陳曉麗，孔祥圖，于慧，姜鵬君，劉寧，倪海雯

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）約占非霍奇金淋巴瘤（NHL）的30%～35%［1］，以R-CHOP（利妥昔單抗聯(lián)合環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿及潑尼松）為基礎(chǔ)的一線治療方案極大地改善了該病的治療現(xiàn)狀，但是依然有約1∕3的病人面臨耐藥或復(fù)發(fā)［2］，對(duì)于RCHOP+X方案的探索是目前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)［3］。針對(duì)療效、安全性、生活質(zhì)量、治療花費(fèi)的綜合考慮是優(yōu)化治療方案探索的重點(diǎn)，治療后感染事件、并發(fā)癥均是真實(shí)世界中DLBCL治療管理的難題，也帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)［4］。中西整合治療淋巴瘤是發(fā)揮中醫(yī)藥解決疑難疾病的重要舉措，本團(tuán)隊(duì)繼承及發(fā)展國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授癌毒病機(jī)理論，結(jié)合本中心淋巴瘤診療實(shí)踐創(chuàng)立消癌解毒方。在前期研究中，我們觀察到消癌解毒方聯(lián)合R-CHOP方案治療初診DLBCL，相比單純R-CHOP方案化療組，有助于改善中醫(yī)證候，減少并發(fā)癥、提高病人生活質(zhì)量［5］。具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入探索。有研究顯示，以周仲瑛教授“癌毒”理論為指導(dǎo)的消癌解毒方與化學(xué)治療藥物聯(lián)合使用時(shí)，能調(diào)節(jié)病人的免疫功能［6］。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞，有維持機(jī)體免疫自穩(wěn)的功能，對(duì)調(diào)控免疫應(yīng)答方面也發(fā)揮著重要作用［7］。Treg對(duì)包括淋巴瘤在內(nèi)的腫瘤生存預(yù)后的影響以及抗腫瘤免疫方面的作用，已成為腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)［8］。淋巴瘤是一組異質(zhì)性極強(qiáng)的腫瘤，同一病理亞型的淋巴瘤病人預(yù)后和療效也不盡相同，目前，針對(duì)初診DLBCL Treg的研究較少。本研究以初診DLBCL病人為研究對(duì)象，對(duì)比消癌解毒方聯(lián)合R-CDOP（利妥昔單抗聯(lián)合環(huán)磷酰胺、脂質(zhì)體多柔比星、長(zhǎng)春新堿及潑尼松）方案與單純R-CDOP方案治療的臨床療效，及外周血Treg百分比的變化，探索Treg在初診DLBCL病人發(fā)病中的意義以及消癌解毒方對(duì)于Treg表達(dá)的影響，揭示癌毒理論指導(dǎo)下的消癌解毒方對(duì)于淋巴瘤免疫調(diào)控的可能影響，為進(jìn)一步形成中西結(jié)合臨床新方案提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2018年1月至2022年1月收治的初診DLBCL病人共47例為研究對(duì)象，男26例，女21例，中位年齡61歲，年齡范圍21～83歲。中醫(yī)基本病機(jī)屬正虛痰毒，瘀熱互結(jié)。47例病人經(jīng)病理組織活檢證實(shí)為DLBCL（非特指型），符合2016年修訂第4版WHO淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)［9］，且均未合并嚴(yán)重心腦血管、肝、腎、內(nèi)分泌等其他系統(tǒng)性疾病。47例病人用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為治療組（消癌解毒方聯(lián)合R-CDOP方案）24例和對(duì)照組（單純R-CDOP方案）23例。治療組中男14例，女10例，中位年齡59歲，年齡范圍25～83歲。對(duì)照組中男12例，女11例，中位年齡63歲，年齡范圍21～83歲。兩組病人一般資料進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組間具有可比性。見表1。本項(xiàng)研究中47例病人均已簽署知情同意書，研究?jī)?nèi)容已經(jīng)通過了南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批號(hào)2017NL-132-02）。按隨機(jī)數(shù)字表法選取健康對(duì)照組45例，男21例，女24例，中位年齡40歲，年齡范圍12～80歲，均來自門診健康體檢者。

