王圣心，王力，張建國，許琪，尋立之，李曉華*

（1中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院&微生物資源與利用湖北省工程技術(shù)研究中心，武漢 430074；2江蘇神力生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，宜興 214221）

淀粉酶是催化淀粉水解酶的總稱，按水解淀粉方式可以將淀粉酶分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶4類.淀粉酶廣泛的應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)中［1-2］，其中用于淀粉轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的酶制劑銷量占全世界酶制劑銷售總量的10%～15%［3-4］.飼料中添加淀粉酶可以提高飼料利用率，促進(jìn)動物生長，減少糞便等污物的排放，改善養(yǎng)殖環(huán)境，提高動物機(jī)體免疫［5-7］.1894年，從真菌中鑒定和分離出淀粉酶，由于淀粉酶具有廣泛用途，引起了廣泛關(guān)注［8］，目前，已報道的能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物主要有：不動桿菌屬（Acinetobacter）、微球菌屬（Micrococcus）、黃隱球酵母（Cryptococcus flavus）、鹽單 胞 菌（Halomonas meridiana）、青 霉 菌 屬（Penicillum）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、假單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、桿菌屬（Bacillus）等［9-11］.α-淀粉酶產(chǎn)生菌大部分來源于自然界中，因此從自然界中分離獲得新的α-淀粉酶產(chǎn)生菌具有重要意義.

本文從健康的牛胃秸稈發(fā)酵物中分離α-淀粉酶產(chǎn)生菌株，并通過菌落特征、生理生化性質(zhì)、16SrDNA序列對比分析對菌株進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步對菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，為α-淀粉酶在秸稈飼料中應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

樣品采集于湖南省長沙縣養(yǎng)殖場健康牛胃秸稈發(fā)酵物.

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，瓊脂18.0 g，H2O 1000.0 mL，pH 7.0.基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，酵母浸粉10.0 g，H2O 1000.0 mL，pH自然.淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.0 g，牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，H2O 1000.0 mL，pH 7.0～7.2.

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)α-淀粉酶菌株的篩選

將牛胃秸稈發(fā)酵物在淀粉液體培養(yǎng)基中37℃，180 r·min-1，富集培養(yǎng)24 h，取富集培養(yǎng)液1 mL，稀釋涂布于淀粉固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，多次分離純化挑取單菌落［12-13］.用牛津杯法［14］測定淀粉降解圈大小，重復(fù)3次.

1.3.2 菌落特征、生理生化特性和16SrDNA序列的擴(kuò)增

將篩選得到的菌株劃線接種后，37℃培養(yǎng)12 h，在顯微鏡下觀察菌落的特征.根據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊》對菌株進(jìn)行生理生化鑒定［14-15］.提取菌株基因組DNA［16］，使用16SrDNA通用引物［17］擴(kuò)增.引物為：16SrDNA-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ；16S rDNA-R：GGTTACCTTGTTACGACTT，PCR產(chǎn)物測序，利用BLAST對16SrDNA序列比對分析，使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.3.3 菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

以培養(yǎng)時間、溫度、pH、碳源、氮源、金屬離子作為影響因素，依次改變其中一種因素，保持其他條件不變，研究各因素對產(chǎn)α-淀粉酶產(chǎn)量的影響.

以1%接種量將SCUEC8菌株接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在溫度為37℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)48 h，每4 h測定一次菌體量和酶活性.將培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為25、30、37、42、50、55℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h.pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0.在溫度為37℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h.每個處理設(shè)置3次重復(fù)，測定菌株的生長量和α-淀粉酶活性.

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、淀粉、魔芋粉作為唯一碳源，濃度為10 g·L-1.分別以酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白、尿素、硫酸銨為唯一氮源，濃度為10 g·L-1.分別添加1 g·L-1的Na+、K+、Mn2+、Cu2+和Mg2+金屬離子.以上述同樣的接種量在37℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h，每個處理設(shè)置3次重復(fù)，測定菌株的α-淀粉酶活性.

按國際單位規(guī)定：在37℃、pH 7.0條件下，每分鐘催化可溶性淀粉水解產(chǎn)生1μg麥芽糖所需要的酶量定義為1個α-淀粉酶酶活單位（1 U）.

