胡婕，李紅衛(wèi)，付艷平，余麗，文治杰，胡燕

（中南民族大學 藥學院&民族藥學國家示范中心，武漢 430074）

水凝膠是一種親水、穩(wěn)定但不溶于水的三維網(wǎng)狀結構［1］，因其良好的生物組織相容性，在生物醫(yī)學領域中應用非常廣泛.微凝膠更是由于粒徑小、載藥量高、生物相容性好、且環(huán)境響應性靈敏，在藥物緩控釋系統(tǒng)中的應用具有獨特的優(yōu)勢［2-3］.

海藻酸鈉（sodium hyaluronate，SA）是從褐藻類海帶或者馬尾藻中提取出來的高分子多糖，具有制劑輔料所需要的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性，常被用作藥用輔料［2-3］.但是純SA-Ca2+制備的水凝膠存在藥物突釋和穩(wěn)定性差的缺點，這是SA水凝膠在緩控釋制劑領域上應用受到限制的主要原因［4］.透明質酸（hyaluronic acid，HA）是廣泛存在于皮膚組織、結締組織和神經(jīng)組織中的一種糖胺聚糖，具有優(yōu)異的生物相容性和生物降解性能，經(jīng)過化學交聯(lián)后形成的HA水凝膠穩(wěn)定性良好［5-6］，但HA具有對酸堿環(huán)境不敏感的缺點，導致藥物在胃腸道中不容易釋放［7-9］.本研究將具有生物相容性和生物降解性的天然高分子材料SA和HA結合［10］，通過乳化法制備得到一種對pH敏感的具有互穿網(wǎng)絡結構的復合微凝膠，該微凝膠不僅解決了材料自身存在的缺陷，而且制備出的HA-SA復合微凝膠有明顯的pH敏感性，可控制藥物緩慢持久釋放，在藥物遞送和治療腸道疾病中具有潛在價值［11-13］.

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

海藻酸鈉（SA）、透明質酸（HA，食品級）、姜黃素、二甲雙胍、吲哚美辛（上海阿拉?。?；液體石蠟、司盤、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）、己二酸二酰肼（ADH）、無水氯化鈣、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇均為分析級（國藥集團）.

1.2 復合微凝膠的制備

1.2.1 復合微凝膠的交聯(lián)原理

HA-SA復合水凝膠的制備原理主要分為兩部分.首先為HA分子中的羧酸根與交聯(lián)劑己二酸二酰肼（ADH）分子中的氨基在碳二亞胺（EDC）/N-羥基丁二酰亞胺（NHS）催化條件下反應，脫水縮合形成了酰胺鍵，得到HA-ADH網(wǎng)絡結構；SA在Ca2+溶液中發(fā)生非共價鍵的物理交聯(lián)，形成了SA-Ca2+網(wǎng)絡結構，兩者混合，形成了一種有互穿網(wǎng)絡結構的復合微凝膠，交聯(lián)原理見圖1.

圖1 HA-SA復合微凝膠交聯(lián)原理圖Fig.1 Cross-linkingmechanismof HA-SA compositemicrogels

1.2.2 復合微凝膠的制備過程

稱取0.4 g SA和0.2 g HA于燒杯中，加入20 mL蒸餾水，磁力攪拌溶解后往燒杯中加入ADH和催化劑EDC/NHS，繼續(xù)攪拌至所有原料完全溶解后分為兩部分.一部分樣品加入液體石蠟和司盤，繼續(xù)機械攪拌20 min乳化，將乳化后的乳液滴加到新鮮配制的2.5%CaCl2溶液中，攪拌40 min后，放置幾分鐘，待所制備的微凝膠沉積于燒杯底部，棄上層液體，再將微凝膠清洗風干即得空白的HA-SA復合微凝膠.而另一部分采用直接滴制法加入到2.5%CaCl2溶液制備HA-SA宏觀水凝膠，后續(xù)處理方法相同.制備流程見圖2.

圖2 HA-SA復合微凝膠制備流程圖Fig.2 Flow chart of the preparation process of HA-SA composite microgels

1.3 復合微凝膠的表征

將新鮮制備及自然風干后的水凝膠、復合微凝膠分別平鋪于白色的背景上，觀察并拍照；取少量冷凍干燥后的微凝膠樣品，以1∶99的比例將待測樣品與溴化鉀充分混合，研磨后制片進行紅外分析（IR）；經(jīng)X射線衍射儀（XRD）來測定冷凍干燥后的HA-SA微凝膠樣品的晶型結構.管壓：40 kV，掃描速度：1°/min，2θ范圍：4°～40°.

