張明光，齊曉光，徐海軍

惡性胸膜間皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）是惡性程度較高的惡性腫瘤之一，多數(shù)情況下確診時已是晚期［1］，其主要的手段是內(nèi)科姑息性化療，目前一線化療的中位生存期約為12個月，尚無標準的二線治療方案［2］。探索新的治療策略是MPM研究的熱點問題之一。

最近研究顯示，針對程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）和細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4（recombinant cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4）通路的免疫檢查點抑制劑在MPM中顯示出較好的抗腫瘤活性［3-6］，但是這種顯著的免疫治療反應(yīng)僅表現(xiàn)在少數(shù)MPM患者中，而從整體的MPM免疫治療效果來看，總體的免疫治療反應(yīng)還是偏低一些［7］，如何更好地實現(xiàn)精準化的免疫治療，需要進一步探索并闡明MPM中促使免疫治療反應(yīng)的機制。2018年7月至2020年7月，本研究基于此出發(fā)點，探索MPM中，免疫治療反應(yīng)組與免疫治療無反應(yīng)組之間表達譜的差異及其參與的生物學機制的不同，闡明免疫治療中起關(guān)鍵作用的分子及其相關(guān)調(diào)控通路，而這對于更好地實現(xiàn)MPM的精準的免疫治療具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)獲取及處理檢索GEO數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞“惡性胸膜間皮瘤”“免疫治療”“PD-1單抗”等，篩選其中以高通量測序為技術(shù)平臺研究，只有GSE117358納入研究，該研究中共24個惡性間皮瘤標本，標本品系為BALB∕c小鼠，鼠齡范圍8～9周，性別均為雌性，治療藥物：抗程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）單抗及抗CTAL-4單抗；具體處理方案：小鼠皮下移植瘤第7天或第10天，當腫瘤約9 mm2時，腹膜內(nèi)接受100 μg抗CTLA4和100 μg抗PD-L1的劑量，并加100 μL磷酸緩沖鹽溶液。第2天和第4天，小鼠接受額外劑量的100 μg抗PD-L1；按照是否對PD-L1聯(lián)合CTAL-4單抗是否有效分為兩組，免疫治療反應(yīng)組和免疫治療無反應(yīng)組，其中每組各12個樣本。

療效評估判定標準：當小鼠的腫瘤完全消退并且在治療后至少4周保持無腫瘤時，將其指定為應(yīng)答者。如果治療開始后4周內(nèi)增長到100 mm2，則被指定為無反應(yīng)者。腫瘤生長延遲或部分消退的小鼠被指定為中間反應(yīng)者，并從分析中排除。

1.2 差異基因的篩選首先，從高通量基因表達數(shù)據(jù) 庫（gene expression omnibus，GEO）官 網(wǎng) 下 載GSE117358的RNA表達譜矩陣，按照免疫治療有無反應(yīng)進行分組：免疫治療反應(yīng)組（12個樣本）和免疫治療無反應(yīng)組（12個樣本），兩組患者共有39 637個基因，整理分組之后的表達譜矩陣以備研究；其次，應(yīng)用R語言中DEseq2和limma軟件包進行基因表達水平的標準化及顯著性差異分析，設(shè)置差異基因的篩選條件為：差異倍數(shù)的絕對值＞1.5，且P＜0.01認為差異有統(tǒng)計學意義；最后應(yīng)用R語言中g(shù)gplot2軟件包進行繪制火山圖展示差異表達基因情況。

1.3 差異基因GO功能注釋及KEGG富集通路分析所有差異基因納入分析，采用基因功能在線注釋分析David工具進行下一步研究，包括基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集信號通路分析。該部分的分析目的在于進行觀察兩組之間在生物學行為及信號通路之間的差異。最后應(yīng)用R軟件Hmisc、ggplot2軟件包繪制排名前10的GO及KEGG通路氣泡圖。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及Cytoscape軟件分析免疫相關(guān)關(guān)鍵模塊為了進一步分析差異基因表達蛋白之間的相互關(guān)系，采用String在線軟件，分析差異基因表達的蛋白的，蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并下載String網(wǎng)站中的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)TSV結(jié)果文件，從而進行后續(xù)關(guān)鍵模塊及核心基因篩選研究。

