李祥蕓，朱祥祥，徐濤

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病微血管最嚴重的并發(fā)癥之一，也是致盲的一個重要因素，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢［1-2］。人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（HRCECs）損傷是DR發(fā)生的基礎(chǔ)，目前認為高血糖是引起DR的重要因素，持續(xù)的高血糖引起的視網(wǎng)膜組織微血管內(nèi)皮細胞損傷是DR出現(xiàn)血管病理改變的始動因素［3］。白花蛇舌草（HDW）是一種茜草科一年生草本植物，廣泛分布在亞熱帶地區(qū)，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫增強功能、神經(jīng)保護等功能［4-5］。有研究顯示，白花蛇舌草可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對治療突眼有一定的效果［6］。白花蛇舌草可影響HRCECs增殖及VEGF表達［7］，但白花蛇舌草是否可影響HRCECs周期、凋亡及氧化應(yīng)激尚未明確。本研究于2019年10月至2020年6月，體外培養(yǎng)HRCECs，旨在探討白花蛇舌草注射液（HDI）對高糖誘導的HRCECs增殖、周期、凋亡及活性氧水平影響，并進一步研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器白花蛇舌草注射液購自吉林通化振國藥業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、二甲基亞砜均購自美國Gibco公司；CCK8細胞活性檢測試劑盒購自日本Dojindo公司；細胞周期檢測試劑盒、活性氧檢測試劑購自南京凱基生物科技公司；流式細胞儀和Annexin V-FITC∕PI雙染法細胞凋亡試劑盒均購自美國BD公司；ECL試劑盒購自美國Invitrogen公司；BCA試劑盒購自美國Pierce公司；增殖細胞核抗原（PCNA）、細胞周期蛋白A1（CyclinA1）和活化胱天蛋白酶-3（cleaved caspase-3）抗體購自美國Abcam公司；酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 細胞培養(yǎng)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（HRCECs）購自美國ScienCell公司。常規(guī)復蘇HRCECs后用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)液中添加青霉素（100 U∕mL）及鏈霉素（100 g∕L），培養(yǎng)條件為37℃恒溫、5%體積分數(shù)二氧化碳的濕潤培養(yǎng)箱。取第5代細胞用于實驗。

1.3 CCK8法檢測白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs增殖的影響取生長至對數(shù)期的第5代HRCECs，以5×104個∕毫升接種于96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后進行試驗。對照組加入5.5 mmol∕L的葡萄糖；高滲對照組加19.5 mmol∕L的甘露醇及5.5 mmol∕L的葡萄糖；高糖對照組加入25 mmol∕L葡萄糖；白花蛇舌草組（HDI組）加入HDI（6.25 mL∕L、12.5 mL∕L、25 mL∕L、50 mL∕L）和25 mmol∕L的葡萄糖。HDI濃度的選擇根據(jù)參考文獻［7］和預實驗結(jié)果進行篩選。每組設(shè)置5個重復孔，培養(yǎng)48 h后，棄掉已作用的培養(yǎng)液，每孔中加100 μL的新鮮培養(yǎng)基，同時在避光條件下加入CCK8 10 μL，避光孵育4 h，于450 nm波長，酶標儀測定吸光度值（OD值）。實驗重復3次。

1.4 流式細胞術(shù)檢測白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs周期的影響收集按照“1.2”分組處理48 h的各組細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，完全培養(yǎng)基終止消化，4℃離心（1 000 r∕min）5 min，棄掉上清，PBS洗滌細胞3次，離心。預冷無水乙醇懸浮沉淀，制備成為單細胞懸液，4℃固定過夜。檢測前，PBS洗滌以除去固定液，加200 μL RNaseA（1 g∕L），于37℃水浴中30 min，然后加入1 mL碘化丙啶染色液，混勻，避光染色30 min，通過流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.5 流式細胞術(shù)檢測白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs凋亡的影響收集按照“1.2”分組處理48 h的各組細胞，PBS洗滌細胞，用195 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，然后添加5 μL的碘化丙啶及5 μL的Annexin-FITC，混勻后，于室溫條件下避光反應(yīng)10 min。1 h內(nèi)檢測各組細胞凋亡率變化。實驗重復3次。

