柯昌虎，王運(yùn)文，嚴(yán)慧，馮協(xié)和，劉佳玲，李志浩

乳腺癌嚴(yán)重危害著人類健康，是女性癌癥病人主要致死原因之一［1］。2020年全球新增癌癥病人高達(dá)1 929萬例，其中乳腺癌占比11.7%，成為人類發(fā)病率最高的癌癥［2］。乳腺癌疾病形成的機(jī)制較為繁雜，不同分子亞型的遺傳特征和臨床特征差異明顯［3］，同時乳腺癌具有顯著的化療耐藥，對現(xiàn)有有限的治療手段產(chǎn)生巨大的挑戰(zhàn)，如何對治療藥物進(jìn)行減毒增效，一直是人們關(guān)注的問題。

康艾注射液是常見的抗癌中藥，其組成成分為黃芪、人參和苦參素，它不僅可以提高機(jī)體的免疫力，還可以抑制或殺滅多種癌細(xì)胞［4-5］。在我國臨床上，康艾注射液廣泛應(yīng)用于乳腺癌的治療，幫助改善病人的生存質(zhì)量，減少化療反應(yīng)［6］。對90例乳腺癌病人進(jìn)行分組治療，發(fā)現(xiàn)康艾注射液可以作用于磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸∕蘇氨酸蛋白激酶（PI3k-Akt）通路，發(fā)揮提質(zhì)增效的作用［7］；康艾注射液結(jié)合新輔助化療可以有效降低女性三陰型乳腺癌（TNBC）病人腫瘤標(biāo)志物的水平［8］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，采用康艾注射液干預(yù)SK-BR-3等四種人類乳腺癌細(xì)胞系，可以產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，其機(jī)制與腺苷酸活化蛋白激酶∕哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（AMPK∕mTOR）通路密切相關(guān)［9］。盡管康艾注射液具有明顯的抗乳腺癌作用，但其化學(xué)成分復(fù)雜，治療乳腺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制有待明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“藥物-基因-疾病”的模塊結(jié)構(gòu)，從整體水平反映出中藥干預(yù)疾病調(diào)控機(jī)制［10］，從而為闡明藥物治療相關(guān)疾病的提供新的方法。分子對接可以揭示配體（藥物分子）和受體（蛋白）的相互作用，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以促進(jìn)藥效物質(zhì)的明晰和藥效解釋［11］。本研究起止時間為2021年3—6月，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建康艾注射液-乳腺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，探討其可能的抗癌機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 康艾注射液活性成分及靶點(diǎn)的篩選檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）收集康艾注射液中黃芪和人參的活性成分，選擇口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）兩項(xiàng)作為控制指標(biāo)，分別不小于30%、0.18，以此篩選活性成分及靶點(diǎn)［12］。苦參素即氧化苦參堿，在PubChem數(shù)據(jù)庫中查找其SMILES，并導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中查找靶點(diǎn)，最后在Uniprot數(shù)據(jù)庫中校正基因的名稱。

1.2 乳腺癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選以“breast cancer”為檢索詞，在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中獲取乳腺癌的相關(guān)靶點(diǎn)，其中GeneCards以基因關(guān)聯(lián)性評分≥15為篩選條件。

1.3 活性成分-疾病共有靶點(diǎn)的篩選打開Venny 2.1在線平臺，將康艾注射液與乳腺癌的靶點(diǎn)錄入，繪制出韋恩圖，并獲取二者的共有靶點(diǎn)。

1.4 藥物-成分-乳腺癌-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建運(yùn)行Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”互作網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer功能以節(jié)點(diǎn)度值（degree）為指標(biāo)進(jìn)行可視化分析。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將共有靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置Organism類型為“Homo sapiens”，選擇交互作用＞0.9的靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件繪制PPI可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.6 富集分析使用David 6.8數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行GO與KEGG富集分析。以P＜0.01為閾值進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選，探討康艾注射液抗乳腺癌的生物學(xué)過程和信號通路。

1.7 分子對接驗(yàn)證從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）數(shù)據(jù)庫獲取蛋白受體的3D結(jié)構(gòu)，使用AutoDock Vina將“靶點(diǎn)-成分”進(jìn)行模擬對接。結(jié)合自由能小于0，則表明藥物成分的分子和配體受體可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合打分值越低則形成的復(fù)合物越穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 康艾注射液主要活性成分及作用靶點(diǎn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索到277個化學(xué)成分，包括黃芪87個，人參190個，其中OB≥30%和DL≥0.18的成分41個；苦參素的主要化學(xué)成分為氧化苦參堿。結(jié)果共獲得康艾注射液的活性成分42個，其中山柰酚（kaempferol）為黃芪和人參的共有成分，見表1。對獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重，去除無靶點(diǎn)成分，最終32個候選化合物共篩選出290個藥物作用靶點(diǎn)。