表1 初診彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤47例一般資料比較∕例

1.2 治療方案所有病人給予6個(gè)療程的R-CDOP方案化療，6個(gè)療程后獲得完全緩解的病人，繼續(xù)予2個(gè)療程利妥昔單抗追加治療。R-CDOP方案具體為：利妥昔單抗劑量為375 mg∕m2，第0天；環(huán)磷酰胺750 mg∕m2，第1天；脂質(zhì)體多柔比星25 mg∕m2，第1天；長(zhǎng)春地辛4 mg，第1天；潑尼松60 mg∕m2換算成等量地塞米松第1～5天。治療可以根據(jù)病人年齡和體能評(píng)分進(jìn)行調(diào)整。年齡大于80歲或體能狀態(tài)較差的病人，允許采用R-miniCDOP。所有病人均在每21天進(jìn)行1次化療，化療過程中均使用5-羥色胺3（5-HT3）受體拮抗劑托烷司瓊預(yù)防化療所致的惡心、嘔吐，提高病人化療的耐受性。治療組的6周期化療期間及化療間歇期均口服消癌解毒方。消癌解毒方組成：炙鱉甲15 g、土鱉蟲10 g、三棱10 g、莪術(shù)10 g、制南星10 g、浙貝母10 g、澤漆10 g、僵蠶10 g、北沙參10 g、天冬10 g、麥冬10 g、太子參15 g、拔契10 g、蛇舌草15 g、半枝蓮10 g。每日一劑。煎煮方法：加入500 mL水浸泡1 h，濃煎取藥汁150 mL，每次75 mL，每日兩次，飯后1 h溫服。

1.3 主要試劑及儀器本研究中使用的鼠抗人單克隆抗體CD4-FITC（批號(hào)51）、CD25-PC5（批號(hào)200068）、CD127-PE（批號(hào)200070），紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)34）以及流式細(xì)胞儀（NAVIOS）購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.4 外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例檢測(cè)在第1周期治療前約1周內(nèi)，及6個(gè)周期治療結(jié)束約1月后復(fù)診時(shí)，消癌解毒方聯(lián)合R-CDOP方案的治療組、單純R-CDOP方案的對(duì)照組，以及健康對(duì)照組，均在各組被觀察對(duì)象清晨空腹時(shí)，采取靜脈血2 mL，以乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-2K）抗凝，采用直接免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。本研究中，免疫表型為CD4+CD25+CD127low的細(xì)胞亞群被界定為Treg，并以CD4+CD25+CD12 7low細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比來表示Treg水平。操作步驟：各取鼠抗人單克隆抗體CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE 20 μL，加入到100 μL EDTA-2K抗凝的外周血中，在室溫下避光孵育15 min后，再加入紅細(xì)胞裂解液500 μL，繼續(xù)避光孵育10 min后，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，離心后棄上清，加入適量的PBS上機(jī)檢測(cè)。

1.5 臨床療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)6個(gè)周期治療結(jié)束后，47例病人均行CT或正電子發(fā)射斷層顯像／計(jì)算機(jī)斷層顯像（PET∕CT）掃描檢查進(jìn)行療效評(píng)估，參照2014版Lugano療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中CT評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［10］，分為完全緩解（CR）：靶病灶（淋巴結(jié)）長(zhǎng)徑≤1.5 cm，無淋巴結(jié)外病灶，增大的器官退至正常，無新發(fā)病灶；部分緩解（PR）：最多6個(gè)可測(cè)量靶病灶最大垂直直徑乘積之和（SPD）縮小率≥50%，無新發(fā)病灶；疾病穩(wěn)定（SD）：最多6個(gè)靶病灶SPD增大率＜50%，無疾病進(jìn)展（PD）證據(jù)；PD：至少1個(gè)病灶進(jìn)展即可診斷，新發(fā)病灶或原有非可測(cè)病灶明確進(jìn)展，新發(fā)或復(fù)發(fā)骨髓受累?？偩徑饴剩∣RR）定義為（CR+PR）率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用Kolmogorov-Smirnov test進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，本研究計(jì)量數(shù)據(jù)因不符合正態(tài)分布，采用M（P25，P75）的方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，以非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行各組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)推斷。各組治療前和同組治療前后差別的比較，均采用Mann-Whitney-U檢驗(yàn)。采用Pearsonχ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩組療效分布的比較。以例數(shù)對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間使用χ2檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 初診DLBCL病人外周血Treg百分比水平治療前，治療組及對(duì)照組兩組病人和健康對(duì)照的Treg百分比中位數(shù)（下、上四分位數(shù)）分別為6.01%（4.59%，7.82%）、5.73%（4.82%，6.58%）、7.32%（6.03%，8.71%），治療組和對(duì)照組病人治療前外周血百分比均低于健康人（Z=2.64、3.42，P＜0.05）。

