謝宜兵，黃潔，鄧婷婷，馬世杰，孫文武，吳濱

（中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074）

核苷作為一種基本的生物分子，是構(gòu)成DNA和RNA的重要結(jié)構(gòu)單元，在生命體內(nèi)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)與新陳代謝過程中均起著關(guān)鍵作用［1］.通過模擬天然核苷的基本骨架獲得的核苷類似物（nucleoside analogs）在治療病毒感染和抗腫瘤方面取得了巨大的成功［2-3］.核苷類藥物可以干擾病毒核酸的復(fù)制，從而抑制皰疹病毒的繁殖［4］.代表性的核苷類抗病毒藥物有阿昔洛韋（Acyclovir，ACV）、更昔洛韋（Ganciclovir）和噴昔洛韋（Penciclovir）等（圖1）.伐昔洛韋（Valaciclovir）和纈更昔洛韋（Valganciclovir）分別為阿昔洛韋與更昔洛韋的纈氨酸酯前藥，氨基酸的引入較好地改善了原藥物水溶性差、半衰期短、生物利用度不高的缺點(diǎn)［4-5］.

圖1 核苷類抗病毒藥物Fig.1 Nucleoside antiviral drugs

以現(xiàn)有核苷藥物作為先導(dǎo)化合物來篩選新藥是一條合理的途徑［6-7］.同時(shí)，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）已成為合理藥物設(shè)計(jì)中不可或缺的一環(huán)，在新藥研發(fā)中發(fā)揮著越來越重要的作用.細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）是潛在的細(xì)胞靶點(diǎn)，參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制［8-10］.最近通過藥理實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)［11］，CDK2抑制劑具有抗單純皰疹病毒（HSV）活性.因此，以CDK2為靶點(diǎn)的抗病毒藥物已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn).

本文以抗病毒藥阿昔洛韋為先導(dǎo)化合物，設(shè)計(jì)并合成了8個(gè)阿昔洛韋衍生物，并以此類化合物及其脫Cbz（芐氧羰基）保護(hù)基后的結(jié)構(gòu)為配體，通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法研究阿昔洛韋衍生物與CDK2靶蛋白分子對接情況，預(yù)測了阿昔洛韋衍生物的抗HSV活性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

N-1300D-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器）；HSGF254薄層層析硅膠板（煙臺江友）；ZF-1型三用紫外線分析儀（上海金鵬分析儀器）；300～400目硅膠（煙臺江友）.阿昔洛韋、N-Cbz-甘氨酸、N-Cbz-L-纈氨酸、N-Cbz-L-異亮氨酸、N-Cbz-L-蛋氨酸、N-Cbz-O-芐基-L-蘇氨酸、N-Cbz-L-脯氨酸、N-Cbz-L-哌啶甲酸、N-Cbz-甘氨酰-L-脯氨酸、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷（DCM）均購買于伊諾凱.

1.2 目標(biāo)化合物的合成

向干燥的25 mL反應(yīng)瓶中依次加入阿昔洛韋（1.0 mmoL）、N-Cbz-氨 基 酸（1.2 equiv）、EDCI（1.5 equiv）、DMAP（0.1 equiv）和DMF（2.0 mL），將反應(yīng)混合物置于室溫下反應(yīng)24 h.待反應(yīng)完全后，向反應(yīng)液中加入冷水使產(chǎn)物析出，抽濾，用水洗滌3次，取濾餅烘干，得到粗產(chǎn)物.將粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入適量DCM和適量硅膠，用循環(huán)水泵旋干DCM的同時(shí)保證粗產(chǎn)物和硅膠混合均勻，干法上樣，柱層析分離得到目標(biāo)化合物（圖2）.

圖2 阿昔洛韋衍生物的合成Fig.2 Synthesisof acyclovir derivatives

根據(jù)圖2所示的合成路線，本文考察了7種不同天然和非天然氨基酸以及一種二肽底物與阿昔洛韋酰胺化的反應(yīng)效果，合成了8種不同的氨基酸及二肽取代的阿昔洛韋衍生物.

