何建春，夏茂寧，趙 倩

(1.重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院，重慶 402360；2.四川輕化工大學(xué)，四川 自貢 643000)

HBV血清是檢測(cè)患者是否感染HBV的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，目前已有學(xué)者表明采用醋酸纖維素膜與料銀納米顆粒SERS相結(jié)合的簡(jiǎn)單方法進(jìn)行血清蛋白分離和生化分析，其中銀納米顆粒是通過(guò)使用硝酸鹽和鹽酸羥胺制作而成的，加入銀納米顆?？梢栽鰪?qiáng)蛋白質(zhì)拉曼信號(hào)，另外，醋酸纖維素膜除了能除去蛋白質(zhì)以外，還能除去其他各種化學(xué)成分，為血清檢測(cè)提供了一種獨(dú)特的蛋白檢測(cè)手段。進(jìn)一步提高HBV血清的識(shí)別度。同時(shí)醋酸纖維素膜與銀納米顆粒可以與血清中的氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖和蛋白質(zhì)等無(wú)機(jī)、有機(jī)混合物發(fā)生一定反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)血清檢測(cè)效率。

目前對(duì)血清檢測(cè)通常采用拉曼光譜，而拉曼光譜分析法具有非接觸、速度快以及無(wú)損的優(yōu)點(diǎn)[1-3]，近年來(lái)拉曼光譜分析成為有機(jī)化學(xué)、材料科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)問(wèn)題[4-5]。拉曼光譜進(jìn)行生物樣品檢測(cè)時(shí)，樣品無(wú)需進(jìn)行前置處理并且樣品用量少。由于拉曼光譜資料具有特征峰多、數(shù)據(jù)維數(shù)大等缺陷，因此能夠獲得較好的生物樣本資料；拉曼光譜對(duì)生物探測(cè)的準(zhǔn)確性有直接的影響。為了提高HBV血清檢測(cè)的精度，降低拉曼光譜的冗余信息和特征峰值數(shù)量，提出一種基于連續(xù)投影法的拉曼光譜特征波長(zhǎng)篩選和灰狼優(yōu)化算法優(yōu)化極限學(xué)習(xí)機(jī)[6]的HBV血清檢測(cè)模型。在醋酸纖維素膜與銀納米顆粒對(duì)血清進(jìn)行分離的基礎(chǔ)上，針對(duì)HBV血清拉曼光譜數(shù)據(jù)具有維度高、非線性強(qiáng)的特點(diǎn)，將拉曼光譜、連續(xù)投影法、主組分法等多種光譜的特征篩查進(jìn)行了比較，并初步建立了一種用于 HBV的熒光光譜的光譜特性波長(zhǎng)選擇?？紤]到 ELM模式的參數(shù)設(shè)定會(huì)對(duì) ELM模式進(jìn)行性能的影響，采用 GWO方法進(jìn)行 ELM模型的參數(shù)優(yōu)選，并采用GWO-ELM方法進(jìn)行了基于GWO-ELM的 HBV病毒抗體的識(shí)別。與PSO-ELM、GA-ELM和ELM相比，GWO-ELM的HBV血清檢測(cè)模型的識(shí)別精度最高，為HBV血清檢測(cè)提供了新的方法。

1 材料和方法

1.1 樣本材料

銀納米顆粒是通過(guò)使用硝酸鹽和鹽酸羥胺生產(chǎn)的。首先將10 mL鹽酸羥胺溶液(6×10-2mol/L)與9 mL氫氧化鈉溶液(10-2mol/L)，并將混合物加入到180 mL硝酸銀(1.11×10-3mol/L)中，然后將混合溶液在室溫下連續(xù)攪拌15 min。銀納米顆粒的尺寸遵循平均直徑為45 nm，標(biāo)準(zhǔn)偏差為8 nm。

