，即得根粗提物F。

分別稱取根際土壤粗提物B和根粗提物F，加入色譜級(jí)甲醇溶液，配制成2mg/mL的溶液，并通過0.22μm的有機(jī)濾膜除去雜質(zhì)，得到待測(cè)溶液C和待測(cè)溶液D。采用高效液相色譜（HPLC）分別對(duì)待測(cè)溶液C和D進(jìn)行檢測(cè)，通過外標(biāo)法確定瑞香狼毒化感物質(zhì)保留時(shí)間。通過比對(duì)化感物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線峰面，進(jìn)行換算即得瑞香狼毒根際土壤和根中化感物質(zhì)含量。瑞香狼毒根際土壤和根粗提物中，單個(gè)化感物質(zhì)質(zhì)量M=V?A（y-b）/（a?A1），A1=V?w，式中：V為每次進(jìn)樣的體積，單位μL；A為粗提物總質(zhì)量，單位g；A1為每次進(jìn)樣的消耗樣品質(zhì)量，單位mg；w為進(jìn)樣濃度，單位mg/mL。

(4)數(shù)據(jù)處理

瑞香狼毒化感物質(zhì)數(shù)據(jù)處理使用Excel 2016軟件進(jìn)行，通過SPSS 26.0進(jìn)行方差檢驗(yàn)，使用Origin 2018對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

2.結(jié)果與分析

(1)瑞香狼毒根際土壤化感物質(zhì)隨生長(zhǎng)季節(jié)與蓋度的變化

瑞香狼毒根際土壤樣品中共檢測(cè)出5種化感物質(zhì)，分別為狼毒色原酮、異新狼毒素A、新狼毒素B、二氫瑞香素B以及7-甲氧基新狼毒素A。如圖1所示，每千克根際土壤中，展葉期以及盛花期瑞香狼毒化感物質(zhì)含量顯著高于結(jié)實(shí)期以及休眠期。瑞香狼毒展葉期89.7%種群蓋度下，根際土壤中每種化感物質(zhì)含量最高；休眠期25.1%種群蓋度下瑞香狼毒根際土壤化感物質(zhì)含量最低。根際土壤中5種化感物質(zhì)含量在展葉期、結(jié)實(shí)期以及休眠期隨著瑞香狼毒種群蓋度增加而增加；在瑞香狼毒盛花期根際土壤中化感物質(zhì)含量各異，表現(xiàn)為52.6%種群蓋度下各化感物質(zhì)含量最高，而新狼毒素B則隨著種群蓋度增加而降低。如圖2所示，瑞香狼毒根際土壤化感物質(zhì)含量隨著生長(zhǎng)季節(jié)的變化，呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，展葉期根際土壤中化感物質(zhì)含量最高，休眠期化感物質(zhì)含量最低。

圖1 瑞香狼毒根際土壤化感物質(zhì)含量變化規(guī)律

圖2 不同種群蓋度瑞香狼毒根際土壤化感物質(zhì)含量隨生長(zhǎng)階段的變化趨勢(shì)

(2)瑞香狼毒根中化感物質(zhì)隨生長(zhǎng)季節(jié)與蓋度的變化

瑞香狼毒不同生長(zhǎng)季節(jié)、不同種群蓋度根部樣品中共檢測(cè)出7種化感物質(zhì)（圖3）。50g瑞香狼毒根中所得化感物質(zhì)含量顯著高于每千克根際土壤中的化感物質(zhì)含量。展葉期以及盛花期瑞香狼毒根中化感物質(zhì)含量顯著高于果實(shí)成熟期以及休眠期。根中新狼毒素B含量最高，傘形花內(nèi)脂含量最低。盛花期根中傘形花內(nèi)脂含量明顯高于其他生長(zhǎng)季節(jié)，總體上根中傘形花內(nèi)脂含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其余6種化感物質(zhì)。根中狼毒色原酮含量在展葉期以及盛花期隨著種群蓋度增加而增加。展葉期西瑞香素含量明顯高于其它生長(zhǎng)階段，呈現(xiàn)隨種群蓋度增加而降低的趨勢(shì)；其余生長(zhǎng)時(shí)期西瑞香素含量則表現(xiàn)為隨種群蓋度增加而增加的趨勢(shì)。各生長(zhǎng)季節(jié)的52.6%種群蓋度下的異新狼毒素A在含量差異較大，而展葉期和盛花期的新狼毒素B含量遠(yuǎn)高于其它階段及其它種群蓋度。瑞香狼毒根中二氫瑞香素B在各生長(zhǎng)階段及52.6%種群蓋度下含量最高，但在休眠期隨種群蓋度增加而呈下降趨勢(shì)。7-甲氧基新狼毒素A在展葉期以及盛花期瑞香狼毒根中含量較為接近，但在展葉期52.6%種群蓋度的土壤樣品中含量最低。瑞香狼毒根中化感物質(zhì)含量隨著生長(zhǎng)季節(jié)的變化，呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，展葉期根中化感物質(zhì)含量最高，休眠期根中化感物質(zhì)含量最低，但傘形花內(nèi)脂則是在盛花期階段根中含量最高（圖4）。