1.3 分子對接

1.3.1 配體的準(zhǔn)備

在Chem3D軟件中畫出配體的結(jié)構(gòu)式，保存為“mol2.”格式文件，在Sybyl軟件中，分別將配體分子采用Minimize程序進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，設(shè)Max Iterations值為10000，加上Tripos力場以及Gasteiger-Huckel電荷，完成這一系列操作后，再次保存為“mol2.”格式.建立配體文件數(shù)據(jù)庫，將處理的配體文件加入到該數(shù)據(jù)庫中.

1.3.2 受體來源及處理

從PDB數(shù)據(jù)庫中下載CDK2（PDB ID：2A4L）的晶體結(jié)構(gòu)，保存為“pdb.”格式，在Sybyl軟件中，對該靶蛋白用Application中的Docking程序進(jìn)行處理，刪除所含的水分子后，依次進(jìn)行加氫、加電荷、提取復(fù)合物晶體中的配體小分子的操作，將處理后的蛋白保存.

1.3.3 受體-配體對接

以阿昔洛韋和八個(gè)阿昔洛韋衍生物為配體，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK2（PDB ID：2A4L）為受體，在Sybyl軟件中，運(yùn)用Surflex-Docking程序進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果以打分函數(shù)（Total Score）給出.對接的二維結(jié)構(gòu)采用Discovrey Studio進(jìn)行分析.

以上計(jì)算步驟，各項(xiàng)參數(shù)沒有特別說明，均以默認(rèn)值進(jìn)行.

分子對接的結(jié)果以打分函數(shù)（Total Score）表示.在Sybyl軟件中，Total Score≥7.5時(shí)則具有參考價(jià)值［12-13］，這一數(shù)值用于評價(jià)配體與受體蛋白的結(jié)合強(qiáng)弱，可以很直觀地反應(yīng)化合物與受體結(jié)合的親和力強(qiáng)弱，分值越高，親和力越強(qiáng)，對接復(fù)合物越穩(wěn)定，結(jié)合作用越好［14-15］.

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)化合物的合成

如表1所示，不同的氨基酸底物都能以良好的收率獲得目標(biāo)化合物.在標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件下，以5種直鏈氨基酸N-Cbz-甘氨酸2a，N-Cbz-L-蛋氨酸2b、NCbz-L-纈氨酸2c、N-Cbz-L-異亮氨酸2d和N-Cbz-O-芐基-L-蘇氨酸2e為底物時(shí)，目標(biāo)化合物3a～3e的收率在75%～82%之間.以脯氨酸與哌啶甲酸修飾的阿昔洛韋衍生物3f與3g的收率分別為85%和84%.當(dāng)以N-Cbz-甘氨酰-L-脯氨酸為原料時(shí)，二肽取代的阿昔洛韋衍生物的收率也能達(dá)到69%.所合成的8個(gè)阿昔洛韋衍生物中僅化合物3c為已知化合物，其他7個(gè)化合物還未見文獻(xiàn)報(bào)道.

表1 氨基酸與二肽底物的擴(kuò)充Tab.1 Substratescope of aminoacidsand dipeptide

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)表征

2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl） methoxy） ethyl（ （benzyloxy） carbonyl） glycinate（3a）：1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.72（s，1H），7.82（s，1H），7.68（t，J=6.6 Hz，1H），7.37-7.29（m，5H），6.53（s，2H），5.35（s，2H），5.02（s，2H），4.15-4.11（m，2H），3.73（d，J=6.2 Hz，2H），3.68-3.64（m，2H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ171.3，157.9，157.6，154.9，152.4，138.7，137.7，129.2，128.7，128.5，117.1，72.3，66.8，66.1，63.9，42.3.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C18H21N6O6417.1523，F(xiàn)ound 417.1516；IR（KBr）v（cm-1）：3641，2955，1728，1631，1431，1214.