2.2 DLBCL病人治療前后外周血Treg百分比的比較治療前，治療組和對(duì)照組初診DLBCL病人的外周血Treg細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療6周期結(jié)束后，治療組外周血Treg百分比較治療前明顯上升（P＜0.05），對(duì)照組治療前后Treg百分比變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），治療組比對(duì)照組的Treg百分比明顯上升（P＜0.05）。見表2。

表2 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤47例外周血Treg百分比的變化比較∕［%，M（P25，P75）］

2.3 兩組DLBCL病人臨床療效比較治療組可評(píng)價(jià)病人24例（CR16例、PR3例、SD0例、PD5例），ORR為79.17%；對(duì)照組可評(píng)價(jià)病人23例（CR13例、PR3例、SD2例、PD5例），ORR為69.56%。兩組病人療效比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.57，P=0.450）。

3 討論

DLBCL是最常見的侵襲性NHL，R-CHOP方案作為一線治療歷經(jīng)20年依然是初診DLBCL病人的治療基石。對(duì)于R-CHOP方案耐藥和治療后復(fù)發(fā)的病人治療選擇有限，優(yōu)化目前治療方案的探索依然是淋巴瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和挑戰(zhàn)［11］。疾病相關(guān)、靶向藥物治療相關(guān)的免疫缺陷，抗腫瘤免疫的失衡在淋巴瘤的臨床及基礎(chǔ)研究中受到學(xué)者們的關(guān)注［12］，開發(fā)針對(duì)免疫調(diào)控環(huán)節(jié)的有效藥物具有非常重要的實(shí)踐意義。眾多的具有補(bǔ)氣、化痰、解毒功效的天然藥物擁有抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫的雙重作用［13］。課題組長(zhǎng)期致力于探索國(guó)醫(yī)大師經(jīng)驗(yàn)方的開發(fā)應(yīng)用，開展中西整合優(yōu)化方案的臨床和機(jī)制研究，尋找中藥療效評(píng)價(jià)新靶標(biāo)。

相比于實(shí)體瘤來說，DLBCL免疫微環(huán)境調(diào)控存在更加復(fù)雜的機(jī)制，Treg是近年來抗腫瘤免疫研究的熱點(diǎn)之一。Treg是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞群，通過免疫抑制，來維持免疫系統(tǒng)對(duì)自身成分的耐受，從而發(fā)揮保持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的作用。大多數(shù)的腫瘤免疫研究認(rèn)為，Treg通過抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，在腫瘤免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。叉頭框蛋白P3（FoxP3）是Treg發(fā)揮抑制作用的主要調(diào)節(jié)因子，CD4+CD25+Foxp3+是Treg較為普遍應(yīng)用的分子標(biāo)記，但因Foxp3在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在Treg的功能研究中應(yīng)用受限，多個(gè)研究表明，細(xì)胞表面蛋白分子IL-7受體（CD127）和Foxp3表達(dá)呈現(xiàn)密切的負(fù)相關(guān)，CD4+CD25+CD127low與CD4+CD25+Foxp3+表達(dá)高度一致，外周血CD4+CD25+CD127low可以作為Treg的分子標(biāo)記［14］。因此，本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+CD127lowTreg在外周血的百分比，探索Treg在初診DLBCL中的變化，揭示其在DLBCL免疫調(diào)控中的意義。

