馬富云 ，胡霞敏 ，2

1上海中醫(yī)藥大學研究生院，上海 201203；2上海健康醫(yī)學院藥學院

卒中是全球第二大死因，其中缺血性腦卒中為腦缺血損傷為最普遍的類型[1]。缺血性腦卒中治療手段有限，注射組織纖溶酶原激活劑（tPA）靜脈溶栓是惟一被FDA批準用于治療急性腦缺血的手段，但其治療時間窗極窄，治療效果不理想[2]。研究表明，自噬對腦缺血再灌注損傷有雙面作用，一方面可保護神經(jīng)功能，一方面又可介導、加劇損傷[3-8]。因此，調(diào)控自噬成為干預腦缺血損傷的一個關(guān)鍵點。自噬形成過程包括自噬誘導、成核、膜的延伸、自噬體與溶酶體的融合以及裂解。在正常情況下，自噬保持低水平狀態(tài)，在營養(yǎng)物和生長因子剝奪、缺氧、低能量等條件下被誘導激活。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）功能抑制，AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）激活，經(jīng)過一系列磷酸化反應后調(diào)節(jié)UKL復合物生成，進一步激活VPS34復合物[由VPS34、VPS15、Beclin1、自噬相關(guān)蛋白（ATG）14組成]，促使自噬前體復結(jié)構(gòu)中PI3P合成，PI3P通過協(xié)助募集ATG12-ATG5-ATG16L1復合物來決定微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）脂化位點，ATG12-ATG5-ATG16L1復合物協(xié)助募集LC3Ⅰ，LC3Ⅰ在ATG7、ATG3及ATG12-ATG5-ATG16L1復合物的作用下向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，這一系列級聯(lián)反應維持了自噬體膜的延伸與閉合，形成成熟的自噬體[15-16]。非編碼RNA是不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括轉(zhuǎn)運RNA、核糖體RNA、微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼 RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）等。非編碼RNA在腦缺血發(fā)生發(fā)展的過程中有重要作用[9-14]。大量文獻表明，非編碼RNA可通過各個環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)自噬影響腦缺血損傷?，F(xiàn)就非編碼RNA基于自噬調(diào)節(jié)對腦缺血損傷的干預作用相關(guān)研究進行綜述。

1 非編碼RNA干預自噬誘導階段減輕腦缺血損傷

1.1 干預mTOR功能 mTOR是自噬誘導階段的重要靶點。在正常狀態(tài)下，細胞內(nèi)氨基酸和生長因子激活mTOR，抑制UKL復合物激活，從而抑制自噬[15]。腦缺血由于大腦供氧供血不足導致細胞壞死、神經(jīng)元功能損傷，還伴有炎癥、能量衰竭、神經(jīng)興奮毒性、血腦屏障損傷、膠質(zhì)細胞激活、氧化應激等[1]，這些條件使得mTOR受到抑制，誘導自噬激活。多項研究表明，羥紅花色素A、枸杞多糖、片仔癀等藥物可經(jīng)激活mTOR抑制腦缺血引起的自噬，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[17-19]。非編碼RNA也能通過mTOR干預自噬從而對腦缺血損傷產(chǎn)生干預。

GUO等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血模型中，lncRNA MIAT與DNA損傷誘導轉(zhuǎn)錄樣蛋白4（REDD1）表達上調(diào)，而 REDD1是mTOR的上游抑制劑[21]。MIAT通過特異性結(jié)合REDD1正向調(diào)節(jié)REDD1表達。當MIAT結(jié)合REDD1后，抑制REDD1泛素化從而防止REDD1降解。因此，MIAT通過上調(diào)REDD1表達來促進自噬和凋亡，從而加劇腦缺血再灌注損傷。體外實驗顯示，當MIAT表達下調(diào)時，自噬被抑制，細胞凋亡減少。lncRNA C2dat2也可通過REDD1調(diào)節(jié)腦缺血損傷誘導的自噬。C2dat2作為競爭性內(nèi)源RNA，負向調(diào)節(jié)miR-30d-5p的表達。miR-30d-5p可靶向結(jié)合DDIT4即REDD1，使其表達沉默。當抑制C2dat2時，miR-30d-5p表達上調(diào)，抑制REDD1，從而抑制自噬激活，減輕腦缺血再灌注損傷[22]。還有研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血模型中，lncRNA MEG3表達水平下調(diào)[23]。LOU等[24]發(fā)現(xiàn)，MEG3能特異性結(jié)合miR-378，上調(diào)生長因子受體結(jié)合蛋白2表達，從而抑制AKT/mTOR通路激活、誘導自噬，加劇腦缺血損傷；miR-378過表達則能減輕神經(jīng)元自噬，減少細胞死亡。有學者發(fā)現(xiàn)，抑制miR-199a表達能減輕腦缺血損傷[25]。ZHOU等[26]研究表明，miR-199a mimics組大鼠神經(jīng)損傷加重，mTOR、tau蛋白表達顯著上調(diào)，認為miR-199a可能通過調(diào)節(jié)mTOR表達來調(diào)節(jié)自噬；當mir-199a表達受抑制時，可通過激活mTOR抑制自噬，從而減輕腦缺血損傷。

