張瑩瑩，張科，宋崟，馬紅英，邵佳，張弋

“川芎-當歸”藥對出自宋代《太平惠民和劑局方》的“芎歸湯”，現(xiàn)已開發(fā)為舒腦欣滴丸，臨床用于血虛血瘀引起的偏頭痛，癥見頭痛、頭暈、視物昏花、健忘、失眠等［1］。當歸性溫味甘辛，歸心、肝、脾經(jīng)，善補血活血，調經(jīng)止痛，潤腸通便，并能散寒，凡血虛血瘀有寒癥均宜［2］，川芎性溫味辛，歸肝、膽、心包經(jīng)，善活血行氣，祛風止痛，治血瘀氣滯諸痛，兼寒者最宜［3］。川芎-當歸藥對在中醫(yī)方劑中應用廣泛，王歡等［4］利用中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫對當歸-川芎藥對不同配比的中醫(yī)應用數(shù)據(jù)進行分析，結果顯示含有川芎、當歸的方劑共1 242首，對多種疾病有一定的治療作用。現(xiàn)代研究表明，川芎-當歸藥對具有擴張血管，尤其是冠狀血管，增加冠脈血量，改善心肌缺血和抑制血小板凝聚等藥理作用。但目前還沒有從分子層面上對該藥對的物質基礎及作用機制進行研究的論述和報道。近年來，基于網(wǎng)絡藥理學對中藥復方進行“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡和物質基礎、靶點、通路分析的研究成為熱點。該方法通過構建多層次網(wǎng)絡，從基因、分子和細胞層面闡釋藥物的作用機制［5］。本研究擬通過該方法探究“川芎-當歸”藥對的主要活性成分、靶點和藥理作用機制，本研究起止時間為2020年9—12月。

1 方法

1.1 成分和用靶點的收集與篩選打開TCMSP 2.3數(shù)據(jù)庫（https：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php），以“川芎”“當歸”為檢索詞，檢索藥材的成分和靶點?？诜锢枚龋∣B）是藥物研發(fā)過程中關鍵藥動學參數(shù)，它表示藥物經(jīng)血管外途徑給藥后，經(jīng)肝臟進入體循環(huán)血液藥量中的相對量，其與藥物療效密切相關。OB值與類藥性（DL）正相關，OB值高的活性成分其成為藥物的可能性越高［6-8］。目前成分常規(guī)篩選條件按照口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18［9］進行篩選。但是由于篩選條件的限制，不能囊括所有的化學成分，對于川芎和當歸藥材中兩個主要化學成分阿魏酸和川芎嗪，由于DL值很低被篩選排除，考慮到這兩個成分是藥材中的主要成分，且很多研究已經(jīng)證實有明顯的藥理作用。因此，將其作為候選成分進行分析。

1.2 疾病數(shù)據(jù)的收集和靶點對應基因的獲取根據(jù)“1.1”節(jié)所得靶點，收集TCMSP 2.3數(shù)據(jù)庫中靶點對應的疾病，然后使用Uniprot獲取靶點相應基因。具體方法：打開Uniprot網(wǎng)站（https：∕∕www.uniprot.org∕），選擇UniprotKB數(shù)據(jù)庫，以“reviewed：yes AND organism：Homo sapiens（Human）”檢索式進行檢索，共獲得20 394條人的靶蛋白及對應基因的數(shù)據(jù)，以Excel格式導出，再使用“VLOOKUP”函數(shù)匹配所獲得疾病靶點對應的基因信息［10］。

1.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的構建將“川芎-當歸”的藥物、成分、靶點和疾病數(shù)據(jù)處理后導入Cytoscape 3.7.1軟件中，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，然后使用軟件的NetworkAnalyzer進行分析。在網(wǎng)絡中，度值（Degree）表示某一節(jié)點與其他節(jié)點連接邊的數(shù)量［11］；中介中心度（betweenness centrality，BC）表示一個節(jié)點擔任其他兩個結點之間最短路的橋梁的次數(shù)。BC值越大，表示節(jié)點在網(wǎng)絡拓撲結構中的樞紐程度越重要［12］。目前，網(wǎng)絡分析的主要方法是選擇節(jié)點Degree值及BC值高的作為網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點［11］。本研究也采用該分析方法，探究“川芎-當歸”的主要作用靶點、疾病及作用機制。