為驗(yàn)證本文方法進(jìn)行拉曼光譜生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)的效果，選取2例 HBV病人的血樣和2例正常人群的血樣進(jìn)行檢測(cè)。10 μL的血清用吸管在醋酸纖維薄膜上進(jìn)行標(biāo)記；1 min后，該標(biāo)本已被膜完全吸附。之后，將包含血清的醋酸酯薄膜的部位切開(kāi)，并在包含10 mL冰乙酸、90 mL體積分?jǐn)?shù)95%酒精和100 mL超級(jí)純水的緩沖劑中清洗，以除去包含在血漿中的其他成分(諸如電解質(zhì)和某些外來(lái)物質(zhì))，并且將血漿蛋白質(zhì)僅保留在醋酸纖維薄膜中。隨后，將僅含有血清蛋白的醋酸纖維素膜切割并收集在管中，并向管中加入60 μL乙酸，目的是將醋酸纖維素膜的片段溶解到透明溶液中。之后，將 140 μL 膠體銀納米顆粒加入試管中。將管置于37 ℃溫水中，將混合物攪拌30 min。在此過(guò)程中，絮狀沉淀物(溶解的膜碎片)出現(xiàn)在管中。離心后(1 000 r/min，10 min)，收集 10 μL 上清液(蛋白質(zhì)-銀納米顆?；旌衔?并轉(zhuǎn)移到鋁板上進(jìn)行拉曼光譜測(cè)量，選取每個(gè)樣品的中心位置，分別測(cè)試得到50組拉曼光譜數(shù)據(jù)。首先使用離心機(jī)提取全血的血清，然后在測(cè)試晶片上用棉花蘸取血液樣本，待血清風(fēng)干之后進(jìn)行檢測(cè)。用拉曼光譜測(cè)定血清，用最高峰值的拉曼光譜進(jìn)行規(guī)范化處理，得到拉曼光譜圖。在圖1、圖2及圖3、圖4分別為2個(gè)正常人的血清和2個(gè)B型感染人的血清。

圖1 測(cè)試區(qū)域和光譜圖Fig.1 Test area and spectrogram

圖2 測(cè)試區(qū)域和光譜圖 Fig.2 Test area and spectrogram

圖3 測(cè)試區(qū)域和光譜圖Fig.3 Test area and spectrogram

圖4 測(cè)試區(qū)域和光譜圖Fig.4 Test area and spectrogram

1.2 GWO算法

標(biāo)準(zhǔn)的GWO算法包括3種行為：包圍行為、捕獵行為以及攻擊行為[7]。

1.2.1包圍行為

這一階段，按照式(1)和(2)式對(duì)灰狼進(jìn)行圍捕：

(1)

(2)

1.2.2捕獵行為

α、β、δ分別為最優(yōu)解、第2解和第3解，則α、β、δ根據(jù)式(3)～式(5)可以重新定位[8]：

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

1.2.3攻擊行為

該階段，狼群攻擊捕獲獵物。當(dāng)|A|≤1時(shí)，狼接近目標(biāo)(X*,Y*)并將目標(biāo)鎖定在目標(biāo)身上；當(dāng)|A|>1時(shí)，狼從他們的捕食范圍內(nèi)移開(kāi)，去找新的目標(biāo)。

2 HBV血清GWO-ELM檢測(cè)模型

2.1 適應(yīng)度函數(shù)

ELM模型的輸入層權(quán)重值與隱含層偏置值初始值是隨機(jī)產(chǎn)生，通過(guò)反復(fù)訓(xùn)練，不斷調(diào)整逼近期望輸出。為改進(jìn)ELM模型初始權(quán)值和隱含層偏置對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，提高ELM模型的性能，本文采用GWO算法優(yōu)化ELM模型參數(shù)，將平均誤差作為適方函數(shù)的選取[9]：

(10)

式中：Ti和Oi是第一采樣的真實(shí)值和期望值；k用于培訓(xùn)的樣本數(shù)目；wmin、wmax分別為輸入權(quán)值w的取值上限和下限[10-12]；bmin、bmax分別為隱含層偏置b的取值上限和下限。

2.2 算法流程

基于GWO改進(jìn)ELM模型的血清檢測(cè)的算法流程如下。

Step1：讀取乙肝血清近紅外拉曼光譜數(shù)據(jù)，并過(guò)程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行分割：

(11)

式中:拉曼光譜的最大值和最小值是xmax和xmin;LB和UB為標(biāo)準(zhǔn)化后的Raman譜的最大值和最小值，取LB=-1,UB=1；x和xnew為原始拉曼光譜數(shù)據(jù)與歸一化處理之后的拉曼光譜數(shù)據(jù)；

Step2：固定 GWO的方法主要包括：最大迭代數(shù)Tmax；搜索維D；群體規(guī)模N；w和b的搜尋區(qū)間是[wmin,wmax]和[bmin,bmax]。將灰狼群的初始群體進(jìn)行隨機(jī)初始化，各群體的位置與ELM模式的輸入權(quán)重及隱含層偏差的參數(shù)結(jié)合(w,b);

Step3：每個(gè)灰狼種的適應(yīng)程度由式(10)來(lái)計(jì)算[13]；

Step4：根據(jù)適應(yīng)程度的不同，灰狼的數(shù)量被分為2類(lèi)α、β、δ和ω；

Step5：按照式(3)～式(5)更新灰狼種群個(gè)體的位置；

Step6：計(jì)算灰狼群中的更新點(diǎn)的適應(yīng)程度f(wàn)(w,b)new，并與上一代最優(yōu)適應(yīng)度f(wàn)(w,b)best相比較，如果f(w,b)new>f(w,b)best，則該灰狼種群個(gè)體適應(yīng)度f(wàn)(w,b)new替換掉f(w,b)best，并且保存這一群體的個(gè)體的地理分布；否則，保留f(w,b)best;