1.4 HA-SA復合水凝膠的溶脹測試

稱取風干后的復合水凝膠（質量W0）后，放入37℃中pH 1.2的模擬胃液（SGF）中，每隔0.5 h取出，擦干，記錄質量（Wt）.2 h后更換到pH 7.4的模擬腸液（SIF）中，記錄質量（Wt）的變化.最后使用公式（1）計算HA-SA復合水凝膠的溶脹率：

式中，SR為溶脹率，Wt為溶脹后的復合水凝膠質量，W0為復合水凝膠的初質量.

1.5 復合微凝膠的釋藥行為研究

取0.05 g的HA-SA微凝膠，加入SGF 50 mL，于37℃，100 r/min恒溫振蕩，每隔0.5 h取樣4 mL，同時補充同體積新鮮釋放介質；2 h后將SGF更換為SIF，同樣的方法繼續(xù)進行測試.將模型藥物姜黃素［14］、吲哚美辛［15］及二甲雙胍經(jīng)紫外分光光度計分別于430、320、233 nm波長處測定吸光度得標準曲線，計算藥物濃度后由公式（2）得到累積釋藥率，以時間與累積釋藥率制作各藥物的釋藥曲線.累積釋藥率按以下公式進行計算：

Qn為累積的釋藥率（%）；Cn為n次取樣時樣液中所含的藥物濃度（μg/mL）；V為取樣體積（4 mL）；V0為錐形瓶內溶液的總體積（50 mL），其中W是載藥量.

以交聯(lián)時間、CaCl2濃度以及不同模型藥物等對微凝膠釋藥性能進行進一步考察.

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1.5.1 交聯(lián)時間

按照1.2制備方法稱取4組SA和HA于燒杯中，加入蒸餾水，攪拌溶解后往燒杯中加入ADH、EDC/NHS和0.1 g姜黃素，然后繼續(xù)攪拌，控制交聯(lián)時間為6、9、10和12 h.而后制備方法同1.2，最終得到不同交聯(lián)時間的HA-SA復合載藥微凝膠.由釋藥結果，得最佳交聯(lián)時間.

1.5.2 CaCl2濃度

其他條件不變，CaCl2的濃度分別為2%、2.5%、3%、3.5%、4%、5%，上述同法制備5組微凝膠，然后進行釋藥實驗.由釋藥結果，得出最佳交聯(lián)CaCl2濃度.

1.5.3 不同載藥復合微凝膠

稱取3份0.4 g SA和0.2 g HA，其他條件不變，分別稱取0.1 g的姜黃素、吲哚美辛和二甲雙胍，制備3組不同的載藥微凝膠，然后自然風干.制得的微凝膠進行釋藥，由釋藥結果得出微凝膠對不同藥物的緩釋效果.

2 結果與討論

2.1 復合微凝膠的表征分析

2.1.1 復合水凝膠與復合微凝膠的形貌表征

由圖3可知，新制的HA-SA復合水凝膠是白色的球狀體，球體直徑約為0.3 cm，風干后體積明顯變小，直徑約0.1 cm；而溶脹后的水凝膠變成了近透明的球體，體積比新制的水凝膠大.而制備的HA-SA復合微凝膠呈白色小球狀，風干后偏粉末，體積明顯變小；載姜黃素藥物的HA-SA微凝膠呈現(xiàn)黃色，直徑約為0.05 cm.

圖3 HA-SA復合水凝膠及HA-SA復合微凝膠的形貌比較Fig.3 Comparison of morphology of HA-SA compositehydrogel and HA-SA compositemicrogel

2.1.2 復合微凝膠的FT-IR及XRD分析

由圖4可知，HA-SA復合微凝膠的圖譜保留了純HA及SA的特征吸收峰，且HA-SA紅外光譜中1680 cm-1處新增了酰胺鍵的吸收峰，由此可知，HA的-COOH與交聯(lián)劑ADH的-NH2成功的進行了脫水縮合反應形成了酰胺鍵.