2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl） methoxy） ethyl （（benzyloxy） carbonyl） -Lmethioninate（3b） ：［α］25D-43.1（c0.50，CH3OH）；1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.68（s，1H），7.81（s，1H），7.75（d，J=7.8 Hz，1H），7.38–7.29（m，5H），6.52（s，2H），5.34（s，2H），5.02（s，2H），4.25-4.08（m，3H），3.68-3.64（m，1H），2.48-2.40（m，1H），1.98（s，3H），1.87-1.76（m，2H），1.34（s，2H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ 173.2，157.8，157.1，154.8，152.3，138.5，137.6，129.1，128.6，128.5，117.1，72.1，66.8，65.9，63.8，52.8，34.5，30.5，30.1，29.6，14.4.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C21H27N6O6S 491.1713，F(xiàn)ound 491.1704；IR（KBr）v（cm-1）：3419，3323，1689，1626，1604，1530.

2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl） methoxy） ethyl （（benzyloxy） carbonyl） -L-valinate（3c） ：［α］25D-23.4（c0.46，CH3OH）；1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.72（s，1H）7.81（s，1H），7.67（d，J=8.2 Hz，1H），7.38-7.33（m，5H），6.56（s，2H），5.34（s，2H），5.03（s，2H），4.25-4.20（m，1H），4.14-4.08（m，1H），3.89（t，J=7.1 Hz，1H），3.69-3.62（m，2H），1.99-1.92（m，1H），0.83（d，J=6.8 Hz，3H），0.81（d，J=6.8 Hz，3H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ172.6，157.6，157.1，154.7，152.2，138.3，137.5，129.0，128.5，128.4，117.0，72.0，66.7，65.8，63.3，59.8，29.6，18.7，18.0.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C21H27N6O6459.1992，F(xiàn)ound 459.1983；IR（KBr）v（cm-1）：3325，3193，1725，1698，1630，1608，1541.

2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl）methoxy）ethy（l（benzyloxy） carbonyl） -L-isoleucinate（3d） ：［α］25D-7.3（c0.50，CH3OH）；1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.63（s，1H），7.80（s，1H），7.68（d，J=8.1 Hz，1H），7.38-7.32（m，5H），6.51（s，2H），5.33（s，2H），5.01（s，2H），4.24-4.07（m，2H），3.93（dd，J=7.9 and 7.9 Hz，1H），3.68-3.61（m，2H），1.73-1.66（m，1H），1.38-1.28（m，1H），1.18-1.10（m，1H），0.78-0.74（m，6H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ172.6，157.6，157.0，154.7，152.1，138.3，137.5，129.0，128.5，128.4，117.0，72.0，66.8，65.8，63.3，58.7，36.1，24.8，15.2，11.0.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C22H29N6O6472.2070，F(xiàn)ound 472.2142；IR（KBr）v（cm-1）：1725，1630，1541，1388，1103，1045.

2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl）methoxy） ethylO-benzyl-N（-（benzyloxy） carbonyl）-L-threoninate（3e）：［α］25D+22.2（c0.14，CH3OH）；1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.68（s，1H），7.78（s，1H），7.53（d，J=8.8 Hz，1H），7.36-7.21（m，10H），6.51（s，2H），5.31（s，2H），5.04（s，2H），4.46（d，J=11.9 Hz，1H），4.29（d，J=11.9 Hz，1H），4.19（dd，J=8.8 and 3.9 Hz，1H），4.17-4.02（m，2H），3.92-3.86（m，1H），3.69-3.63（m，2H），1.11（d，J=6.3 Hz，3H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ171.4，157.8，157.6，154.8，152.3，139.1，138.6，137.7，129.1，128.9，128.6，128.3，128.2，128.1，117.1，74.3，72.2，70.4，66.7，66.0，64.0，59.1，15.9.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C27H31N6O7551.2254，F(xiàn)ound 551.2246；IR（KBr）v（cm-1）：1716，1644，1530，1212，1092.

