何雋，馬錦濤，馬蕊，吳風，楊誠鑫，馮濤

（中南民族大學 藥學院，武漢 430074）

自然生態(tài)系統(tǒng)中的植物與菌根真菌或真菌內(nèi)生菌共生.這些共生真菌可對植物生態(tài)、適應(yīng)性以及塑造植物群落產(chǎn)生深遠影響，并對相關(guān)生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性表現(xiàn)出強烈影響［1］.自然界中的真菌是許多結(jié)構(gòu)新穎和生物活性顯著的有機化合物的豐富來源［2］.獼猴桃是聞名世界的水果之王，但獼猴桃潰瘍病對獼猴桃植株的健康生長有極大的破壞性，其致病菌為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa）.目前，仍缺乏有效的手段防治該細菌性病害.為了尋找安全有效的Psa抑制劑，本研究從獼猴桃內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物出發(fā)，挖掘具有拮抗Pseudomonas syringaepv.actinidiae（Psa）活性的內(nèi)生菌天然產(chǎn)物.

鐮刀菌屬真菌（Fusarium）在自然界中廣泛分布，所產(chǎn)生的霉菌毒素對人類和動物均具有顯著影響.前期研究從獼猴桃健康植株中分離出一種鐮刀菌屬真菌Fusarium tricinctum（F.tricinctum），文獻調(diào)查發(fā)現(xiàn)該菌的代謝產(chǎn)物中蘊含大量的fusagerins、chlamydosporol、enniatins、trichothecene以及其他萜類成分［3-7］.鐮刀菌次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣、復(fù)雜，并具有廣泛的生物活性，如抗膽堿酯酶、抗細菌、抗真菌和抗癌活性［8-9］.為了從F.tricinctum中找到能抑制Psa的活性分子，本文對該菌的大米發(fā)酵提取物進行了化學成分研究，共分離得到15個化合物（圖1）.通過核磁共振、高分辨質(zhì)譜以及多種波譜學方法確定了化合物的結(jié)構(gòu)，分別為：1H-indole-3-carboxaldehyde（1），indole-3-acetic acid（2），indole-3-acetic acid methyl ester（3），nicotinic acid（4），Nacetylanthranilic acid（5），4-hydroxybenzaldehyde（6），methyl 4-hydroxybenzeneacetate（7），methylphydroxyphenyl acetate（8），methyl 4-hydroxy-3-methoxyphenylacetate（9），α- hydroxy-βphenylpropionic acid（10），methyl 4-hydroxy-3，5-dimethoxybenzeneacet ate（11），3， 4， 5-trimethoxyphenylacetic acid methyl ester（12），3，7，9-trihydroxy-1-methyl-6H-dibenzo［b，d］pyran-6-one（13），enniatin B1（14）和enniatin A1（15）.對化合物13～15進行了抗Psa活性篩選.

圖1 化合物1～15的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structuresof compounds1-15

1 實驗部分

1.1 實驗儀器和材料

瑞士Biotage Isolera one中壓制備系統(tǒng)；Agilent 1200/1260高效液相色譜儀（美國）；Bruker 500/600 MHz核磁共振波譜儀（德國）；Bruker HCT/Esquire質(zhì)譜儀（德國）；TECAN spark10M酶標儀（瑞士）.

薄層層析硅膠板GF254和柱層析硅膠（80～100目以及200～300目）均購自中國青島海洋化工廠；Sephadex LH-20凝膠（瑞士Amersham biosciences）；Agilent ZORBAXSB-C18柱（分析型：4.6 mm×150 mm；制備型：9.4 mm×150 mm），徑粒為5μm；顯色劑為香草醛10%硫酸溶液.

1.2 獼猴桃內(nèi)生真菌F.tricinctum以及Psa的培養(yǎng)

采用固體發(fā)酵方法：大米80 g，加水100 mL，置于500 mL三角燒瓶中，于121℃滅菌鍋滅菌20 min，共培養(yǎng)150瓶；培養(yǎng)條件：恒溫24℃；靜置，暗培養(yǎng)30 d.Psa由西北農(nóng)林科技大學閆合博士贈送，在35℃使用LB培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng).

1.3 提取分離

將發(fā)酵好的F.tricinctum次級代謝產(chǎn)物置于2倍體積的丙酮中反復(fù)浸泡6次，每次24 h，減壓濃縮除去有機溶劑，加入乙酸乙酯2 L和等體積的去離子水置于5 L分液漏斗中反復(fù)萃取5次，減壓濃縮最后稱取浸膏180 g.將所得浸膏于中壓柱用水/甲醇（80∶20，60∶40，40∶60，30∶70，20∶80，10∶90，0∶100）梯度洗脫得5個組分（A～E），將D組分經(jīng)正相硅膠柱層析用氯仿/甲醇（1∶0，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，0∶1）系統(tǒng)梯度洗脫得5個亞組分（D1～D5）.