本研究中我們檢測(cè)了47例初診的DLBCL病人和45名健康人的外周血Treg百分比，發(fā)現(xiàn)初診DLBCL病人治療前的外周血Treg百分比低于健康人，該觀察結(jié)果與已報(bào)道的多種實(shí)體腫瘤病人外周血或組織中Treg表達(dá)水平偏高的情況不一致。目前在肺癌［15］、卵巢癌［16］、肝癌［17］等實(shí)體腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，病人的外周血或腫瘤組織中Treg比例較正常人增高，且高水平的外周血或腫瘤組織中Treg往往提示疾病預(yù)后不良［18］。

Treg對(duì)淋巴瘤病人生存預(yù)后的影響及其機(jī)制，目前有不同于實(shí)體瘤的研究報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)Treg在淋巴系統(tǒng)腫瘤的免疫調(diào)控作用與實(shí)體瘤相比，體內(nèi)Treg增多促進(jìn)非血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)生，相反，Treg減少促進(jìn)淋巴瘤發(fā)生［19］。Dehghani等［20］研究發(fā)現(xiàn)Treg對(duì)腫瘤性B淋巴細(xì)胞的增殖具有抑制作用，外周血中更高比例的Treg以及Treg∕Th17（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞∕輔助性T細(xì)胞17）比例與淋巴瘤的預(yù)后良好具有相關(guān)性，并與更好的治療反應(yīng)以及較低的復(fù)發(fā)率有關(guān)。惰性淋巴瘤中的濾泡性淋巴瘤向DLBCL的轉(zhuǎn)化，也與腫瘤微環(huán)境中Treg數(shù)量的顯著減少有關(guān)［21］。在DLBCL病人中，疾病惡性程度高的常見外周血Treg絕對(duì)數(shù)減低，且可作為獨(dú)立于國(guó)際預(yù)后指數(shù)危險(xiǎn)度分層的不良預(yù)后因素［22］。DLBCL病人外周血或腫瘤組織中Treg的增多或浸潤(rùn)，與預(yù)后良好相關(guān)［20，23］。產(chǎn)生這些現(xiàn)象的機(jī)制可能為Treg通過穿孔素∕顆粒酶調(diào)節(jié)惡性B細(xì)胞或Fas-FasL相互作用［24］，也可能是通過間接抑制B細(xì)胞成熟所必需的Th細(xì)胞來間接抑制B細(xì)胞［25］。