1.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析將篩選得到的川芎-當歸藥對靶點基因進行基因功能注釋分析和功能富集分析，探究特定基因或蛋白的生物學意義［13］。具體方法，打開DAVID 6.8（https：∕∕david.ncifcrf.gov∕tools.jsp）數(shù) 據(jù) 庫，選 擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”選項，選擇“Homo Sapiens”選項，提交靶點基因列表，進行分析。經(jīng)數(shù)據(jù)庫處理后，導出數(shù)據(jù)，設定閾值P＜0.05，對生物學過程和信號通路進行篩選，并進行繪圖［14］。

2 結果

2.1 川芎-當歸藥對化學成分的確定在TCMSP 2.3數(shù)據(jù)庫中檢索到川芎-當歸化學成分314個，其中當歸125個，川芎189個。按照OB≥30%和DL≥0.18和結合現(xiàn)有研究結果進行自選的條件篩選，共得到11個化學成分，主要包括：黃酮類、有機酸類、豆甾醇、β-谷甾醇、阿魏酸和川芎嗪等成分，見表1。

表1 川芎-當歸中9個化學成分信息

2.2 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡分析“川芎-當歸”藥對的“藥物-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡圖含有274個節(jié)點［2個藥物，10個成分，其中洋川芎醌（senkyunone）沒有對應靶點，71個靶標，191種疾?。莺?43條邊線，選擇Degree和BC排名靠前作為關鍵節(jié)點。網(wǎng)絡中Degree值≥10的成分、靶標和Degree值≥5的疾病節(jié)點見表2。結果顯示：（1）Degree值＞10的成分有4個，其中DG-1（β-谷甾醇）、DG-2（豆甾醇）、CX-2（楊梅黃酮）、DG-3（阿魏酸）Degree分別為39、32、26、15，遠高于其他化合物節(jié)點，為網(wǎng)絡中關鍵節(jié)點；（2）Degree≥10的關鍵靶標12個，包括：環(huán)氧化酶2（PTGS2）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、雌激素受體（ESR1）、β2腎上腺素能受體（ADRB2）、周期蛋白依賴激酶2（CDK2）、熱休克蛋白90（HSP90）、促分裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、膽堿能受體2（CHRM2）、5羥色胺受體2A（HTR2A）、凝血因子Ⅱ受體（F2R）、鹽皮質激素受體（NR3C2）、內皮型一氧化氮合酶（NOS3）；（3）Degree值≥5的疾病11種，包括：疼痛、心血管疾病、乳腺癌、阿爾茨海默病、炎癥、癌癥、焦慮癥、精神分裂癥、前列腺癌、實體腫瘤、腦損傷。

表2 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡節(jié)點及其參數(shù)

2.3 GO富集分析結果DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫得到GO功能富集分析的結果：GO條目237個（P＜0.05），其中生物過程（biological process，BP）178個，分子功能（molecular function，MF）26個，細胞組成（cellular component，CC）33個，具體信息見圖1，表3。

表3 川芎-當歸藥對相應基因GO富集分析結果（閾值P＜0.05，BP、MF、CC的P值前5注釋）

圖1 川芎-當歸靶標的GO富集分析（P＜0.05，BP、MF、CC的P值前5）

2.4 KEGG通路富集分析結果KEGG通路富集分析結果得到66條（P＜0.05）信號通路。主要神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣離子信號通道、癌癥通路、5-羥色胺能突觸、大腸癌、雌激素信號通路、心肌細胞的腎上腺素能信號、甲狀腺激素信號通路、cAMP信號通路、血管內皮生長因子信號通路等；各個信號通路基因富集結果見表4，其中神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路涉及的30個基因，主要包括：GABRB3、CHRM2、GABRA2、CHRM3、GABRA1、CHRM1、CHRNA2、GABRA5、CHRM4、CHRNA7、F2R、ADRB1、ADRB2、HTR2A、OPRM1、ADRA1B、NR3C1、ADRA1A、ADRA2B、ADRA2A、DRD1。

表4 川芎-當歸相應基因京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析結果（閾值P＜0.05）

3 討論

本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法對川芎-當歸藥對的作用機制進行研究。結果顯示：從川芎-當歸藥對314個已知化學成分中，按照OB≥30%和DL≥0.18以及結合現(xiàn)有研究結果進行自選的條件篩選，共得到12個化學成分，主要包括：β-谷甾醇、豆甾醇、阿魏酸、谷甾醇、楊梅黃酮、亞油酸乙酯、川芎萘呋內酯、