組分D5經(jīng)正相硅膠柱層析（石油醚-丙酮1∶0，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，0∶1）分離得到5個組分，D5-1～D5-5，D5-4粗樣品10 mg，經(jīng)過半制備型HPLC甲醇-水體系（10%～25%，20 min）純化得到化合物1（5 mg）和化合物2（2 mg）.組分D5-3 100 mg經(jīng)Sephadex-LH 20（氯仿-甲醇1∶1）層析，得到6個組分（D5-3-1～D5-3-5），其中第一個組分（D5-3-1）經(jīng)正相硅膠（200～300目）乙酸乙酯：甲醇（50∶1～0∶1）洗脫，得到結(jié)晶，通過多次不同溶劑體系洗滌得到化合物3（10 mg），D5-3-4 500 mg經(jīng)正相硅膠柱層析用氯仿-甲醇（30∶1～0∶1）層析，得到8個組分，D5-3-4-1～D5-3-4-8，D5-3-4-8經(jīng)過制備型HPLC甲醇-水（甲酸）體系（5%～25%，20 min）得到化合物4（3 mg）、化合物5（15 mg）和化合物6（10 mg）.D5-3-4-6經(jīng)過HPLC甲醇-水（甲酸）體系（10%～25%，20 min），純化得到化合物7（10 mg），化合物8（15 mg），化合物9（15 mg）和化合物10（3 mg）.D5-2組分經(jīng)正相硅膠柱層析（石油醚-丙酮：5∶1～0∶1），得到組分D5-2-1～D5-2-3，D5-2-2半制備型HPLC甲醇-水體系（15%～25%，25 min）得到化合物11（2 mg），化合物12（3.5 mg）和化合物13（2 mg）.D5-1-1經(jīng)正相柱層析得到化合物14（8 mg）和15（6 mg）.

1.4 抗菌活性實驗

將培養(yǎng)達到對數(shù)生長期的菌液稀釋至1×106CFU/mL進行抗菌活性測定.采用96孔板二倍稀釋法［10］檢測化合物13～15對Psa的拮抗活性.將100μL稀釋至1×106CFU/mL菌液分配到96孔板中.將藥物二倍稀釋成不同的濃度梯度（200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μg/mL），每3個孔作平行試驗，5%DMSO作為空白對照，35℃下靜置培養(yǎng)12 h，利用酶標儀測OD600.

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：分子式C9H7NO，淡黃色固體.1H NMR（600 MHz，methanol-d4）δH9.88（s，J=0.9 Hz，1H），8.15（d，J=7.6 Hz，1H），8.10（s，J=1.1 Hz，1H），7.49-7.43（d，J=7.6 Hz，1H），7.31-7.21（m，2H）.13CNMR（150 MHz，methanol-d4）δC186.0（d），138.3（d），137.5（s），124.3（s），123.6（d），122.2（d），121.0（d），118.7（s），111.7（d）.HRESIMS m/z：146.0600［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［11］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物1被確定為1H-indole-3-carboxaldehyde.

化合物2：分子式C10H9NO2，淡黃色固體.1H NMR（600 MHz，methanol-d4）δH7.56（d，J=7.6 Hz，1H），7.31（d，J=12.0 Hz，1H），7.14（s，1H），7.06（ddd，J=8.1，6.9，1.1 Hz，1H），6.98（td，J=7.4，6.9，1.0 Hz，1H），3.66（s，2H）.13CNMR（150MHz，methanol-d4）δC178.1（s），136.6（s），127.5（s），122.9（d），120.8（d），118.2（d），118.1（s），110.6（d），109.1（s），32.4（t）.HRESIMS m/z：176.0706［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［12］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物2被確定為indole-3-acetic acid.

化合物3：分子式C11H11NO2，淡黃色粉末.1H NMR（600 MHz，methanol-d4）δH7.50（d，J=7.9 Hz，1H），7.33（d，J=8.1 Hz，1H），7.15（s，1H），7.09（t，J=7.5 Hz，1H），7.00（t，J=7.5 Hz，1H），3.76（s，2H），3.67（d，J=1.9 Hz，3H）.13C NMR（150 MHz，methanol-d4）δC173.4（s），136.6（s），127.1（s），123.2（d），121.0（d），118.4（d），117.9（s），110.8（d），107.1（s），50.9（q），30.4（t）.HRESIMSm/z：190.0862［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［13］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物3被確定為indole-3-acetic acid methyl ester.