淋巴瘤為現(xiàn)代病名，目前中醫(yī)藥研究缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，“癌毒”理論是國(guó)醫(yī)大師周仲瑛結(jié)合了近60年的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成的，在臨床實(shí)踐中成為指導(dǎo)腫瘤治療的權(quán)威理論，并得到不斷豐富和發(fā)展。程海波教授團(tuán)隊(duì)發(fā)展了癌毒病機(jī)學(xué)說，創(chuàng)立了以國(guó)醫(yī)大師經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上的腫瘤辨治體系指南，以“消癌解毒”貫穿始終的癌毒病機(jī)理論突出了“癌毒”的特征，針對(duì)各科腫瘤的不同特點(diǎn)以法統(tǒng)方，組成消癌解毒類核心方［26］，并開展臨床和基礎(chǔ)的深入研究，揭示癌毒病機(jī)的本質(zhì)及在臨床研究中的意義和價(jià)值［27］。課題組在癌毒病機(jī)理論指導(dǎo)下結(jié)合臨床實(shí)踐，以病機(jī)要素“痰、熱、瘀、毒、虛”為核心，組成消癌解毒方，其中，僵蠶、土鱉蟲、鱉甲化痰搜剔；制南星、浙貝母化痰解毒；白花蛇舌草、半枝蓮清熱解毒。三棱、莪術(shù)活血化瘀。癌毒傷正，以氣虛、陰虛為多見，故以太子參、北沙參、麥冬氣陰雙補(bǔ)。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，消癌解毒方聯(lián)合化療組與對(duì)照組相比可以提高DLBCL病人外周血Treg百分比。揭示了消癌解毒方有可能通過調(diào)控Treg恢復(fù)免疫微環(huán)境的失衡、從而對(duì)于DLBCL的抗腫瘤免疫發(fā)揮積極影響。癌毒病機(jī)指導(dǎo)下的消癌解毒方聯(lián)合化療，具有調(diào)控腫瘤病人免疫功能的作用［28］，既往研究報(bào)道均以實(shí)體瘤較多，淋巴瘤方面鮮有報(bào)道。淋巴瘤異質(zhì)性較強(qiáng)，化療方案較難統(tǒng)一，但是初診DLBCL目前標(biāo)準(zhǔn)一線方案仍以R-CHOP方案為主。相比于傳統(tǒng)多柔比星，脂質(zhì)體多柔比星可提高對(duì)腫瘤組織的靶向殺傷作用，減弱對(duì)心臟的不良反應(yīng)［29］。因此，本研究以初診DLBCL的病人作為研究對(duì)象，開展對(duì)照研究，采用一線R-CDOP方案聯(lián)合或不聯(lián)合消癌解毒方治療，觀察消癌解毒方對(duì)于Treg的影響。結(jié)果提示初診DLBCL病人外周血Treg百分比低于健康對(duì)照，兩組病人6個(gè)療程治療結(jié)束后，治療組比對(duì)照組病人的外周血Treg百分比明顯上升（P＜0.05）。本研究結(jié)果與近年來Treg在淋巴瘤腫瘤免疫調(diào)控的意義具有一致性。本研究中客觀療效比較，治療組總緩解率高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與本研究中病例數(shù)偏少、初診DLBCL臨床療效的影響因素比較復(fù)雜，受疾病分期、分子學(xué)異質(zhì)性等影響有關(guān)。另外，本研究觀察時(shí)間尚短，消癌解毒方調(diào)控Treg發(fā)揮抗腫瘤免疫的影響尚不足以轉(zhuǎn)化為臨床客觀療效的獲益。外周血Treg百分比減低是否可以用于判斷DLBCL病人預(yù)后，能否成為獨(dú)立于危險(xiǎn)度分層的不良預(yù)后因素，后續(xù)須擴(kuò)大樣本量細(xì)化亞組分析并結(jié)合包括臨床及代謝組學(xué)等多指標(biāo)參數(shù)進(jìn)一步在全程隨訪管理中觀察總結(jié)、綜合評(píng)估。

總之，本研究通過隨機(jī)對(duì)照研究，探索了課題組臨床經(jīng)驗(yàn)方消癌解毒方對(duì)于初診DLBCL病人外周血Treg百分比的影響、部分闡述了消癌解毒方發(fā)揮增效解毒的可能原因。目前中藥復(fù)方臨床應(yīng)用的隨機(jī)對(duì)照研究是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的方向和難點(diǎn)?；趪?guó)醫(yī)大師理論的中醫(yī)臨床實(shí)踐指南，開展疑難疾病中西整合優(yōu)化方案探索，結(jié)合客觀指標(biāo)闡釋作用機(jī)制，開發(fā)有效方劑符合國(guó)家中醫(yī)藥發(fā)展的戰(zhàn)略方向。Treg在淋巴瘤領(lǐng)域的相關(guān)研究揭示了其與腫瘤細(xì)胞、免疫微環(huán)境、分子靶向藥應(yīng)用均存在復(fù)雜的相互影響［30］，在分子靶向藥治療的時(shí)代，積極探索中醫(yī)藥調(diào)控Treg發(fā)揮抗腫瘤免疫的作用，同時(shí)關(guān)注中藥與分子靶向藥的相互作用，可形成中西結(jié)合治療DLBCL的有效臨床新方案。