王水文，鄧厚斌，劉曉雯

(上海長(zhǎng)征醫(yī)院，上海 200003)

在進(jìn)行手術(shù)時(shí)，有一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是止血，止血對(duì)于患者的安危和手術(shù)的成功都起到了很大的作用[1]。在進(jìn)行腦、脾、腎、肝等臟器手術(shù)，腫瘤等血管薄弱的病變組織手術(shù)，凝血機(jī)能異常患者的手術(shù)時(shí)，僅僅采用縫合、結(jié)扎、電烙等機(jī)械止血方法是不夠的，還需要配合使用一些止血材料才能達(dá)到良好的止血效果[2]。

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)水平的不斷進(jìn)步，止血方法和止血材料都有了很大的發(fā)展，醫(yī)用領(lǐng)域常用的止血材料有纖維蛋白膠，明膠海綿，凝血酶，氧化纖維素等[3-4]，這些材料與結(jié)扎、紗布等傳統(tǒng)的止血方法和材料相比，止血效果明顯更好，但是這些止血材料還是存在一些副作用和缺點(diǎn)，且止血速度不夠快。纖維蛋白膠屬于血液制品，有傳播血源性傳染病的風(fēng)險(xiǎn)，并且為了防止產(chǎn)生過敏反應(yīng)或形成血栓不能直接注入血管內(nèi)，另外纖維蛋白膠對(duì)于較大靜脈出血、動(dòng)脈出血的止血作用并不理想。使用明膠止血時(shí)，明膠很可能造成傷口感染，并且由于粘附力較差比較容易脫落，用在內(nèi)臟止血時(shí)需要進(jìn)行縫合固定，另外明膠海綿的止血作用需要依靠體內(nèi)的凝血因子，所以如果患者存在凝血機(jī)制障礙時(shí)，用這種止血材料止血并不能起到良好的止血效果[5-6]。凝血酶盡管能夠有效促進(jìn)血小板的聚集，但是其價(jià)格較為昂貴。氧化纖維素具有酸性，容易引起神經(jīng)纖維的變性，并且其具有很強(qiáng)大額吸水性，如果受潮了會(huì)對(duì)其止血作用造成影響。膠原止血材料則不存在這些缺點(diǎn)，其止血效果好，止血時(shí)間短，且沒有明顯的副作用，是一種非常理想的止血材料[7]。膠原能夠減少血栓的形成時(shí)間，加速血小板的聚集，同時(shí)血小板在膠原的刺激下，會(huì)釋放各種凝血因子等分泌物以及亞細(xì)胞顆粒，血小板所釋放的凝血因子會(huì)附著在受損的血管上，對(duì)受傷血管進(jìn)行堵塞，從而起到止血的作用[8-9]。但是只單獨(dú)使用膠原對(duì)傷口進(jìn)行止血，會(huì)因?yàn)檩^差的吸水能力影響血液濃縮效果，進(jìn)而降低止血效率。所以現(xiàn)在使用的膠原止血材料都是和其他材料一起復(fù)合制備成的，由于鈣離子具有較為簡(jiǎn)單的空間結(jié)構(gòu)，能夠很容易地控制和清除，并且鈣離子濃度的升高有利于血小板的活化，而血小板的活化、粘附、聚集和血栓形成的過程均需要鈣離子的參與。透明質(zhì)酸是一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)糖胺聚糖，透明質(zhì)酸的水溶液具有較強(qiáng)的粘性，可以對(duì)體內(nèi)分子和細(xì)胞的滲透起到控制作用，同時(shí)影響細(xì)胞的分化，同時(shí)其免疫原性低，顯著降低異體反應(yīng)和引發(fā)炎癥的可能性，同時(shí)透明質(zhì)酸還具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性[10]。這里我們用氯化鈣、透明質(zhì)酸和膠原制備復(fù)合膠原止血材料，同時(shí)對(duì)其使用效果進(jìn)行了研究分析。

1 復(fù)合膠原止血材料的提取、制備

1.1 膠原的提取

將5 g風(fēng)干的牛跟腱剪碎，并溶于濃度0.5 mol/L的乙酸溶液，取胃蛋白酶2.5 g加入其中；之后將溶液攪拌均勻，使用離心機(jī)以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，時(shí)間30 min。將上層清液取出，向其中加入50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的氯化鈉溶液，同樣以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min。然后，取其沉淀物大概100 mL，加入400 mL蒸餾水，15 mL乙酸，放入透析袋里面，透析4 d，并且每天都要換水，進(jìn)行透析；完成后進(jìn)行冷凍干燥處理，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 膠原的制備