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)α-淀粉酶菌株的篩選

從牛胃秸稈發(fā)酵物中分離純化得到11株具有α-淀粉酶活性菌株，α-淀粉酶降解活性測定結(jié)果如表1所示，淀粉降解圈直徑為14.17～32.67 mm，A2菌株淀粉降解圈直徑最小，為14.17 mm，A8菌株淀粉降解圈直徑最大，為32.67 mm，將A8菌株命名為SCUEC8菌株.

表1 菌株淀粉降解圈大小Tab.1 Sizeof starch degradation circleof strain

2.2 α-淀粉酶產(chǎn)生菌SCUEC8菌株的鑒定

SCUEC8菌株菌落呈米白色，菌落扁平，近圓形，邊緣不規(guī)則，易挑取，無色素產(chǎn)生.SCUEC8菌株革蘭氏染色呈陽性.水解淀粉試驗為陽性，甲基紅試驗為陰性.

提取菌株SCUEC8基因組DNA作為模板，用引物16SrDNA-R和16SrDNA-F擴(kuò)增16SrDNA序列，PCR產(chǎn)物測序，利用BLAST對16SrDNA序列比對分析，使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.結(jié)果如圖1所示.由圖1可見：SCUEC8菌株與BacillussubtilisATCC 6051相似性達(dá)到99%.結(jié)合菌落特征和生理生化特性，初步鑒定菌株SCUEC8為枯草芽孢桿菌.

圖1 基于16SrDNA的SCUEC8菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetics tree based on 16SrDNA gene sequence of strain SCUEC8

2.3 培養(yǎng)時間對枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株生長量和酶活性影響

以1%接種量將SCUEC8菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，每隔4 h取樣測定600 nm處吸光值和α-淀粉酶活性，結(jié)果見圖2.由圖2可見：培養(yǎng)時間在0～16 h范圍內(nèi)，菌株生長量和酶活性隨時間的增加而增加，OD600由0.01增加到4.64，酶活性由25.0 U·mL-1增加到273.67 U·mL-1；培養(yǎng)時間在16～48 h范圍內(nèi)，菌株的生長量和酶活性隨著時間的增長而趨于平穩(wěn)，OD600由4.64下降到4.22，酶活性由273.67 U·mL-1下降到208.78 U·mL-1.結(jié)果表明：培養(yǎng)時間為16 h時，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株生長量和酶活性較高.

圖2 培養(yǎng)時間對菌株SCUEC8的生長和產(chǎn)酶活性的影響Fig.2 Effect of culturetimeon growth and enzyme production of SCUEC8 strain

2.4 不同pH值對枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株生長量和酶活性影響

以1%接種量將SCUEC8菌株接種到不同初始pH值的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后測定SCUEC8菌株生長量和α-淀粉酶活性，結(jié)果見圖3.由圖3可見：pH值在2～6范圍內(nèi)，菌株的生長量和α-淀粉酶活性隨pH值的增加而增加，OD600由0.19增加到4.64，酶活性由112.60 U·mL-1增加到294.35 U·mL-1；pH值在6～10范圍內(nèi)，菌株生長量和酶活性隨pH值的增加而逐漸降低，OD600由4.64降低到0.49，酶活性由273.67 U·mL-1下降到141.71 U·mL-1.pH為6.0時，SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性顯著高于其他實驗組（P＜0.05）；pH為2.0時，SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性顯著低于其他實驗組（P＜0.05）.結(jié)果表明：pH值為6時，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株生長量和酶活性較高.

圖3 pH值對SCUEC8菌株生長及產(chǎn)酶活性的影響Fig.3 Effects of pH value on the growth and enzymeproduction of SCUEC8 strain

2.5 培養(yǎng)溫度對枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株生長量和酶活性影響

以1%接種量將SCUEC8菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后測定SCUEC8菌株在不同培養(yǎng)溫度下菌株生長量和α-淀粉酶活性，結(jié)果見圖4.由圖4可見：培養(yǎng)溫度在25～37℃范圍內(nèi)，菌株生長量和酶活性隨培養(yǎng)溫度的升高而增加，OD600由0.12增加到4.64，酶活性由75.20 U·mL-1增加到273.67 U·mL-1；培養(yǎng)溫度在37～55℃范圍內(nèi)，菌株生長量和酶活性隨溫度的升高而下降，OD600由4.64下降到1.31，酶活性由273.67 U·mL-1下降到121.56 U·mL.溫度為37℃時，SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性顯著高于其他實驗組（P＜0.05）；溫度為25℃時，SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性顯著低于其他實驗組（P＜0.05）.結(jié)果表明：培養(yǎng)溫度為37℃時，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株生長量和酶活性較高.