圖4 HA-SA復合微凝膠紅外光譜分析Fig.4 Infrared spectrum analysis of HA-SA compositemicrogel

從圖5中可看出SA的衍射圖在衍射角（2θ）約為14°左右處有尖銳的衍射峰，而HA的衍射圖沒有尖銳峰，該結果表示材料SA具有晶形結構，HA沒有晶形結構.而以SA、HA為原料制備的HA-SA復合微凝膠也沒有出現(xiàn)衍射峰，由此可知SA在經(jīng)物理交聯(lián)后結構變?yōu)椴欢ㄐ徒Y構.

圖5 HA-SA復合微凝膠X射線衍射圖譜分析Fig.5 X-ray diffraction pattern analysisof HA-SA compositemicrogel

2.2 復合水凝膠溶脹性能分析

水凝膠的溶脹性能是影響是藥物釋放的重要因素.為此，首先考察了HA-SA宏觀水凝膠的溶脹性能，以期進一步考察其微凝膠的釋藥行為.由圖6可知，該復合水凝膠有明顯的pH敏感性，前2 h于SGF中HA-SA復合水凝膠基本不溶脹，溶脹率在5以內，而當2 h后更換SIF，此后水凝膠網(wǎng)絡結構逐漸打開，體積變大不斷溶脹，約33.5 h后達到最大溶脹率44.故此水凝膠由pH=1.2的SGF轉至pH=7.4的SIF中后，溶脹率發(fā)生明顯變化，由SGF中幾乎不溶脹到SIF中逐漸溶脹并最終達44的溶脹率，充分說明該凝膠體系具顯著pH敏感性，可控制藥物在腸道緩慢持續(xù)釋放.

圖6 HA-SA復合水凝膠的溶脹曲線Fig.6 Swellingcurveof HA-SA compositehydrogel

2.3 復合微凝膠釋藥性能分析

通過對復合微凝膠進行單因素考察，得到交聯(lián)時間、CaCl2濃度以及不同模型藥物等因素對該微凝膠釋藥性能的影響，結果見圖7.

圖7 制備條件對HA-SA復合微凝膠釋藥性能的影響Fig.7 Theinfluenceof preparation conditions on thedrugreleaseperformance of HA-SA compositemicrogels

2.3.1 交聯(lián)時間

由圖7（a）可知交聯(lián)12 h所得微凝膠對pH變化最敏感，可更好地控制藥物在腸道緩慢持久的釋放，此時微凝膠具有較好的pH響應性.且交聯(lián)12 h時，可達更好的交聯(lián)度，使整個凝膠體系更加穩(wěn)定.

2.3.2 CaCl2濃度

SA濃度不變（圖7（b）），不同濃度的CaCl2溶液制備的微凝膠累積釋藥率大致相同，都可達包載量的90%以上，表明Ca2+不是影響微凝膠釋藥性能的關鍵因素，但比較而言2.5%CaCl2的緩釋效果較好.

2.3.3 不同載藥復合微凝膠

微凝膠對姜黃素有良好的緩釋作用效果（圖7（c））；而吲哚美辛微凝膠在前2 h就發(fā)生藥物突釋且平衡時只有約60%的釋藥量，藥物釋放不完全；二甲雙胍微凝膠突釋嚴重.相同的凝膠體系，由于二甲雙胍極易溶于水，而溶解度大的藥物釋藥較快［16］，且吲哚美辛較姜黃素也有較好的溶解性.因此，該微凝膠體系對姜黃素具有最好的緩釋作用，可控制藥物在腸道緩慢持久釋放發(fā)揮治療作用.

3 結語

以HA和SA為原料，制備了一種具有互穿網(wǎng)絡結構的pH敏感型微凝膠，該體系反應條件溫和，原料經(jīng)濟易得且制備簡便.當溶脹時間為33.5 h時復合微凝膠溶脹率達44；當Ca2+濃度為2.5%，交聯(lián)時間為12 h時，復合微凝膠有最佳釋藥性能；且該微凝膠對姜黃素的緩釋效果要優(yōu)于吲哚美辛和二甲雙胍.HA-SA復合微凝膠不僅具有pH敏感性控制藥物在腸道中的作用而且可以控制藥物的緩慢持久釋放，在藥物遞送和治療腸道疾病領域上具有潛在價值.