圖3 瑞香狼毒根中化感物質(zhì)含量變化規(guī)律

圖4 不同種群蓋度瑞香狼毒根中化感物質(zhì)含量隨生長(zhǎng)階段的變化趨勢(shì)

3.討論

瑞香狼毒作為西北天然草地主要的入侵毒草之一，其根含有劇毒，嚴(yán)重影響著我國(guó)西北草地的生產(chǎn)力以及畜牧業(yè)[7]?；形镔|(zhì)是瑞香狼毒入侵競(jìng)爭(zhēng)的重要手段之一，前期研究證明，瑞香狼毒化感物質(zhì)會(huì)抑制瑞香狼毒周圍牧草的生長(zhǎng)[8]。在瑞香狼毒根際土壤中檢測(cè)出5種化感物質(zhì)。在瑞香狼毒根的粗提物中，7種化感物質(zhì)均檢測(cè)出來。瑞香狼毒化感物質(zhì)含量在展葉期以及盛花期中多于結(jié)實(shí)期以及休眠期。狼毒色原酮、異新狼毒素A、新狼毒素B、二氫瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素A在根際土壤及根中含量較高，根際土壤中5種化感物質(zhì)含量在展葉期、結(jié)實(shí)期以及休眠期隨著瑞香狼毒生長(zhǎng)蓋度增加而增加，而在根中化感物質(zhì)含量則表現(xiàn)各異，可能是因?yàn)槿鹣憷嵌局仓陮?duì)其化感物質(zhì)的影響較大。此外，對(duì)比瑞香狼毒根中化感物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)傘形花內(nèi)脂以及西瑞香素含量較低，而瑞香狼毒釋放到土壤中含量也較少，這可能是其在根際土壤中無法檢測(cè)出的原因。西瑞香素在展葉期中隨著生長(zhǎng)蓋度的增加含量呈下降趨勢(shì)，其后三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期大致呈現(xiàn)隨蓋度增加而含量增加的趨勢(shì)，Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素只在植株幼苗階段促進(jìn)生根的作用，因此西瑞香素可能是在瑞香狼毒入侵的最初階段發(fā)揮作用。隨著生長(zhǎng)時(shí)期的變化，根際土壤以及根中化感物質(zhì)含量呈現(xiàn)一個(gè)逐漸下降的趨勢(shì)，展葉期根中化感物質(zhì)含量高于其余3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，這與該時(shí)期瑞香狼毒生長(zhǎng)活性及根系合成和釋放能力強(qiáng)有關(guān)[10]。植物根系釋放有機(jī)物質(zhì)的含量，受到植物內(nèi)部及外部條件的影響，如營(yíng)養(yǎng)狀況、根際pH、土壤微生物等的影響[11]，這可能是盛花期根際土壤中和根中各個(gè)時(shí)期化感物質(zhì)含量趨勢(shì)存在差異性的原因。

4.結(jié)論

在瑞香狼毒根際土壤中檢測(cè)出狼毒色原酮、異新狼毒素A、新狼毒素B、二氫瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素A 5種化感物質(zhì)，在瑞香狼毒根的粗提物中7種化感物質(zhì)均檢測(cè)出來。瑞香狼毒根際土壤和根中化感物質(zhì)含量隨生長(zhǎng)季節(jié)變化呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，化感物質(zhì)含量在展葉期以及盛花期中多于結(jié)實(shí)期以及休眠期。通過對(duì)瑞香狼毒根際土壤和根中化感物質(zhì)隨生長(zhǎng)季節(jié)和種群蓋度的變化規(guī)律研究，對(duì)于控制瑞香狼毒在天然草地的種群蔓延，治理瑞香狼毒引起的草地退化問題具有重要意義。