為了進一步分析這些將蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中免疫相關(guān)的起重要作用的關(guān)鍵模塊，將下載好的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果導入Cytoscape 3.7.1軟件進行研究，剔除網(wǎng)絡(luò)中的孤立節(jié)點，運用MCODE模塊，進行重要模塊分析。

1.5 關(guān)鍵核心基因的篩選為了進一步分析參加這些模塊中的關(guān)鍵核心基因，運用運用Cytoscape中cytohubba軟件，對這些蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中進行關(guān)鍵核心Hub基因進行篩選。

1.6 TCGA數(shù)據(jù)庫的整合分析考慮前面的機制探索為小鼠樣本，為了進一步在人的胸膜間皮瘤中驗證，采用UALCAN在線數(shù)據(jù)庫（http：∕∕ualcan.path.uab.edu∕index.html），在TCGA數(shù)據(jù)庫中進行整合分析，UALCAN是一個有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站，主要是基于TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進行分析，可以對相關(guān)基因進行表達譜分析，生存分析等。

2 結(jié)果

2.1 兩組之間差異表達基因分析結(jié)果顯示，在免疫治療反應(yīng)組（12個樣本）及免疫治療無反應(yīng)組（12個樣本）中，共篩選出1 025個差異有統(tǒng)計學意義基因，相對于免疫治療無反應(yīng)組，在免疫治療反應(yīng)組中有782個上調(diào)和243個下調(diào)基因?；鹕綀D見圖1。為了更加直觀地展示基因表達差異有統(tǒng)計學意義，按照差異倍數(shù)log FC數(shù)值，對于兩組差異基因表達情況進行排序，排序前20個差異表達基因，見表1。

表1 基于|Log FC|排序的前20個差異表達基因

2.2 差異基因參與GO功能注釋及KEGG富集通路分析GO是基于大數(shù)據(jù)及生物信息學發(fā)展，通過對靶基因進行功能注釋分析，進而揭示其生物學功能，其包括生物學過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）三個部分。對這些差異基因進行GO功能注釋，結(jié)果顯示，這些差異表達基因的功能，在BP方面，主要參與了免疫系統(tǒng)激活、炎癥反應(yīng)以及正向調(diào)控T細胞的分化和增殖等方面；在CC方面，主要包括細胞質(zhì)膜外側(cè)面、膜型結(jié)構(gòu)、膜的整體成分、等離子體膜以及原生質(zhì)膜的組成部分等；在MF方面，主要參與了碳水化合物結(jié)合、細胞因子活性及信號傳感器活動等方面（見圖2A～2C）。在KEGG富集信號通路方面顯示，這些差異表達基因富集通路主要集中在細胞因子受體通路、細胞黏附通路、T細胞受體通路及NF-kappa B信號通路等方面（見圖2D）。

2.3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵模塊分析構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，在蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，共有節(jié)點數(shù)量為534，連接邊數(shù)為1 997，平均節(jié)點度為7.48，平均局部聚類系數(shù)為0.439，期望邊數(shù)為648，PPI富集P＜1.0×10-16。

為了評估這些蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)中，哪些分子模塊可能在免疫治療反應(yīng)中起到更加重要的作用，采用Cytoscape中MCDOE進行關(guān)鍵模塊篩選，根據(jù)節(jié)點度評分，分別列出節(jié)點度排名前3個模塊，其中節(jié)點度評分分別為25.856、8.632和7.000，見圖3。