圖4 培養(yǎng)溫度對菌株SCUEC8的生長及產(chǎn)酶活性的影響Fig.4 Effects of culture temperature on the growth and enzymeproduction of SCUEC8 strain

2.6 碳源及其濃度對枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株酶活性影響

以1%接種量將SCUEC8菌株接種到不同碳源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，測定SCUEC8菌株酶活性，結(jié)果見圖5.由圖5可見：分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、淀粉、魔芋粉作為唯一碳源，SCUEC8菌株α-淀粉酶活性分別為287.37、239.82、343.13、273.03、309.52、187.35 U·mL-1.麥芽糖為碳源時，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較高，顯著高于其他5個實驗組（P＜0.05）；魔芋粉為碳源時，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較低，顯著低于其他5個實驗組（P＜0.05）.結(jié)果表明：麥芽糖為碳源時，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較高.

圖5 不同碳源對SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性影響Fig.5 Effect of different carbon sources on enzyme activity of SCUEC8 strain

將發(fā)酵培養(yǎng)基中的麥芽糖設(shè)為不同濃度梯度：5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g·L-1，培養(yǎng)12 h，測定α-淀粉酶活性，結(jié)果見圖6.由圖6可見：麥芽糖濃度在5.0～20.0 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性從292.51 U·mL-1增加到379.23 U·mL-1；麥芽糖濃度在20.0～30.0 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性從379.23 U·mL-1下降到335.82 U·mL-1.麥芽糖濃度為20.0 g·L-1時，SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性顯著高于其他實驗組（P＜0.05）；麥芽糖濃度為5.0 g·L-1時，SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性顯著低于其他實驗組（P＜0.05）.結(jié)果表明：麥芽糖濃度為20.0 g·L-1時，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較高.

圖6 不同濃度麥芽糖對SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性影響Fig.6 Effects of different concentration maltose on enzymeactivity of SCUEC8 strain

2.7 氮源及其濃度對枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性影響

以1%接種量將SCUEC8菌株接種到不同氮源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h測定SCUEC8菌株α-淀粉酶活性，結(jié)果見圖7.由圖7可見：分別以酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白、尿素、硫酸銨為唯一氮源，SCUEC8菌株α-淀粉酶活性分別為284.10、400.12、332.63、272.62、116.02、100.03 U·mL-1.當(dāng)胰蛋白胨作為唯一氮源時，菌株產(chǎn)α-淀粉酶活性最高為400.12 U·mL-1.胰蛋白胨為氮源時，SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較高，顯著高于其他5個實驗組（P＜0.05）；硫酸銨為氮源時，SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較低，顯著低于其他5個實驗組（P＜0.05）.結(jié)果表明：胰蛋白胨為氮源時，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較高.

圖7 不同氮源對SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性影響Fig.7 Effectsof different nitrogen on enzymeactivity of SCUEC8 strain

將胰蛋白胨濃度設(shè)置成不同梯度：5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g·L-1，培養(yǎng)12 h，測定α-淀粉酶活性，結(jié)果見圖8.由圖8可見：胰蛋白胨的濃度在5.0～15.0 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性由353.62 U·mL-1增加到418.61 U·mL-1；胰蛋白胨的濃度在15.0～30.0 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性由418.61 U·mL-1下降到323.73U·mL-1.胰蛋白胨濃度為15.0 g·L-1時，SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性顯著高于其他實驗組（P＜0.05）；胰蛋白胨濃度為30.0 g·L-1時，SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性顯著低于其他實驗組（P＜0.05）.結(jié)果表明：胰蛋白胨濃度為15.0 g·L-1時，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較高.