在0.5 mol/L乙酸溶液中溶入提取好的膠原冷凍產(chǎn)物，取透明質(zhì)酸0.2 g后攪拌均勻， 然后將溶液中的氣泡排出后倒入模具，控制溶液厚度1～5 mm，進(jìn)行冷凍干燥處理，即可獲得防粘連層。另外,再取相同質(zhì)量的膠原冷凍產(chǎn)物，將其在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的乙酸溶液中溶解，再向其中加入0.5 g甘油，氯化鈣0.1 g，攪拌均勻后倒在防粘連層表面，即可獲得厚度為2～10 mm的復(fù)合膠原止血材料(見圖1)。取50 mmol/L碳化二亞胺的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，將凍干海綿浸入其中，常溫浸泡4 h，讓其反應(yīng)完全后使用離子水沖洗后凍干，再用60Co對(duì)其進(jìn)行輻照消毒，最后保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 復(fù)合膠原海綿止血材料Fig.1 Composite collagen sponge hemostatic material

2 試驗(yàn)材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清、蘇木精、甲醛；伊紅等組織切片、染色用試劑、L-929小鼠成纖維細(xì)胞，普通級(jí)健康成年雄性新西蘭大白兔18只，質(zhì)量約2 kg/只。

紫外分光光度計(jì)、冷凍干燥機(jī)、精密酸度計(jì)、電子天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥、多用振蕩器、水平搖床、磁力攪拌器和掃描電子顯微鏡。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1對(duì)復(fù)合膠原止血材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)

取3 cm×3 cm的復(fù)合膠原止血海綿浸入10 mL的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)低糖完全培養(yǎng)液；之后，在溫度37 ℃的孵箱內(nèi)孵育48 h。然后，取其上層清液，并進(jìn)行2倍稀釋。

按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。取L-929細(xì)胞，然后將其胰蛋白酶?jìng)鞔囵B(yǎng)至第3代，細(xì)胞濃度4×107cfu/L鋪板，每孔100 μL，將其分為3組進(jìn)行培養(yǎng)。陰性對(duì)照組加入200 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組加入200 μL的質(zhì)量濃度64 g/L的苯酚溶液，試驗(yàn)組加入200 μL復(fù)合膠原海綿止血材料浸提液。將3組進(jìn)行細(xì)胞貼壁培養(yǎng)1、3和6 d后，向其加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)在波長(zhǎng)490 nm下的吸光值，并求平均值。在每孔中加入20 μL質(zhì)量濃度5 g/L的噻唑藍(lán)(MTT)，在溫度37 ℃條件下孵育4 h，然后去除上層液體并控干，再向每孔中加入DMSO150 μL，均勻混合10 min。最后，對(duì)其進(jìn)行吸光值測(cè)定，將測(cè)定的吸光值記作A值。

計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增值率，計(jì)算公式：

a=實(shí)驗(yàn)組A-陽性對(duì)照組A

b=陰性對(duì)照組A-陽性對(duì)照組A

細(xì)胞相對(duì)增值率=a/b×100%

經(jīng)過計(jì)算后，如果相對(duì)增值率大于等于100%，表明材料的等級(jí)為0級(jí)，即材料沒有細(xì)胞毒性，材料合格；如果計(jì)算結(jié)果處于75%～99%，表明材料等級(jí)為1級(jí)，即材料的細(xì)胞毒性極低，材料合格。

檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)2、4和7 d后，試驗(yàn)組的A值與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P>0.05)；與陽性對(duì)照組比較，其A值均高于陽性對(duì)照組(P<0.05)，具體結(jié)果如表1所示。

表1 MTT法檢測(cè)復(fù)合膠原止血材料的細(xì)胞毒性Tab.1 MTT assay was used to detect the cytotoxicity of composite collagen hemostatic materials

由表1可知，在培養(yǎng)第2、4、7 d后的相對(duì)增值率分別為(98.0±8.2)%、(99.0±2.5)%和(96.0±3.4)%，表明該復(fù)合膠原止血材料的細(xì)胞毒性為1級(jí)，屬于合格材料。

2.2.2對(duì)復(fù)合膠原止血材料進(jìn)行體外凝血活性檢測(cè)

選擇BIC凝血指數(shù)做體外測(cè)試，取3只相同的燒杯，分別加入相同量的進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)止血材料，抽取200 μL家兔抗凝全血，向燒杯中緩慢滴入，再向其中加入濃度0.2 mol/L的氯化鈣溶液20 μL；啟動(dòng)血液凝固，靜止5 min，取去離子水25 mL加入3個(gè)燒杯中，保持37 ℃恒溫條件下靜止5 min，然后將溶液取出，再用波長(zhǎng)540 nm的紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光值。另外，取血液0.1 mL，用水稀釋至25 mL，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，A值設(shè)定為參考值100。根據(jù)計(jì)算公式即可獲得凝血數(shù)值BIC，BIC=100×樣品A/參考A，凝血效果越好則凝血指數(shù)BIC的數(shù)值越低，將每個(gè)樣品都進(jìn)行5次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合膠原海綿止血材料的體外凝血指數(shù)為18.28±52.145，進(jìn)口止血材料和國(guó)產(chǎn)止血材料的凝血指數(shù)分別為23.145±1.142、3.126±2.275，表明復(fù)合膠原止血材料的凝血指數(shù)顯著低于國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口止血材料，說明復(fù)合膠原止血材料的體外凝血效果更好。

