祝仰廷，李剛，孫偉，劉丙峰，賈浩，江山，厲昌杰

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其復(fù)發(fā)率和死亡率高，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移［1］。研究表明中醫(yī)藥在治療膀胱癌中具有增效減毒作用［2］。因此，尋找可以抑制膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的中藥及其作用的分子機(jī)制對(duì)膀胱癌的治療具有重要意義。黃芪是豆科植物膜莢黃芪的干燥根，主要成分為黃芪多糖、皂苷、黃酮等，具有抗腫瘤作用［3］。研究報(bào)道黃芪可抑制喉癌細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［4］。黃芪多糖增強(qiáng)了阿帕替尼對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用［5］。然而黃芪對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其機(jī)制尚不清楚。研究表明miRNA參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)［6］。研究報(bào)道m(xù)iR-133a在膀胱癌病人中低表達(dá)，其表達(dá)水平可作為膀胱癌非侵入性診斷標(biāo)志物，及膀胱癌治療的新靶點(diǎn)［7］。而黃芪多糖通過(guò)上調(diào)miR-133a可減少人骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［8］。此外有研究報(bào)道m(xù)iR-153可通過(guò)抑制Janus激酶∕信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase∕signal transducer and activator of transcription，JAK∕STAT）信號(hào)通路抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力［9］。因此，本研究于2019年8月至2020年2月進(jìn)行，旨在研究黃芪對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響以及其機(jī)制是否與miR-133a和JAK∕STAT信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料T24細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所（ATCC）；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；黃芪購(gòu)自北京凱瑞基生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；抗體購(gòu)自上海信裕生物技術(shù)有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；JAK∕STAT信號(hào)通路特異性阻滯劑AG490購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)T24細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)，2 d換液一次，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞處理與分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞，用濃度分別為40 mg∕L、80 mg∕L、160 mg∕L的黃芪處理T24細(xì)胞，作為不同濃度黃芪組；正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照（NC）組，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用160 mg∕L的黃芪處理記為黃芪組。將miR-133a模擬物（mimic）陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-133a mimic（miR-133a）、miR-133a抑制劑（inhibitor）陰性對(duì)照（anti-miR-NC）、miR-133a inhibitor（anti-miR-133a）分別轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞中，記為miR-NC組、miR-133a組、anti-miR-NC組、anti-miR-133a組；將anti-miR-NC、anti-miR-133a分別轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞中再用濃度為160 mg∕L的黃芪處理，記為黃芪+anti-miR-NC組、黃芪+anti-miR-133a組；將anti-miR-133a轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞后再分別用濃度為160 mg∕L的黃芪和10 μmol AG490處理，記為黃芪+anti-miR-133a+AG490組。轉(zhuǎn)染均按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-2，MMP-9）、磷酸化Janus激酶1（p-JAK1）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6（p-STAT6）蛋白表達(dá)各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再分別加入一抗（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜；加入二抗（1∶2 000）室溫孵育90 min，TBST洗滌，用ECL發(fā)光液顯影，用ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，用Quantity One凝膠分析軟件測(cè)定各組蛋白條帶的灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值∕β-actin條帶灰度值。

1.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：分別將500 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)液和200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的下室和上室，然后于恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h。取出小室，吸去培養(yǎng)液后用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并拍照，計(jì)算結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將60 μL Matrigel加入300 μL無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中混勻，然后取100 μL平鋪于Transwell小室的上室，凝固后按遷移實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)miR-133a表達(dá)水平各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件為95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-133a以U6為內(nèi)參，miR-133a：正向引物序列5'-TAACAGTCTACAGCCA-3'，反向引物序列5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。U6：正向引物序列5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，總體有差異進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響與對(duì)照組相比，不同濃度黃芪組MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量降低（P＜0.05），見圖1，表1。

表1 不同濃度黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響s

表1 不同濃度黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響s

注：MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組40 mg∕L黃芪組80 mg∕L黃芪組160 mg∕L黃芪組F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量0.88±0.07 0.72±0.07①0.55±0.04①0.36±0.03①48.74＜0.001 MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量0.95±0.08 0.79±0.06①0.60±0.05①0.40±0.04①48.14＜0.001細(xì)胞遷移數(shù)175.43±16.02 141.23±13.27①107.46±10.14①81.42±8.05①33.35＜0.001細(xì)胞侵襲數(shù)142.55±14.03 122.24±10.25①89.38±7.45①71.23±8.01①29.27＜0.001

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)黃芪處理的T24細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)