表1 康艾注射液的活性成分信息

2.2 疾病靶點(diǎn)的檢索及藥物活性成分-疾病共有靶點(diǎn)的篩選使用Geencards、OMIM數(shù)據(jù)庫分別獲得乳腺癌靶點(diǎn)1 375個（相關(guān)性評分≥15）、256個，兩者整合并去除重復(fù)數(shù)據(jù)，最終篩選出乳腺癌靶點(diǎn)1 530個。將藥物和疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行Venny分析，二者取交集后得到康艾注射液和乳腺癌共有靶點(diǎn)125個。

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在Cytoscape 3.7.2軟件中，分別輸入康艾注射液的成分、靶點(diǎn)等數(shù)據(jù)，制作“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。圖中藍(lán)色橢圓形、黃色長方形、綠色方形、紅色菱形分別代表中藥、成分、靶點(diǎn)、乳腺癌。其中異鼠李素（isorhamnetin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、氧化苦參堿（oxymatrine）作用靶點(diǎn)較多，可能為藥物發(fā)揮抗乳腺癌作用的關(guān)鍵活性成分，見表2。

表2 康艾注射液的關(guān)鍵活性成分信息

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在STRING數(shù)據(jù)庫中物種設(shè)定為“Homo sapiens”，選取置信度＞0.9的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，繪制可視化網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖2所示。Degree值前五位的靶點(diǎn)依次是TP53（degree=37）、AKT1（degree=37）、JUN（degree=33）、MAPK1（degree=33）、TNF（degree=327），可能在治療乳腺癌中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

2.5 GO功能分析結(jié)果運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫對康艾注射液活性成分抗乳腺癌靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，以P＜0.01為篩選條件，結(jié)果有411條生物學(xué)過程，其中生物過程（BP）314條，主要涉及序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正向調(diào)控、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等；細(xì)胞成分（CC）32條，主要涉及細(xì)胞核、細(xì)胞外空間、核染色質(zhì)等；分子功能（MF）65條，主要與蛋白磷酸酶結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性等相關(guān)。GO分析結(jié)果表明康艾注射液通過參與調(diào)控多個生物過程而產(chǎn)生抗乳腺癌作用。

2.6 KEGG通路分析結(jié)果對康艾注射液活性成分抗乳腺癌靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析，取P＜0.01，共獲得通路共104條，主要涉及癌癥途徑、TNF、HIF-1、PI3K-Akt、凋亡途徑、NOD樣受體、T細(xì)胞受體等信號通路。KEGG分析結(jié)果表明康艾注射液的作用靶點(diǎn)分布于不同的通路中，可通過多種通路達(dá)到治療乳腺癌的作用。

2.7 分子對接結(jié)果從PDB中提取TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF蛋白的 人 類結(jié)構(gòu)ID，分 別 為3Q05、3OS5、1JUN、6SLG、2AZ5，將其與配體isorhamnetin、quercetin、kaempferol、oxymatrine分別進(jìn)行對接分析，結(jié)果見表3。結(jié)合能小于-5.0 kcal∕mol，表示對接形成的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定［13］。結(jié)果顯示，配體和受體可以自發(fā)進(jìn)行結(jié)合，其中AKT1-isorhamnetin、ATK1-oxymatrine、TNF-kaempferol、TNF-oxymatrine、TP53-oxymatrine、TP53-quercetin、TP53-kaempferol具有較強(qiáng)的結(jié)合，結(jié)合能均小于-6.0 kcal∕mol。以TP53-quercetin（7a）、TP53-kaempferol（7b）的對接結(jié)果為例進(jìn)行展示，TP53與quercetin通過氨基酸殘基TYR-233、PRO-98、VAL-97、TYR-229、GLU-221產(chǎn)生氫鍵相互作用，與kaempferol通過氨基酸殘基TYR-233、TYR-229、GLU-221、VAL-97產(chǎn)生氫鍵相互作用，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的結(jié)合，如圖3所示。

表3 康艾注射液活性成分與靶點(diǎn)蛋白間的結(jié)合能∕（kcal∕mol）

3 討論

乳腺癌是當(dāng)今世界面臨的重大公共衛(wèi)生問題，對人類身心健康產(chǎn)生巨大威脅。2020年，我國乳腺癌新發(fā)病例約42萬例，死亡約12萬例，發(fā)病增速高于全球水平，情況不容樂觀［2］。康艾注射液含有黃芪、人參和苦參素，三種成分均具有抗癌功效。其中黃芪提取物對MCF-7等三種乳腺癌細(xì)胞均具有增殖抑制作用［14］，人參皂苷對Luminal型乳腺癌大鼠腫瘤生長效果良好［15］，氧化苦參堿通過分泌型糖蛋白∕β-連環(huán)蛋白（Wnt∕β-catenin）通路對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞干預(yù)作用［16］。雖然康艾注射液治療乳腺癌療效明顯，但其抗癌的分子機(jī)制尚未明確，本研究對康艾注射液治療乳腺癌的機(jī)制進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，并利用分子對接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