1.6 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs活性氧水平的影響使用二甲基亞砜溶解2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA），配置成1 mmol∕L的儲備液，染色前使用PBS配置成濃度為10 μmol∕L的工作液。收集按照“1.2”分組處理48 h的各組細胞，吸棄培養(yǎng)液，預冷PBS洗滌細胞3次，滴加0.5 mL現(xiàn)配的H2DCFDA，37℃培養(yǎng)箱避光反應(yīng)45 min，吸除染色液，PBS洗滌細胞3次，加入0.5 mL PBS。于488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測各組細胞活性氧水平。實驗重復3次。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表達的影響收集按照“1.2”分組處理48 h的各組細胞，加適量含PMSF的細胞裂解液，于冰上反應(yīng)30 min，4℃離心機離心15 min，收集上清。BCA法測定蛋白樣品濃度。按照每孔30 μg上樣蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳（90 V恒壓）3 h，取出凝膠，通過電轉(zhuǎn)PVDF膜（100 mA電流50 min），轉(zhuǎn)好的膜至于5%脫脂奶粉中，室溫孵育2 h，洗膜。將膜放置于經(jīng)1∶500稀釋的PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3抗體反應(yīng)液中，室溫孵育2 h，加1∶1 000稀釋的HRP標記的二抗，室溫反應(yīng)2 h，ECL顯色。采用Image J軟件分析PVDF膜各條帶灰度值。以灰度值目的蛋白∕灰度值GAPDH表示各蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用±s表示，三組及三組以上差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs增殖的影響采用CCK8法檢測6.25 mL∕L、12.5 mL∕L、25 mL∕L和50 mL∕L的白花蛇舌草注射液對高糖誘導的HRCECs增殖的影響，見表1所示，與對照組比較，高糖組細胞活性明顯升高（P＜0.05）。與高糖組比較，12.5 mL∕L、25 mL∕L和50 mL∕L的白花蛇舌草組細胞活性明顯降低（P＜0.05）。6.25 mL∕L白花蛇舌草組細胞活性與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。選擇50 mL∕L的白花蛇舌草作為研究對象。

表1 白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs增殖的影響

表1 白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs增殖的影響

注：HDI為白花蛇舌草注射液，OD為吸光度。①與對照組比較，P＜0.05。②與高糖組比較，P＜0.05。

組別對照組高糖組高滲對照組HDI組（6.25mL∕L）HDI組（12.5mL∕L）HDI組（25mL∕L）HDI組（50mL∕L）F值P值重復次數(shù)3 3 3 3 3 3 3 OD值0.684±0.072 1.116±0.105①0.889±0.092 1.101±0.087 0.847±0.076②0.639±0.058②0.421±0.042②31.01＜0.001

2.2 白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs周期的影響與對照組比較，高糖組G0∕G期細胞百分比明顯升高，G2∕M期和S期細胞百分比明顯降低（P＜0.05）。與高糖組比較，HDI組G0∕G期細胞百分比明顯降低，G2∕M期和S期細胞百分比明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs周期的影響

表2 白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs周期的影響

注：HDI為白花蛇舌草注射液。①與對照組比較，P＜0.05。②與高糖組比較，P＜0.05。

組別對照組高糖組高滲對照組HDI組F值P值重復次數(shù)3 3 3 3 G0∕G期54.72±4.31 60.02±5.01①56.59±4.88 32.31±3.42②24.03＜0.001 S期30.01±3.01 26.22±2.56①28.87±2.43 49.79±4.63②32.76＜0.001 G2∕M期15.27±1.11 13.76±1.23①14.54±0.96 17.90±1.54②6.42 0.016

2.3 白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs凋亡的影響對照組、高糖組、高滲對照組、HDI組的細胞凋亡率分別為（3.32±0.47）%、（17.11±1.01）%、（8.79±0.89）%、（9.72±0.73）%，四組凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義（F=150.33，P＜0.001）。與對照組比較，高糖組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。與高糖組比較，HDI組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 流式細胞術(shù)檢測白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs凋亡的影響