2-（2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl）methoxy） ethyl） 1-benzyl（ S） -pyrrolidine-1，2-dicarboxylate（3f）：［α］25D-41.1（c0.50，CH3OH）；1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.67（s，1H），7.80（d，J=17.6 Hz，1H），7.40-7.20（m，5H），6.51（s，2H），5.35-5.28（m，2H），5.09-4.92（m，2H），4.28-4.00（m，3H），3.68-3.63（m，2H），3.40-3.33（m，2H），2.20-2.08（m，1H），1.84-1.68（m，3H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ173.4，173.1，157.8，154.9，154.8，154.4，152.3，138.6，138.5，137.6，137.5，129.2，129.0，128.6，128.5，128.2，127.9，117.1，72.2，72.1，66.8，66.7，66.4，66.4，63.6，59.1，58.6，47.0，46.4，30.4，29.4，23.9，23.0.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C21H25N6O6457.1836，F(xiàn)ound 457.1828；IR（KBr）v（cm-1）：1697，1631，1541，1419，1389，1181，1105.

2-（2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl）methoxy） ethyl） 1-benzyl（S） -piperidine-1，2-dicarboxylate（3g）：［α］25D-23.7（c0.51，CH3OH）；1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.70（s，1H），7.79（d，J=13.1 Hz，1H），7.39-7.28（m，5H），6.51（s，2H），5.32（d，J=11.7 Hz，2H），5.10-5.03（m，2H），4.75-4.68（m，1H），4.22-4.14（m，2H），3.84（d，J=12.9 Hz，2H），2.92-2.69（m，1H），1.96（t，J=13.9 Hz，1H），1.57-1.48（m，3H），1.36-1.20（m，2H），1.04-0.92（m，1H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ172.2，172.1，157.9，156.7，156.2，154.8，152.4，138.6，137.6，137.5，129.3，129.2，128.7，128.6，128.2，128.1，128.0，117.1，72.2，67.0，66.8，66.7，63.9，54.5，54.3，41.7，41.6，26.4，24.2，24.1，19.9，19.8.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C22H27N6O6471.1992，F(xiàn)ound 471.1985；IR（KBr）v（cm-1）：1697，1630，1389，1257，1165，1104.

2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl）methoxy） ethyl（ （benzyloxy） carbonyl）glycyl-Lprolinate（3h）：［α］25D-22.8（c0.55，CH3OH）；1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.69（s，1H），7.84-7.80（m，1H），7.40-7.26（m，5H），6.56（s，2H），5.38-5.31（m，2H），5.05-4.98（m，2H），4.26（dd，J=8.8 and 3.8 Hz，1H），4.20-4.02（m，2H），3.92-3.72（m，2H），3.70-3.60（m，2H），3.54-3.42（m，2H），3.16（d，J=5.2 Hz，1H），2.20-2.00（m，1H），2.00-1.75（m，2H），1.75-1.65（m，1H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ172.7，172.6，168.4，168.2，157.6，157.2，154.7，154.6，152.1，138.4，137.7，128.9，128.4，128.3，127.7，117.0，72.3，72.1，71.9，70.6，66.6，65.6，63.8，63.4，60.1，58.6，57.9，48.7，46.4，45.5，42.6，42.5，30.8，28.5，24.3，21.6.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C23H28N7O7514.2050，F(xiàn)ound 514.2044；IR（KBr）v（cm-1）：3565，3502，3446，1651，1645，503，461，446，409.