2.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵核心基因分析基于EPC算法，計算排名前10的重要的核心基因：Tnf，Il6，Ptprc，Csf2，Cd86，Cxcl9，Sell，Cxcr3，Ccl2，Cd40。見圖4。

2.5 TCGA數(shù)據(jù)庫中關(guān)鍵核心基因整合分析為避免小鼠樣本的局限性，本研究進一步在人的胸膜間皮瘤樣本中進行驗證和整合分析，結(jié)果顯示，雖然在不同的病理類型的胸膜間皮瘤中，各個基因表達水平方面有一定的差異，但是本研究的一個重要結(jié)果顯示，Tnf，Il6，Cd86，Cxcl9，Sell，Cxcr3，Cd40等療效相關(guān)關(guān)鍵分子在肉瘤樣胸膜間皮瘤中呈現(xiàn)高表達，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

MPM是惡性程度較高的腫瘤之一，因缺乏有效的治療藥物，5年生存率較低［8］。近年來隨著免疫治療在腫瘤中的應(yīng)用，免疫治療已經(jīng)在肺癌、黑色素瘤、腸癌等多種腫瘤中顯示了良好的前景［9-12］。目前已有研究表明，針對PD-1和CTLA-4通路的免疫治療，在MPM中顯示出可喜的進步［3-6］；免疫治療在MPM的綜合治療中，正在成為一種很有希望的治療策略。然而，免疫治療在MPM中總體有效率偏低［7］，如何利用GEO數(shù)據(jù)庫中腫瘤基因信息平臺的支撐［13］、更好地提高免疫治療在MPM的精準化治療，是腫瘤個體化診療中迫切需要解答的問題［14］。本研究正是基于此理論基礎(chǔ)和此臨床問題為出發(fā)點，探索了MPM中免疫治療療效預(yù)測標志物，從而更好地實現(xiàn)更加精準化的免疫治療。

結(jié)果提示，相對于免疫治療無反應(yīng)組，免疫治療反應(yīng)組相關(guān)差異分子更多參與了細胞因子受體、T細胞受體等相關(guān)通路，而這些通路已經(jīng)被諸多研究證實在PD-1單抗等免疫治療中起到了至關(guān)重要的促進免疫激活的作用，從而導致更好的免疫治療反應(yīng)。其可能的機制在于T細胞通路的激活，增加了腫瘤微環(huán)境中浸潤性T細胞的數(shù)量，而浸潤性T淋巴細胞的浸潤與良好的免疫治療反應(yīng)呈正相關(guān)［15-17］，這一理論同樣適用于MPM的抗腫瘤免疫反應(yīng)，同時也在一定程度上支持本研究的結(jié)果。

本研究的一個重要發(fā)現(xiàn)在于，除了已經(jīng)被證實的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的分子通路外，我們的結(jié)果還提示，在MPM中核因子κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）信號通路可能也與良好的免疫治療反應(yīng)相關(guān)，其可能的機制在于NF-κB轉(zhuǎn)錄因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，包括促進免疫系統(tǒng)的發(fā)展，先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)等生物學過程［18］，這或許可以在一定程度上解釋，NF-kappa B信號通路在MPM的免疫治療中與良好的免疫治療反應(yīng)有關(guān)的原因。

另外本研究為進一步探索參與免疫治療調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵分析，進行了重要模塊及關(guān)鍵分子分析，對MPM免疫治療參與重要通路及其功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因研究結(jié)果提示，這些關(guān)鍵基因大致分為三類，一類是細胞表面共刺激分子，比如CD86、CD40和PTPRC等；另一類是細胞因子類，比如腫瘤壞死因子（TNF）和白細胞介素6（IL-6）等；其他的還有趨化因子類，比如CXCL9、CXCR3及CCL2等。