洋川芎醌、川芎哚、葉酸、川芎嗪。網(wǎng)絡拓撲結構分析表明，“川芎-當歸”藥對中Degree值前四的活性成分為：β-谷甾醇、豆甾醇、楊梅黃酮、阿魏酸。研究顯示，在體外β-谷甾醇可以抑制乳腺癌細胞的增殖［15］。李慶勇等［16］通過對豆甾醇抗腫瘤活性以及活性氧（ROS）的研究，發(fā)現(xiàn)豆甾醇通過ROS的氧化，鈣離子濃度上升的級聯(lián)反應和阻滯細胞周期的S期和G2∕M期從而誘導人肝癌細SMMC-7721凋亡。邢樹剛等［17］研究發(fā)現(xiàn)：楊梅黃酮可以降低小鼠腦膠質瘤中GL261細胞的MMP-2和MMP-9mRNA的表達水平誘導其凋亡，起到抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲的作用。在網(wǎng)絡藥理學研究過程中，必要時可以將一些不符合常規(guī)篩選條件的，但已經(jīng)證實有明顯的藥理作用成分作為候選成分進行分析。同時，網(wǎng)絡藥理學研究也不能兼顧中藥方劑配伍后成分的變化和中藥成分在體內的代謝產(chǎn)物，使得研究預測的結果存在一定的局限性。因此，在網(wǎng)絡藥理學研究過程中，對于成分篩選的方法還是有待于進一步驗證和改良的。

網(wǎng)絡拓撲結構分析表明主要靶點包括：環(huán)氧化酶2、過氧化物酶體增生激活受體γ、雌激素受體、β2腎上腺素能受體、周期蛋白依賴激酶2、熱休克蛋白90、促分裂原活化蛋白激酶14、膽堿能受體2、5羥色胺受體2A、凝血因子Ⅱ受體、鹽皮質激素受體、內皮型一氧化氮合酶等關鍵靶點，發(fā)揮對多種疾病的治療作用。例如與疼痛、炎癥、腫瘤相關的靶點環(huán)氧化酶2（PTGS2）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、雌激素受體（ESR1）的Degree值分別為39、22、19，遠高于其他靶點節(jié)點，推測“川芎-當歸”藥對可能通過作用這幾個關鍵靶標對各種疼痛、炎癥和腫瘤等發(fā)揮作用。環(huán)氧化酶2是前列腺素E2合成的主要限速酶，主要在細胞因子、生長因子等促炎癥因素下發(fā)揮作用。前列腺素E2與機體的發(fā)熱、炎癥反應和細胞生長及分化等生理活動密切相關。近年研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶2與多種類型的腫瘤細胞的增殖和轉移有關［18］。研究表明，PPARG激動劑通過作用于PPARG受體保護神經(jīng)元，抑制活化的小膠質細胞，促進活化的小膠質細胞凋亡，最終調節(jié)和控制多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥變性疾病，例如阿爾茨海默病、帕金森病以及多發(fā)性硬化［19］。研究表明，雌激素可以通過激活雌激素受體，減少氧化應激導致的腦缺血及再灌注期間血管功能障礙，從而改善微血管功能，在體循環(huán)中發(fā)揮舒張血管和保護神經(jīng)的作用［20］。

KEGG通路富集結果顯示，其中一些基因富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣離子信號通道、5-羥色胺能突觸、雌激素信號通路、心肌細胞的腎上腺素能信號、甲狀腺激素信號通路、cAMP信號通路、血管內皮生長因子信號通路等，其中一些信號通路與神經(jīng)遞質相關。結合“藥物-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡分析結果，阿爾茨海默病、焦慮癥、精神分裂癥和腦損傷為該藥對網(wǎng)絡的關鍵疾病節(jié)點，因此推測大腦可能是“川芎-當歸”藥對作用的靶器官，同時表明“川芎-當歸”藥對通過調控上述信號通路發(fā)揮腦血管疾病的治療作用。動物試驗研究證實：芎歸湯提取液可以明顯改善東莨菪堿致癡呆小鼠學習記憶能力，縮短小鼠水迷宮潛伏期，延長小鼠跳臺潛伏期和減少跳臺錯誤次數(shù)［21］；川芎和當歸通過水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油，均可改善化學性腦缺氧小鼠的能量代謝和中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能，起到保護缺氧組織和維持小鼠正常的能量活動的作用［22］。另外還有一些基因富集在腫瘤通路、大腸癌通路、血管內皮生長因子信號通路等與腫瘤直接相關的信號通路上，這也提示“川芎-當歸”藥對可能會在多種腫瘤的治療方面發(fā)揮作用，值得進一步研究。