然而，也有文獻表明，部分非編碼RNA可通過抑制mTOR、激活自噬從而減輕腦缺血損傷。除REDD1蛋白外，NAD-依賴性去乙酰化酶Sirtuin-1（SIRT1）也能通過調(diào)節(jié)mTOR來影響自噬。SIRT1可抑制mTOR，刺激自噬激活[27]。WANG等[28]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后lncRNA MALAT1表達顯著上調(diào)，抑制MALAT1表達能夠減弱自噬激活并促進細胞死亡。miR-200c-3p可通過結(jié)合SIRT1抑制自噬，而MALAT1能夠逆轉(zhuǎn)miR-200c-3p的抑制作用。所以MALAT1通過結(jié)合miR-200c-3p、上調(diào)SIRT1表達、激活自噬從而發(fā)揮保護神經(jīng)細胞的作用。TIAN等[29]發(fā)現(xiàn)，miR-138通過靶向結(jié)合SIRT1的 3'UTR來抑制SIRT1表達，從而調(diào)節(jié)自噬。miR-138在腦缺血再灌注損傷后表達減少，促進氧糖剝奪再灌注（OGD/R）后細胞自噬，減少由氧糖剝奪誘導的細胞凋亡。

1.2 ULK復合物 ULK復合物由蛋白激酶ULK1和ULK2組成，該復合物主要在營養(yǎng)或能量缺乏條件下將應激信號傳遞到自噬小體形成的部位[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注促使腦微血管內(nèi)皮細胞（BMEC）中l(wèi)ncRNA Malat1表達上調(diào)，促進自噬，提高細胞存活率，產(chǎn)生抗腦缺血損傷作用[30]。Malat1能夠結(jié)合miR-26b并下調(diào)miR-26b表達。研究顯示，miR-26b可抑制OGD/R處理后BMEC的自噬、促進細胞凋亡，而Malat1可逆轉(zhuǎn)這一作用。ULK2是miR-26b的直接靶點。當敲除ULK2基因時，OGD/R處理的BMEC自噬被抑制，且促進BMEC死亡。因此，Malat1通過結(jié)合miR-26b、提高ULK2蛋白表達從而增強自噬，減少腦缺血再灌注損傷誘導的BMEC死亡，減輕血腦屏障破壞。

以上研究表明，非編碼RNA在自噬誘導階段主要作用于mTOR和ULK復合物，主要通過結(jié)合蛋白、調(diào)節(jié)蛋白表達等途徑來干預自噬。部分非編碼RNA在腦缺血后產(chǎn)生特異性表達變化，有些通過激活自噬產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，也有部分通過抑制自噬來減輕腦缺血損傷，或許可以通過分析特異性表達的非編碼RNA來分析腦缺血損傷后的自噬水平，達到通過適度調(diào)控自噬來減輕腦缺血損傷的目的。

2 非編碼RNA干預自噬成核過程減輕腦缺血損傷

自噬成核階段與自噬相關(guān)蛋白Beclin1有著密切聯(lián)系。Beclin1在調(diào)節(jié)Vps-34和促進Beclin1-Vps34-Vps15核心復合物生成中起著重要作用[15]。非編碼RNA在自噬成核階段經(jīng)Beclin1抑制自噬來減輕腦缺血損傷。SUN等[31]發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注體內(nèi)外模型中l(wèi)ncRNA SNHG14表達顯著提高，數(shù)據(jù)分析篩選出miR-30b-5p可能是SNHG14的靶點，預測ATG5和Beclin1能與miR-30b-5p結(jié)合，并通過實驗證實了這些預測。當SNHG14過表達時，細胞自噬增強，且損傷加重，當SNHG14被沉默時則結(jié)果相反。進一步研究發(fā)現(xiàn)，SNHG14過表達可抑制miR-30b-5p表達，而miR-30b-5p能夠調(diào)控ATG5和Beclin1表達，所以，當SNHG14表達抑制時，上調(diào)的miR-30b-5p抑制了ATG5、Becin1表達，從而抑制自噬，減輕腦缺血再灌注損傷。

非編碼RNA還能經(jīng)Beclin1激活自噬來減輕腦缺血損傷。ZHAO 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，miR-30d能下調(diào)Beclin1表達；抑制miR-30d表達能夠顯著增強OGD誘導的細胞自噬并減少細胞凋亡，而敲除Beclin1基因可逆轉(zhuǎn)此作用。