圖8 不同濃度胰蛋白胨對SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性影響Fig.8 Effectsof different concentration tryptoneon enzymeactivity of SCUEC8 strain

2.8 金屬離子及其濃度對枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性影響

以1%接種量將SCUEC8菌株接種到加入不同金屬離子的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，測定SCUEC8菌株α-淀粉酶活性，結(jié)果見圖9.由圖9可見：分別添加1 g·L-1的Na+、K+、Mn2+、Cu2+和Mg2+金屬離子，SCUEC8菌株α-淀粉酶活性分別為349.28、306.03、457.30、272.41、260.12 U·mL-1.添加Mn2+，SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較高，顯著高于其他4個實驗組（P＜0.05）；添加Mg2+，SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較低，除與Cu2+組無顯著性差異以外，與其他3個實驗組均有顯著性差異（P＜0.05）.結(jié)果表明：添加Mn2+，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較高.

圖9 不同金屬離子對SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性影響Fig.9 Effectof differentmetal ionsonenzymeactivityof SCUEC8strain

將Mn2+濃度設(shè)置成不同梯度：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1，培養(yǎng)12 h，測定α-淀粉酶活性，結(jié)果見圖10.由圖10可見：Mn2+濃度在0.5～1.0 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性由372.44 U·mL-1增長到441.72 U·mL-1；Mn2+濃度在1.0～3.0 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性由441.72 U·mL-1下降到301.89 U·mL-1.Mn2+濃度為1.0 g·L-1時，SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性顯著高于其他實驗組（P＜0.05）；Mn2+濃度為3.0 g·L-1時，SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性顯著低于其他實驗組（P＜0.05）.結(jié)果表明：Mn2+濃度為1.0 g·L-1時，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性較高.

圖10 不同濃度Mn2+對SCUEC8菌株產(chǎn)酶活性影響Fig.10 Effectsof different concentration Mn2+on enzymeactivity of SCUEC8 strain

3 討論

本文從健康牛胃秸稈發(fā)酵物中篩選出11株產(chǎn)α-淀粉酶的菌株，其中SCUEC8菌株α-淀粉酶活性較高，通過對SCUEC8菌株形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特性，結(jié)合16SrDNA序列對比分析，初步鑒定該菌為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）.不同碳源、氮源、培養(yǎng)條件等因素對枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株產(chǎn)酶的影響進(jìn)行研究，在培養(yǎng)時間為16 h、pH為6.0、培養(yǎng)溫度為37℃、碳源為20.0 g·L-1的麥芽糖、氮源為15.0 g·L-1的胰蛋白胨、金屬離子為1.0 g·L-1的Mn2+時，枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株生長量和α-淀粉酶的活性較高，為枯草芽孢桿菌SCUEC8菌株在秸稈飼料中應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

目前已報道的枯草芽孢桿菌HM-22［17］，優(yōu)化后的α-淀粉酶活力為147.53 U·mL-1，低于SCUEC8菌株，優(yōu)化后的產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)時間24 h、培養(yǎng)溫度40℃，pH 6.0、碳源為淀粉、氮源為牛肉膏.AL-JOHANI［19］等從溫泉中分離出一株產(chǎn)α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌，優(yōu)化后的產(chǎn)酶條件為：溫度為45℃，pH為8.5，碳源為淀粉，氮源與SCUEC8菌株相同為胰蛋白胨，α-淀粉酶活力為18 U·mL-1.KUBRAK［20］等分離出一株芽孢桿菌屬BKL20菌株，在培養(yǎng)時間為9 h，pH為7.0時，α-淀粉酶活力為300 U·mL-1，低于SCUEC8菌株.雖然很多研究者從芽孢桿菌中分離出產(chǎn)α-淀粉酶菌株，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)生產(chǎn)對產(chǎn)酶菌株需求和酶性質(zhì)的要求，產(chǎn)α-淀粉酶菌種資源的篩選備受矚目，期待具有高活性的產(chǎn)α-淀粉酶微生物被不斷分離，其優(yōu)良特性被進(jìn)一步闡明，使其應(yīng)用前景更加廣闊.