Step7：判定方法結(jié)束條件,如果目前的迭代數(shù)為t>Tmax，則該方法結(jié)束，并給出最優(yōu)化的最優(yōu)化位置，也就是ELM的最佳參數(shù)(w*,b*)。相反，則回到Step3到Step6的迭代式;

Step8：運(yùn)用ELM模型的最優(yōu)參數(shù)組合(w*,b*)對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行血清檢測(cè)[14]。

3 結(jié)果分析

3.1 建模流程

基于GWO改進(jìn)ELM模型的HBV血清檢測(cè)的建模流程可以描述：

(1)選擇血清樣本；

(2)采集HBV者和正常人的拉曼光譜；

(3)拉曼光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理；

(4)建立HBV血清GWO-ELM檢測(cè)模型；

(5)HBV血清檢測(cè)模型的驗(yàn)證。

3.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理技術(shù)

拉曼光譜的預(yù)處理技術(shù)主要有：一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、多元散射以及標(biāo)準(zhǔn)化的正態(tài)變化法[15]。原始數(shù)據(jù)在表1中顯示了各種預(yù)加工模式下的模型探測(cè)。

表1 不同預(yù)處理方式的建模檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Tab.1 Comparison of modeling test results with different pretreatment methods

由表1可知，使用多重散射修正(MSC)進(jìn)行模型檢驗(yàn)是最佳的[16]。故本文使用 MSC的拉曼光譜化學(xué)分析進(jìn)行了預(yù)處理，建模方法采用ELM模型。

3.3 有效特征波長(zhǎng)選擇

HBV拉曼光譜資料的特征：信號(hào)峰多，數(shù)據(jù)多，HBV血清檢測(cè)模型建立之前需要先對(duì)拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行特征波長(zhǎng)選擇。文中分別運(yùn)用全波段(FS)、連續(xù)投影法[17-18](SPA)和主成分分析(PCA)進(jìn)行乙肝血清近紅外拉曼光譜有效特征波長(zhǎng)選擇。在選擇了有效特性波長(zhǎng)之后，模型探測(cè)的結(jié)果比較如下。由表2可知，采用持續(xù)投射方法進(jìn)行的 HBV血清模型試驗(yàn)效果最佳。

表2 波長(zhǎng)選擇結(jié)果對(duì)比Tab.2 Comparison of wavelength selection results

由表3可知，第1個(gè)主成分(PC1)的貢獻(xiàn)率為64.84%；第2個(gè)主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率為26.24%，前2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了91.07%。

表3 PCA前7個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率和累計(jì)貢獻(xiàn)率Tab.3 Contribution rate and cumulative contribution rate of the first seven principal components of PCA

從圖5可以看出，主成分?jǐn)?shù)為8時(shí)，HBV血清檢測(cè)的正確率最高，均方根誤差最小。

圖5 SPA有效特征波長(zhǎng)選擇結(jié)果Fig.5 SPA effective characteristic wavelength selection results

3.4 不同模型對(duì)比

為了驗(yàn)證GWO-ELM模型的有效性和可靠性，將GWO-ELM與PSO-ELM、GA-ELM和ELM模型進(jìn)行對(duì)比[19]。ELM模型的激活函數(shù)為sig函數(shù)，為確定隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)，初始隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)為1時(shí)，其不斷增加，直到隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)為50；不同隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)的HBV血清檢測(cè)準(zhǔn)確率如圖6所示。

圖6 隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)與準(zhǔn)確率關(guān)系圖Fig.6 Relationship between number of hidden layer nodes and accuracy

從圖6可以看出，SPA-ELM模型的隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)為30時(shí)，HBV血清檢測(cè)的準(zhǔn)確率最高，故文中ELM模型的隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)設(shè)定為30。在表4中給出了各種模式的校正集合和預(yù)報(bào)集合的評(píng)估準(zhǔn)確率。

由表4可知，在校正集和預(yù)測(cè)集上，GWO-ELM的準(zhǔn)確率分別為92.02%和81.69%，優(yōu)于PSO-ELM的90.80%和78.87%；GA-ELM的89.57%和76.06%以及ELM的88.96%和74.65%。與ELM模型相比，GWO-ELM的HBV血清檢測(cè)的準(zhǔn)確率分別提高了3.06%和7.04%，說(shuō)明GWO-ELM有效提高了HBV血清檢測(cè)的精度。