3 非編碼RNA干預自噬體膜延伸過程減輕腦缺血損傷

自噬體膜的延伸機制包括募集ATG9和mATG8s家族，其中包括LC3和gabarap亞族。LC3是最典型的mATG8s家族成員之一。ATG4可切割LC3的C端，暴露甘氨酸殘基（LC3I形式），LC3I依賴ATG7、ATG3、ATG12-ATG5-ATG16L1與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成LC3Ⅱ，這一級聯(lián)反應維持了自噬體膜的延伸和閉合[15]。非編碼RNA可通過干預自噬體延伸階段的相關(guān)蛋白表達來抑制自噬從而減輕腦缺血損傷。PEI等[33]研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞外泌體中的miR-190b通過靶向結(jié)合ATG7抑制自噬從而改善由OGD誘導的細胞凋亡。YU等[34]發(fā)現(xiàn)腦缺血患者血lncRNA KCNQ1OT1水平增高。動物實驗結(jié)果顯示，敲除KCNQ1OT1基因后，小鼠缺血腦組織體積減小、神經(jīng)損傷程度減輕。研究表明，缺血再灌注損傷后miR-200a表達下降，而在KCNQ1OT敲除的OGD/R后細胞中miR-200a表達上調(diào)，提示KCNQ1OT1是miR-200a的直接靶點。叉頭框蛋白O3（FOXO3）是自噬的刺激因素，miR-200a能夠靶向結(jié)合FOXO3基因的3'UTR并抑制其表達。ATG7是FOXO3的直接靶點，參與FOXO3的調(diào)節(jié)自噬過程。所以敲除KCNQ1OT1可能通過miR-200a/FOXO3/ATG7通路抑制缺血再灌注誘導的自噬并提高細胞活性。除了作用于ATG7外，非編碼RNA還能作用于ATG5和LC3蛋白來干預自噬體膜延伸階段。有研究表明，miR-9a-5p在大腦中動脈栓塞模型中表達顯著下降；miR-9a-5p過表達時，缺血腦組織體積減小，神經(jīng)缺陷評分降低；miR-9a-5p過表達還可顯著降低ATG5、LC3蛋白表達，提示miR-9a-5p通過直接作用于ATG5調(diào)節(jié)自噬水平，當miR-9a-5p過表達時自噬被抑制，從而減輕腦缺血損傷[35]。

4 非編碼RNA通過其他途徑調(diào)節(jié)自噬影響腦缺血損傷

非編碼RNA除了參與自噬誘導、成核、延伸等過程外，還通過其他方式介導自噬。WANG等[36]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷通過激活缺氧誘導因子1α刺激lncRNA H19表達，后者通過抑制DUSP5-ERK1/2軸引起自噬激活從而損傷細胞活性；當抑制H19時，自噬激活受到抑制，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。LI等[37]發(fā)現(xiàn)，miR-202-5p在腦缺血體內(nèi)外模型中表達均顯著下調(diào)，當miR-202-5p表達上調(diào)時，能減輕由腦缺血引起的神經(jīng)損傷。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，真核起始因子4E（eIF4E）是miR-202-5p的潛在靶點。miR-202-5p通過降低eIF4E的表達抑制自噬，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。HAN等[38]發(fā)現(xiàn)，circRNA Hectd1在大腦中動脈栓塞卒中模型腦組織中表達顯著增高，并且在急性腦缺血患者血液樣本中水平升高。Hectd1的功能類似于內(nèi)源性miR-142海綿，能夠抑制miR-142活性。研究發(fā)現(xiàn)，當Hectd1表達抑制時，miR-142活性增強，并通過抑制TCCD誘導的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶蛋白抑制自噬，減少腦缺血誘導的星形膠質(zhì)細胞激活，使缺血面積減小，減輕神經(jīng)元損傷。以上研究表明，非編碼RNA干預自噬、減輕腦缺血損傷是多靶點、多途徑的，具體作用機制有待進一步明確。

總之，自噬在減輕腦缺血損傷方面研究意義重大，但過度自噬會導致細胞程序性死亡。如何判定適度自噬，如何調(diào)節(jié)適度自噬，還有待進一步研究和討論。干預非編碼RNA表達可以成為調(diào)節(jié)自噬的一條有效途徑。腦缺血過程中多種非編碼RNA的表達水平發(fā)生變化，通過各種途徑介導腦損傷或產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。非編碼RNA還能作為生物標志物，用于腦缺血性疾病的診斷和治療評估。進一步探索非編碼RNA對自噬的作用機制，有助于尋找自噬調(diào)節(jié)方案，為抗腦缺血損傷提供新的治療方法。