2.2 黃芪對(duì)T24細(xì)胞中miR-133a表達(dá)水平和JAK/STAT信號(hào)通路的影響（160 mg/L黃芪）與對(duì)照組相比，黃芪組miR-133a相對(duì)表達(dá)水平升高，p-JAK1、p-STAT6蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖2，表2。

表2 黃芪對(duì)T24細(xì)胞中miR-133a表達(dá)水平和JAK∕STAT信號(hào)通路的影響s

表2 黃芪對(duì)T24細(xì)胞中miR-133a表達(dá)水平和JAK∕STAT信號(hào)通路的影響s

注：miR-133a為微小RNA-133a，p-JAK1為磷酸化Janus激酶1，p-STAT6為磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6。

組別對(duì)照組黃芪組t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 miR-133a相對(duì)表達(dá)量1.00±0.11 2.36±0.21 5.74＜0.001 p-JAK1蛋白相對(duì)表達(dá)量0.55±0.04 0.12±0.01 10.43＜0.001 p-STAT6蛋白相對(duì)表達(dá)量0.38±0.03 0.08±0.01 9.49＜0.001

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)黃芪處理的T24細(xì)胞p-JAK1、p-STAT6蛋白的表達(dá)

2.3 miR-133a對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響與miR-NC組相比，miR-133a組miR-133a相對(duì)表達(dá)水平升高，MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量降低（P＜0.05）；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-133a組miR-133a相對(duì)表達(dá)水平降低，MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量升高（P＜0.05），見圖3，表3。

表3 miR-133a對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響

表3 miR-133a對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響

注：MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9。①與miR-NC比較，P＜0.05。②與anti-miR-NC比較，P＜0.05。

組別miR-NC miR-133a anti-miR-NC anti-miR-133a F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 miR-133a相對(duì)表達(dá)量1.00±0.11 2.73±0.25①1.02±0.13 0.46±0.04②125.41＜0.001 MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量0.86±0.07 0.45±0.04①0.84±0.08 1.07±0.09②38.19＜0.001 MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量0.94±0.08 0.52±0.05①0.97±0.10 1.22±0.11②32.60＜0.001細(xì)胞遷移數(shù)171.16±15.04 105.11±9.86①176.89±16.37 218.03±20.09②26.32＜0.001細(xì)胞侵襲數(shù)139.04±12.37 107.35±9.67①134.12±12.67 159.31±14.94②8.71＜0.001

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)miR-133a轉(zhuǎn)染處理的T24細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)

2.4 anti-miR-133a可以逆轉(zhuǎn)黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響與黃芪+anti-miR-NC組相比，與黃芪+anti-miR-133a組miR-133a相對(duì)表達(dá)水平降低，MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量升高（P＜0.05），見圖4，5；表4。

表4 anti-miR-133a可以逆轉(zhuǎn)黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響∕

表4 anti-miR-133a可以逆轉(zhuǎn)黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響∕

注：MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9。

組別黃芪+anti-miR-NC黃芪+anti-miR-133a t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 miR-133a相對(duì)表達(dá)量1.00±0.11 0.48±0.03 4.56＜0.001 MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量0.34±0.03 0.80±0.06 6.86＜0.001 MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量0.42±0.04 0.86±0.08 4.92＜0.001細(xì)胞遷移數(shù)84.67±8.31 167.04±15.46 4.69＜0.001細(xì)胞侵襲數(shù)76.39±7.14 128.49±11.66 3.81＜0.001

2.5 AG490可以逆轉(zhuǎn)anti-miR-133a聯(lián)合黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響與黃芪+anti-miR-133a組 相 比，黃 芪+anti-miR-133a+AG490組p-JAK1、p-STAT6、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量降低（P＜0.05），見圖6，7；表5。

表5 AG490可以逆轉(zhuǎn)anti-miR-133a聯(lián)合黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響

表5 AG490可以逆轉(zhuǎn)anti-miR-133a聯(lián)合黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響

注：p-JAK1為磷酸化Janus激酶1，p-STAT6為磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9。

組別黃芪+anti-miR-133a黃芪+anti-miR-133a+AG490 t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 p-JAK1蛋白相對(duì)表達(dá)量0.50±0.04 0.26±0.02 5.37＜0.001 p-STAT6蛋白相對(duì)表達(dá)量0.32±0.03 0.12±0.01 6.33＜0.001 MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量0.80±0.06 0.38±0.03 6.26＜0.001 MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量0.88±0.08 0.48±0.05 4.24＜0.001細(xì)胞遷移數(shù)量162.01±15.24 96.83±9.02 3.68＜0.001細(xì)胞侵襲數(shù)量123.57±10.02 90.55±8.76 2.48＜0.001