表4 不同模型評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.4 Evaluation results of different models

為了進(jìn)一步說(shuō)明GWO-ELM對(duì)HBV血清檢測(cè)的有效性，將GWO-ELM與隨機(jī)森林回歸(RFR)、網(wǎng)格搜索優(yōu)化隨機(jī)森林回歸(Grid-RFR)和粒子群優(yōu)化隨機(jī)森林回歸(PSO-RFR)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)比結(jié)果如表5所示。

表5 不同算法HBV血清檢測(cè)結(jié)果Tab.5 HBV serum detection results of different algorithms

由表5可知，在校正集和測(cè)試集上，GWO-ELM模型HBV血清檢測(cè)的準(zhǔn)確率最高。在評(píng)價(jià)指標(biāo)準(zhǔn)確率、精準(zhǔn)率、召回率和Fscore4個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)上，GWO-ELM均優(yōu)于PSO-RFR模型、Grid-RFR模型和RFR模型，從而驗(yàn)證了GWO-ELM進(jìn)行HBV血清檢測(cè)的有效性和可靠性，為HBV血清檢測(cè)提供了新的方法。

4 討論

拉曼光譜技術(shù)是一種無(wú)創(chuàng)、無(wú)損的光學(xué)工具，可用于通過(guò)激光激發(fā)生物標(biāo)本的振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)光譜信息來(lái)研究生物分子的光譜分布。血清拉曼光譜分析已被用于檢測(cè)核酸，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的存在。拉曼光譜的形狀和趨勢(shì)可能有助于識(shí)別這些分子成分的變化。一些光譜指紋可能與對(duì)疾病診斷和分類(lèi)有用的特定生物標(biāo)志物相關(guān)聯(lián)。早期研究還表明，使用血清拉曼光譜分析診斷HBV可能是可行的。本研究分析了2例 HBV病人的血樣和2例正常人群的血樣進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)。分別運(yùn)用全波段(FS)、連續(xù)投影法(SPA)和主成分分析(PCA)進(jìn)行HBV血清近紅外拉曼光譜有效特征波長(zhǎng)選擇。從模型探測(cè)的結(jié)果可知，采用連續(xù)投射方法進(jìn)行的 HBV血清模型試驗(yàn)效果最佳。機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)已被用于分析高維拉曼光譜數(shù)據(jù)。且先前的研究表明，在識(shí)別性能方面，SPA算法優(yōu)于其他傳統(tǒng)分類(lèi)算法，例如FS，PCA等。

通過(guò)將ELM-GWO與優(yōu)化方法集成，可以實(shí)現(xiàn)最佳的輸入權(quán)重和隱藏層偏差，從而保證最佳的ELM/GWO性能，從而有效識(shí)別HBV血清。極限學(xué)習(xí)機(jī)(ELM)是近年來(lái)提出的一種新算法，它基于單隱層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(SLFN)，解決了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中隱含層數(shù)難以確定的問(wèn)題，且ELM具有學(xué)習(xí)速度更快，泛化能力好，產(chǎn)生獨(dú)特的最優(yōu)解等特點(diǎn)。因此，ELM最受歡迎的改進(jìn)之一是灰狼優(yōu)化-極限學(xué)習(xí)機(jī)(GWO-ELM)，其中GWO集成到ELM中，以獲得最佳的輸入權(quán)重和偏差。GWO是通過(guò)研究灰狼的狩獵行為而建立的，其概念簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)，只需要很少的編碼行，允許許多人利用它。與其他進(jìn)化算法相比，GWO在調(diào)節(jié)參數(shù)方面具有更高的計(jì)算效率。這種整合 (GWO-ELM) 的有效性已在本文中所證實(shí)，該方法可以有效地改善 HBV的血清學(xué)診斷的正確性。

5 結(jié)語(yǔ)

為了提高HBV血清檢測(cè)的精度，基于連續(xù)投射技術(shù)的特點(diǎn)波長(zhǎng)篩選和灰狼優(yōu)化算法對(duì)極限學(xué)習(xí)機(jī)的血清檢測(cè)模式的改進(jìn)。為提高ELM模型的性能，運(yùn)用GWO算法優(yōu)化選擇ELM模型的輸入權(quán)值和隱含層偏置，本文介紹了一種基于GWO-ELM技術(shù)的連續(xù)投射技術(shù)進(jìn)行特征波長(zhǎng)篩選的HBV血清學(xué)研究。與PSO-ELM、GA-ELM和ELM相比，利用GWO-ELM技術(shù)建立的 HBV血清檢測(cè)方法能有效地改善 HBV的血清學(xué)診斷的正確性，為HBV血清檢測(cè)提供了新的方法。