化合物4：分子式C6H5NO2，白色固體.1H NMR（600 MHz，methanol-d4）δH9.12（dd，J=2.2，0.9 Hz，1H），8.73（dd，J=5.0，1.7 Hz，1H），8.41（dt，J=7.9，1.9 Hz，1H），7.57（ddd，J=8.0，4.9，0.9 Hz，1H）.13C NMR（150 MHz，methanol-d4）δC166.3（s），152.2（d），149.8（d），137.8（d），127.3（d），123.8（d）.HRESIMSm/z：124.0393［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［14］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物4被確定為nicotinic acid.

化合物5：分子式C9H9NO3，白色固體.1H NMR（500 MHz，methanol-d4）δH8.49（d，J=8.3 Hz，1H），8.06（d，J=7.8 Hz，1H），7.43（ddd，J=8.6，7.3，1.5 Hz，1H），7.11-7.05（m，1H），2.18（s，2H）.13C NMR（150 MHz，methanol-d4）δC175.2（s），171.3（s），141.7（s），133.5（s），132.5（d），123.7（d），121.7（d），120.8（d），25.1（q）.HRESIMSm/z：180.0655［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［15］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物5被確定為N-acetylanthranilic acid.

化合物6：分子式C7H6O2，白色固體.1H NMR（600 MHz，methanol-d4）δH9.74（s，1H），7.76（d，J=8.7 Hz，1H），6.89（d，J=1.2，Hz，1H）.13C NMR（150 MHz，methanol-d4）δC192.7（d），166.1（s），133.5（d），133.5（d），129.8（s），117.1（d）.HRESIMSm/z：123.0440［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［16］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物6被確定為4-hydroxybenzaldehyde.

化合物7：分子式C9H10O3，白色粉末.1H NMR（600 MHz，methanol-d4）δH7.04（d，J=8.5 Hz，2H），6.70（d，J=8.6 Hz，2H），3.63（d，J=0.8 Hz，3H），3.50（s，2H）.13CNMR（150 MHz，methanol-d4）δC174.6（s），157.6（s），131.3（d），131.3（d），126.3（s），116.2（d），116.2（d），52.3（q），40.8（t）.HRESIMSm/z：167.0702［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［17］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物7被確定為methylp-hydroxyphenyl acetate.

化合物8：分子式C8H8O3，白色固體.1H NMR（600 MHz，methanol-d4）δH7.53（d，J=7.7 Hz，1H），7.11（t，J=7.9Hz，1H），7.04（dd，J=8.1，1.4Hz，1H），2.23（s，3H）.13C NMR（150 MHz，methanol-d4）δC171.6（s），149.9（s），126.5（d），126.1（d），125.5（d），122.2（d），121.6（s），22.2（q）.HRESIMSm/z：153.0546［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［18］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物8被確定為methyl 4-hydroxybenzeneacetate.

化合物9：分子式C10H12O4，白色粉末.1H NMR（500 MHz，methanol-d4）δH6.84（d，J=1.9 Hz，1H），6.72（d，J=8.0 Hz，1H），6.68（dd，J=8.1，1.9 Hz，1H），3.83（d，J=1.1 Hz，3H），3.66（d，J=0.9 Hz，3H），3.54（s，2H）.13CNMR（125 MHz，methanol-d4）δC174.5（s），148.9（s），146.7（s），126.9（s），122.9（d），116.1（d），113.9（d），56.3（q），52.4（q），41.2（t）.HRESIMSm/z：197.0808［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［19］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物9被確定為methyl 4-hydroxy-3-methoxyphenylacetate.

化合物10：分子式C9H10O3，白色粉末.1H NMR（500 MHz，methanol-d4）δH7.19（d，J=4.3 Hz，4H），7.12（d，J=4.2 Hz，1H），4.25（dd，J=8.2，4.2 Hz，1H），3.03（dd，J=13.9，4.2 Hz，1H），2.82（dd，J=13.9，8.1 Hz，1H）.13CNMR（150 MHz，methanol-d4）δC177.3（s），138.9（d），130.5（d），129.2（d），127.4（d），72.9（d），41.6（t）.HRESIMS m/z：167.0702［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［20］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物10被確定為α-hydroxy-βphenylpropionic acid.

化合物11：分子式C11H14O5，白色粉末.1H NMR（500 MHz，methanol-d4）δH6.54（s，2H），3.82（s，6H），3.67（s，3H），3.55（s，2H）.13CNMR（150 MHz，methanol-d4）δC173.0（s），147.8（s），147.8（s），134.2（d），124.7（d），106.2（s），106.2（s），55.3（q），55.3（q），51.1（q），40.2（t）.HRESIMS m/z：227.2354［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［21］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物11被確定為methyl 4-hydroxy-3，5-dimethoxybenzeneacetate.