2.3 數(shù)據(jù)分析及處理

阿昔洛韋及其酯化衍生物3a～3h與CDK2（PDB ID：2A4L）的對接打分結(jié)果如表2所示.其中，化合物3a、3b、3d的對接打分結(jié)果較好，且化合物3a、3b、3d的結(jié)構(gòu)與阿昔洛韋均有很好的疊合效果.在Discovery Studio軟件中，用Receptor下的Ligand Interactions程序?qū)Ψ肿訉咏Y(jié)果進(jìn)行分析，通過Shoe 2DDiagram模塊分別展示打分結(jié)果大于9的化合物3a、3b和3d對接結(jié)果的二維結(jié)構(gòu).阿昔洛韋與CDK2的對接結(jié)果顯示，阿昔洛韋與氨基酸殘基ASP145和LEU83形成氫鍵，與PHE80形成π-π鍵.相比阿昔洛韋，所合成的目標(biāo)化合物3a（圖3）、3b（圖4）和3d（圖5）與CDK2對接可與氨基酸殘基形成更多的氫鍵.由于羥基位置被取代，配體3a、3b和3d不與氨基酸殘基LEU83形成氫鍵作用，卻仍然保留與ASP145的氫鍵，除此之外，3a、3b和3d均與氨基酸殘基LYS89、ASP86形成氫鍵，與氨基酸殘基PHE80形成π-π鍵.

圖3 3a（紅色結(jié)構(gòu)）和阿昔洛韋（綠色結(jié)構(gòu)）與CDK2的對接結(jié)果圖Fig.3 Molecular docking mode between 3a（red structure）and ACV（green structure）with CDK2（PDB ID：2A4L）

圖4 3b（橘色結(jié)構(gòu)）和阿昔洛韋（綠色結(jié)構(gòu)）與CDK2的對接結(jié)果圖Fig.4 Molecular dockingmodebetween 3b（orangestructure）and ACV（green structure）with CDK2（PDBID：2A4L）

圖5 3d（紫色結(jié)構(gòu)）和阿昔洛韋（綠色結(jié)構(gòu)）與CDK2的對接結(jié)果圖Fig.5 Molecular docking mode between 3d（purple structure）and ACV（green structure）with CDK2（PDBID：2A4L）

表2 ACV和3a～3h與CDK2（PDBID：2A4L）的對接打分結(jié)果Tab.2 Dockingand scoringresultsof ACV and 3a～3h with CDK2（PDBID：2A4L）

進(jìn)一步以脫Cbz保護(hù)基的阿昔洛韋衍生物為配體與CDK2進(jìn)行對接，對接的打分結(jié)果如表3所示.化合物3b′～3g′的對接打分分值較高，與ACV有較好的重疊效果.除3a外，化合物3b～3h脫保護(hù)基團(tuán)后的打分分?jǐn)?shù)均有增加，且3b′、3d′、3e′的分值較好.取3b′、3d′、3e′作進(jìn)一步分析.如圖6所示，配體3b′、3d′、3e′均與受體蛋白的Asp145、Glu81、Leu83、Lys33和Thr14氨基酸殘基產(chǎn)生氫鍵相互作用.同時(shí)，這些配體還與Leu134產(chǎn)生π-σ鍵.相比前者，脫去保護(hù)基團(tuán)的配體在對接時(shí)能與周圍的氨基酸殘基產(chǎn)生更多的氫鍵，對接效果更好，對接結(jié)果為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾提供了方向.

表3 3a′-3h′與CDK2（PDBID：2A4L）的對接打分結(jié)果Tab.3 Dockingand scoringresultsof 3a′～3h′with CDK2（PDBID：2A4L）

圖6 3b′、3d′、3e′與CDK2（PDBID：2A4L）的對接結(jié)果圖Fig.6 Molecular dockingmodebetween 3b′、3d′、3e′with CDK2（PDBID：2A4L）

3 結(jié)語

以抗病毒藥阿昔洛韋為原料，與不同的氨基酸和二肽通過酰胺縮合反應(yīng)合成了8個(gè)阿昔洛韋衍生物，包含7個(gè)還未見報(bào)道的化合物.所合成的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)通過核磁共振氫譜、碳譜、紅外光譜、高分辨質(zhì)譜進(jìn)行表征確認(rèn).利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)分子模擬對接法研究阿昔洛韋衍生物與CDK2蛋白激酶的結(jié)合情況，結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的阿昔洛韋衍生物與靶蛋白的對接結(jié)果均優(yōu)于阿昔洛韋，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾和生物活性研究提供了一定參考.