以生物利用度和類藥性為考察指標(biāo)，從康艾注射液中篩選出異鼠李素、槲皮素、山柰酚、氧化苦參堿等共32個抗乳腺癌活性成分。其中異鼠李素屬于黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)異鼠李素可顯著抑制乳腺癌MCF-7及BT-549細(xì)胞株增殖，降低AKT和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）的磷酸化及Ki67的表達(dá)，并引起細(xì)胞的凋亡［17］；也能通過介導(dǎo)AKT和絲裂原活化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MEK）達(dá)到抗乳腺癌的效果［18］。槲皮素屬于黃酮醇類化合物，可以結(jié)合整合 素β3（Integrin β3），促使基 質(zhì)金屬蛋 白 酶-2（MMP-2）等蛋白表達(dá)下調(diào)，從而抑制TNBC的侵襲遷移［19］；也可以通過靶向抑制特異性蛋白5∕跨膜糖蛋白1型（GAS5∕Notch1）信號通路促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡［20］。山柰酚也是一種天然黃酮，能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞的活力，阻滯G2∕M期，誘導(dǎo)凋亡和DNA損傷，增加磷酸化組蛋白（γH2AX）、活化胱天蛋白酶9（cleaved caspase-9）、活化胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）和酸化毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白（p-ATM）的表達(dá)水平［21］；可以在體外通過調(diào)控Notch1、cleaved caspase-3蛋白來抑制SKBR-3細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡［22］。氧化苦參堿屬于苦參型生物堿，對TNBC細(xì)胞生長和遷移侵襲有抑制作用，具有潛在的抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移作用［23］；還可以抑制Wnt∕β-catenin通路促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡［24］。

經(jīng)康艾注射液和乳腺癌共有靶點(diǎn)交集篩選出TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF等共125個關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中TP53在癌癥中多發(fā)生突變，結(jié)果導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)途徑的異常、細(xì)胞周期的停滯、染色質(zhì)重塑和細(xì)胞凋亡［25］。TP53是重要的癌癥標(biāo)志物，在30%的乳腺癌中觀察到TP53突變。AKT1參與細(xì)胞生長、分化、凋亡和遷移等過程，是治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)［26］；也可介導(dǎo)β-catenin核轉(zhuǎn)位對MCF-7細(xì)胞遷移產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用［27］。原癌基因蛋白∕活化蛋白1（c-Jun）參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程，并與增殖和血管生成有關(guān)［28］，藥物激活c-Jun可以通過蛋白激酶C途徑抑制MCF-7細(xì)胞的增殖［29］。miR-198可靶向作用于乳腺癌細(xì)胞中MAPK1，從而抑制細(xì)胞的凋亡［30］。TNF-α可作用于乳腺癌中酸性鞘磷脂酶（ASM）等蛋白來調(diào)控的細(xì)胞增殖［31］；也能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞由G0∕G1期向S期轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞進(jìn)入到對化學(xué)藥物治療敏感的增殖周期［32］。

經(jīng)GO功能分析獲取炎癥反應(yīng)、細(xì)胞核、染色質(zhì)結(jié)合等411條生物學(xué)過程。經(jīng)KEGG通路分析獲取括癌癥通路、TNF、HIF-1、PI3K-Akt、凋亡通路、NOD樣受體、T細(xì)胞受體等104條通路。其中tmTNF-α在乳腺癌中高表達(dá)，可以使核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）活化，tmTNF-α-NF-κB通路與乳腺癌耐藥有關(guān)，tmTNF-α可能成為耐藥性乳腺癌新的治療思路和治療靶點(diǎn)［33］；同時TNFR高表達(dá)可激活NF-κB通路誘發(fā)細(xì)胞亡［34］。PI3K-Akt通路過度激活與人表皮生長因子受體2（HER2）治療耐藥相關(guān)［35］，PI3K和AKt的表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)淋巴管生成及淋巴轉(zhuǎn)移［36］。研究發(fā)現(xiàn)，敲除高表達(dá)的泛素特異性蛋白酶21（USP21）可以抑制TNBC的遷移和侵襲，顯著下調(diào)參與NOD樣受體信號通路的多個基因表達(dá)［37］。最后，分子對接結(jié)果顯示藥物分子與受體蛋白可以通過氫鍵等作用力進(jìn)行結(jié)合，表明康艾注射液可以作用于上述靶點(diǎn)對乳腺癌產(chǎn)生作用。

綜上所述，本研究對康艾注射液治療乳腺癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)異鼠李素、槲皮素、山柰酚、氧化苦參堿等活性成分，可作用于TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF等靶點(diǎn)，介導(dǎo)癌癥、TNF、HIF-1、PI3K-Akt等信號通路，從而為深入研究康艾注射液治療乳腺癌的機(jī)制提供了理論依據(jù)。后期可探討分子之間的協(xié)同用藥以及靶點(diǎn)之間的相互作用模式，為后續(xù)研究康艾注射液抗乳腺癌的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

（本文圖1～3見插圖1-1）

圖1 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖 圖2 康艾注射液治療乳腺癌靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖 圖3 康艾注射液分子對接圖：3A為TP53-quercetin；3B為TP53-kaempferol