化合物12：分子式C12H16O5，白色固體.1H NMR（500 MHz，methanol-d4）δH6.58（s，2H），3.82（s，3H），3.74（s，3H），3.68（s，3H），3.59（s，2H）.13C NMR（150 MHz，methanol-d4）δC174.0（s），154.4（s），154.4（s），131.6（d），122.2（d），107.7（s），107.7（s），61.0（q），56.5（q），56.5（q），52.5（q），41.8（t）.HRESIMSm/z：241.1070［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［22］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物12被確定為3，4，5-trimethoxyphenylacetic acid methyl ester.

化合物13：分子式C14H10O5，黃色粉末.1H NMR（500 MHz，methanol-d4）δH7.26（d，J=2.1 Hz，1H），6.69（d，J=2.7 Hz，1H），6.61（d，J=2.6 Hz，1H），6.36（d，J=2.0 Hz，1H），2.76（s，3H）.13C NMR（150 MHz，methanol-d4）δC167.0（s），166.9（s），166.2（s），159.8（s），154.4（s），140.0（s），139.8（s），118.5（s），110.9（d），105.5（s），102.7（d），101.9（d），99.1（s），25.8（q）.HRESIMSm/z：259.0601［M+H］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［23］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物13被確定為3，7，9-trihydroxy-1-methyl-6H-dibenzo［b，d］pyran-6-one.

化合物14：分子式C33H57N3O9，白色晶體.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δH5.16（d，J=8.5 Hz，1H），5.12（dd，J=14.3，8.6 Hz，2H），4.71（d，J=9.7 Hz，1H），4.50（d，J=9.7 Hz，1H），4.45（d，J=9.7 Hz，1H），2.22-2.36（m，5H），2.09-2.06（m，1H），1.89（s，2H），1.26（m，1H），1.07（d，J=6.6 Hz，6H），1.03-0.92（m，20H），0.91-0.86（m，9H）.13CNMR（125 MHz，CDCl3）δC113CNMR（125 MHz，CDCl3）δC170.3（s），169.3（s），77.2（d），75.8（d），75.4（d），63.5（d），63.4（d），61.5（d），33.8（d），33.4（d），32.7（q），29.9（d），29.9（q），28.0（q），27.9（d），25.3（t），20.5（q），19.4（q），18.7（q），18.6（q），18.6（q），18.4（q），16.1（q），10.8（q）.HRESIMS m/z：676.4143［M+Na］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［24］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物14被確定為enniatin B1.

化合物15：分子式C36H63N3O9，白色固體.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δH5.11（d，J=8.3 Hz，1H），4.64（d，J=9.6 Hz，1H），3.11（s，3H），2.25（q，J=7.1 Hz，1H），2.06（d，J=7.1 Hz，1H），1.42（ddd，J=13.8，7.5，3.3 Hz，1H），1.14-1.07（m，1H），1.00（d，J=6.7 Hz，3H），0.97（d，J=6.6 Hz，1H），0.94（d，J=6.8 Hz，3H），0.86（t，J=7.4 Hz，4H）.13CNMR（150 MHz，CDCl3）δC170.60（s），169.58（s），75.73（d），61.92（d），34.11（d），33.12（d），30.07（d），25.59（t），18.74（q），18.63（q），16.39（q），11.07（q）.HRESIMSm/z：704.4456［M+Na］+.以上數(shù)據(jù)與文獻［25］數(shù)據(jù)基本一致.故化合物15被確定為enniatin A1.

2.2 抗菌活性結(jié)果

化合物1～12均為常見的小分子化合物，因此本文只對非常見化合物13～15做了抗菌活性，結(jié)果表明化合物13～15均表現(xiàn)出一定的抗菌活性（表1）.

表1 化合物13～15的抗菌活性（MIC，μg/mL）Tab.1 Anti-Psa activities of compounds 13-15

3 結(jié)語

通過對獼猴桃內(nèi)生真菌（Fusarium tricinctum）次級代謝產(chǎn)物的研究，分離純化得到化合物15個，其中含氮芳香類化合物5個，酚類化合物8個以及環(huán)肽類2個，所有化合物均是首次從該菌種中分離得到.活性研究發(fā)現(xiàn)化合物14對獼猴桃潰瘍病致病菌Psa有一定的抑制活性.該研究豐富了獼猴桃內(nèi)生真菌化學成分的結(jié)構(gòu)類型，也為從獼猴桃內(nèi)生菌中挖掘抗菌活性物質(zhì)提供了參考方法.