關(guān)于細胞表面共刺激分子與腫瘤免疫的研究，多表達于樹突狀細胞、單核細胞、記憶T淋巴細胞、活化B淋巴細胞及活化T淋巴細胞等腫瘤免疫微環(huán)境中，尤其是CD86的發(fā)現(xiàn)，促使了CTAL-4單抗藥物在成功研究，給腫瘤的治療帶來了新的希望。另外，已有多項研究在其他腫瘤中提示，細胞因子在腫瘤的免疫治療中起關(guān)鍵的作用，從而調(diào)節(jié)腫瘤的免疫治療反應(yīng)。Tsukamoto等［19］研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中研究發(fā)現(xiàn)，以促炎細胞因子IL-6為靶點可以增強荷瘤小鼠的腫瘤特異性Th1反應(yīng)和隨后的抗腫瘤作用。IL-6阻斷后上調(diào)了免疫檢查點分子PD-L1在黑色素瘤細胞上的表達，研究提示IL-6在免疫治療中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。Yi等［20］研究發(fā)現(xiàn)，TNF可以調(diào)節(jié)T細胞共刺激分子免疫和促進CD4+和CD8+T細胞的終末分化，也提示TNF基因在抗腫瘤免疫中可能作為一個新的治療策略；我們的研究提示，這些關(guān)鍵基因同樣在MPM的免疫治療中起到了重要的調(diào)節(jié)作用，與前期的在其他腫瘤中的研究結(jié)果相一致。

而本研究中，除了這些已經(jīng)被臨床應(yīng)用中證實的免疫治療相關(guān)的關(guān)鍵基因之外，本研究結(jié)果還提示，某些趨化因子在MPM的免疫治療調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。Tokunaga等［21］研究發(fā)現(xiàn)，CXCL9及CXCR3等可以調(diào)節(jié)免疫細胞的遷移、分化和活化，從而通過旁分泌作用導致腫瘤抑制作用。Pascual-García等［22］亦研究發(fā)現(xiàn)，阻斷CXCL9及CCL2，可以增加腫瘤微環(huán)境中CD8+T細胞浸潤，從而增強抗腫瘤免疫治療。盡管這些還多數(shù)處于臨床前研究，但是仍提示，趨化因子通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫浸潤細胞，從而調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫治療的反應(yīng)，與我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)相一致。對這些趨化因子進行深入研究，有望為抗腫瘤免疫聯(lián)合治療的策略提供新的思路。

另外本研究的一個有趣的發(fā)現(xiàn)在于，這些關(guān)鍵療效預(yù)測分子在不同病理類型的MPM中的表達譜是有差異的，在肉瘤樣亞型的MPM中，Tnf，Il6，Cd86，Cxcl9，Sell，Cxcr3，Cd40等療效預(yù)測關(guān)鍵分子呈相對高的表達，提示這一類的肉瘤樣的MPM更可能從免疫治療中獲益，但是限于目前為TCGA中表達譜的研究，有待臨床進一步研究證實。

本研究也有一定的局限性，是以小鼠為研究載體，探索免疫療效相關(guān)標志物；但是檢索GEO數(shù)據(jù)庫，目前研究胸膜間皮瘤與免疫的療效的研究中，標本目前只有小鼠來源的測序數(shù)據(jù)，但是，小鼠來源的標本受到的干擾因素更容易控制，反而避免了在不同人群樣本中的影響或者其他混雜因素，因此，作為疾病的內(nèi)在機制的研究，小鼠標本或許是一個很好的研究載體；而且結(jié)合既往研究，通過對小鼠樣本的研究中，對于揭示人類的疾病機制研究中扮演了非常重要的作用，所以，這也在一定程度上奠定了本研究的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫分析，探索了MPM免疫治療療效相關(guān)分子及其參與調(diào)控的關(guān)鍵通路，進一步對于這些關(guān)鍵基因進行深入研究，有望為MPM更加精準化的免疫治療提供預(yù)測分子標志物，同時為進一步開發(fā)新的藥物靶點提供一定的理論基礎(chǔ)。

（本文圖1～4見插圖1-5）