2.4 白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs活性氧水平的影響對照組、高糖組、高滲對照組、HDI組的熒 光 強 度 分 別 為42.14±3.56、96.18±5.22、75.59±5.13、67.75±4.83，四組熒光強度比較差異有統(tǒng)計學意義（F=66.86，P＜0.001）。與對照組比較，高糖組活性氧水平明顯升高（P＜0.05），與高糖組比較，HDI組活性氧水平明顯降低（P＜0.05）。

2.5 白花蛇舌草對高糖誘導的HRCECs PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表達的影響與對照組比較，高糖組PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表達均明顯升高（P＜0.05），與高糖組比較，HDI組PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表達均明顯降低（P＜0.05）。見圖2，表3。

表3 PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3蛋白相對表達量∕xˉ±s

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3蛋白表達

3 討論

DR嚴重危害病人的視功能，其特點是視網(wǎng)膜新生血管形成，目前其發(fā)病機制尚未完全明確［7］。白花蛇舌草是一種茜草科一年生草本植物，目前對DR HRCECs生長的影響尚未明確。本研究中CCK8結(jié)果顯示，高糖可促進HRCECs增殖，12.5 mL∕L、25 mL∕L和50 mL∕L的 白 花 蛇 舌 草 對 高 糖 環(huán) 境 下HRCECs增殖具有抑制作用。這與既往研究結(jié)果一致［8］。由于50 mL∕L的白花蛇舌草對HRCECs增殖抑制更明顯，因此選擇作為研究對象。流式細胞儀結(jié)果顯示，白花蛇舌草組S期細胞的數(shù)量明顯增加，即白花蛇舌草可引起HRCECs發(fā)生S期阻滯。細胞的各個周期所調(diào)控的蛋白不同，在S期至G2∕M期過程中，CyclinA1發(fā)揮作用，其參與DNA合成、復制及細胞進入有絲分裂，是S期至G2∕M期過程的一個必須因子［9-10］。PCNA為細胞核內(nèi)多聚酶輔助蛋白，其表達水平與細胞增殖存在正相關(guān)關(guān)系［11］。在細胞增殖過程中PCNA表達具有周期性，G0期PCNA基本上不表達，在G1晚期至S中期PCNA表達達到峰值，而在G2∕M期PCNA表達迅速下降，能準確地反映出細胞的生長狀態(tài)及生長速度［12］。多項研究表明，高糖可影響PCNA和CyclinA1表達，而抑制其表達可減弱HRCECs增殖［13］。本研究結(jié)果顯示，白花蛇舌草組S期PCNA及CyclinA1表達均明顯降低。提示白花蛇舌草對HRCECs增殖調(diào)控與調(diào)節(jié)PCNA及CyclinA1表達有關(guān)。

氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)活性氧、活性氮類自由基（RNS）等高活性分子產(chǎn)生過多，消除降低，最終導致細胞內(nèi)酶及蛋白變性，生物膜脂質(zhì)的過氧化，DNA損害，引起細胞發(fā)生凋亡或死亡，進而引起組織受損［14-15］。異常代謝可引起血糖升高，而活性氧累積所造成的氧化應(yīng)激可損害視網(wǎng)膜血管，最終導致DR的發(fā)生［16-17］。眾所周知，氧化應(yīng)激激活caspase級聯(lián)反應(yīng)是其引起細胞凋亡的重要途徑［18］。caspase-3是caspase家族成員關(guān)鍵酶，也是執(zhí)行凋亡的最主要因子，其激活可使凋亡不可逆［19］。多項研究表明，高糖可引起細胞的氧化應(yīng)激，誘導細胞凋亡及caspase-3的表達，而抑制氧化應(yīng)激及凋亡對細胞損傷具有保護作用［20-21］。白花蛇舌草是否可影響高糖誘導的HRCECs凋亡及氧化應(yīng)激還未明確。本研究結(jié)果顯示，高糖可引起HRCECs凋亡增加，活性氧水平增加，cleaved caspase-3表達增加，而白花蛇舌草可減弱高糖對HRCECs凋亡、活性氧水平及cleaved caspase-3表達影響。提示白花蛇舌草可通過降低HRCECs凋亡及活性氧水平而減弱高糖引起的細胞損傷。

綜上所述，白花蛇舌草可減弱高糖對細胞增殖、周期、凋亡、活性氧水平及PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表達影響。提示白花蛇舌草對DR具有潛在保護和治療作用，但還需更多研究證實。