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是臨床治療失敗的主要原因，尋找抗侵襲、抗轉(zhuǎn)移的藥物是提高腫瘤治療成功的關(guān)鍵，而中醫(yī)藥在抗腫瘤方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，積極探討中醫(yī)藥預(yù)防腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制，努力開發(fā)中藥資源具有重要意義［10-11］。研究表明黃芪具有抗腫瘤功效［12］。如黃芪注射液可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。黃芪多糖可抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［14］。黃芪多糖抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299的遷移和侵襲［15］。以上研究結(jié)果表明黃芪及其有效成分可通過(guò)調(diào)控miRNA或信號(hào)通路抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。然而黃芪對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響尚不清楚，為研究黃芪對(duì)膀胱癌細(xì)胞的有影響，本研究用不同濃度的黃芪處理膀胱癌細(xì)胞T24，結(jié)果顯示，黃芪處理的膀胱癌細(xì)胞T24中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量降低，說(shuō)明黃芪可抑制膀胱癌細(xì)胞T24遷移和侵襲。

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)anti-miR-133a處理的T24細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)

圖7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)AG490處理的T24細(xì)胞p-JAK1、p-STAT6、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)黃芪處理的膀胱癌細(xì)胞T24中miR-133a表達(dá)水平升高，說(shuō)明黃芪可以上調(diào)miR-133a的表達(dá)，與文獻(xiàn)［9］研究結(jié)果相符。且有研究表明miR-133a在膀胱癌中下調(diào)表達(dá)［16］。lncRNA XIST通過(guò)靶向下調(diào)miR-133a可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移［17］。為研究黃芪對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲影響的機(jī)制是否與miR-133a有關(guān)，本研究檢測(cè)了黃芪處理的膀胱癌細(xì)胞T24中miR-133a表達(dá)水平，結(jié)果顯示，黃芪可以上調(diào)miR-133a的表達(dá)。本研究還證實(shí)了過(guò)表達(dá)miR-133a可抑制膀胱癌細(xì)胞T24遷移和侵襲；而抑制miR-133a表達(dá)可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞T24遷移和侵襲。與前人研究結(jié)果相符。為進(jìn)一步研究黃芪是否通過(guò)影響miR-133a表達(dá)影響膀胱癌細(xì)胞，本研究抑制miR-133a表達(dá)的同時(shí)用黃芪處理T24細(xì)胞，結(jié)果顯示，抑制miR-133a表達(dá)逆轉(zhuǎn)了黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。提示，黃芪可能通過(guò)調(diào)控miR-133a的表達(dá)影響膀胱癌細(xì)胞T24遷移和侵襲。

JAK∕STAT信號(hào)通路參與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移［18］。研究報(bào)道激活JAK2∕STAT3途徑可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲［19］。黃芪多糖通過(guò)抑制JAK∕STAT3信號(hào)通路可抑制口腔鱗癌細(xì)胞SCC-25裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)［20］。為研究黃芪是否通過(guò)JAK∕STAT3信號(hào)通路影響膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲，本研究檢測(cè)了黃芪處理的膀胱癌細(xì)胞T24中JAK∕STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，p-JAK1、p-STAT6蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，表明黃芪可能抑制JAK1∕STAT6信號(hào)通路激活。且本研究還發(fā)現(xiàn)抑制miR-133a表達(dá)逆轉(zhuǎn)了黃芪對(duì)JAK1∕STAT6信號(hào)通路的抑制作用。表明黃芪可能通過(guò)miR-133a影響JAK∕STAT信號(hào)通路，為進(jìn)一步研究JAK∕STAT信號(hào)通路與黃芪及miR-133a的關(guān)系，本研究用JAK-STAT3信號(hào)通路的阻滯劑AG490處理抑制miR-133a表達(dá)聯(lián)合黃芪作用的T24細(xì)胞，結(jié)果顯示，p-JAK1、p-STAT6、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量降低；說(shuō)明阻滯JAK∕STAT信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)抑制miR-133a表達(dá)聯(lián)合黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

綜上所述，黃芪可能通過(guò)上調(diào)miR-133a表達(dá)抑制JAK∕STAT信號(hào)通路抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲。為臨床治療膀胱癌提供了參考及可能的分子作用靶點(diǎn)。

（本文圖4，6見插圖1-3）

圖4 anti-miR-133a逆轉(zhuǎn)黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×200） 圖6 AG490逆轉(zhuǎn)anti-miR-133a聯(lián)合黃芪對(duì)T24細(xì)胞遷移和侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×200）