2.2.3對(duì)復(fù)合膠原止血材料進(jìn)行體內(nèi)止血效果檢測(cè)

選擇18只新西蘭大白兔，并隨機(jī)分為3組，對(duì)這3組新西蘭大白兔分別使用進(jìn)口、國(guó)內(nèi)止血材料和復(fù)合膠原止血材料。將新西蘭兔麻醉后仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，然后一層一層地將其腹部縱向切開，用無菌紗布將組織液和血液吸干。暴露出其肝臟部位，在其右中葉進(jìn)行肝葉鉆透，等待25 s，讓其自由出血；然后將止血材料覆蓋在鉆孔上，并快速將已知質(zhì)量的無菌紗布鋪在止血材料上，再將鐵片壓在無菌紗布上，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔40 s觀察1次；如果沒有血液滲出了，表示血已止住，將時(shí)間記錄下來，記作出血時(shí)間。最后，對(duì)紗布的質(zhì)量進(jìn)行稱量，將紗布的質(zhì)量差記作出血量。

以新西蘭兔標(biāo)準(zhǔn)肝創(chuàng)模型中的止血時(shí)間和出血量作為考察指標(biāo)，具體結(jié)果如表2所示。

表2 復(fù)合膠原的止血效果比較Tab.2 Comparison of hemostatic effects of composite collagen

由表2可知，相比國(guó)產(chǎn)止血材料和進(jìn)口止血材料組，試驗(yàn)組的止血時(shí)間和出血量都明顯更低(P<0.05)，且BIC測(cè)試結(jié)果與此次試驗(yàn)結(jié)果一致；試驗(yàn)組的各項(xiàng)指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口止血材料組相比，其止血時(shí)間分別縮短了65.8%和27%，出血量分別減少了100%和25%，且差異均顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，復(fù)合膠原止血材料不僅能夠顯著減少失血量，還可大大縮短傷口的止血時(shí)間，具有很高的臨床止血應(yīng)用價(jià)值。

3 討論

3.1 止血材料

根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，絕大部分創(chuàng)傷患者都由于失血過多死亡，所以現(xiàn)在急需一種快速有效的止血材料，醫(yī)學(xué)家和材料學(xué)家們都在致力于研發(fā)出防粘連的新型止血材料[13]。如果止血材料在止血和防粘的同時(shí)，可以有效促進(jìn)損傷組織的修復(fù)，那么將更加適合于臨床應(yīng)用[14]。傳統(tǒng)的止血方法都有或多或少的缺陷，因此還需要進(jìn)一步研究開發(fā)出新型高效的止血材料和方法，優(yōu)良的止血材料需要止血迅速，并且無毒、無抗原性，對(duì)組織愈合不造成任何影響，同時(shí)不會(huì)增加感染風(fēng)險(xiǎn)，并且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠[15]?，F(xiàn)有的國(guó)內(nèi)外止血材料都還沒有達(dá)到這個(gè)水平，還需要科研人員的進(jìn)一步開發(fā)研究。

3.2 膠原海綿止血材料

隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷提高，關(guān)于止血材料的研究也在飛速發(fā)展，也陸續(xù)研發(fā)出了多種不同的止血材料，目前常用的止血材料有氧化再生纖維素、膠原海綿、殼聚糖、可吸收明膠海綿等等。近些年來關(guān)于膠原蛋白止血材料的研究一直都是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，并且取得了一定的研究成果，開發(fā)了諸如片狀、粉狀、棉絮狀、海綿狀及纖絲狀等多種劑型[16-17]。海綿狀的材料對(duì)于淺而寬的創(chuàng)面止血效果較好，而棉絮狀和粉末狀的材料對(duì)于深而窄的創(chuàng)面的止血效要更好一些。目前使用的膠原止血海綿多是通過冷凍干燥技術(shù)來制備的，其整體呈三維形態(tài)，表面結(jié)構(gòu)完整，具有較好的止血效果，另外通過調(diào)節(jié)預(yù)凍溫度，能夠改變材料的孔徑結(jié)構(gòu)如圖2所示。實(shí)現(xiàn)對(duì)材料微結(jié)構(gòu)的控制[18]。當(dāng)然，也有一定缺陷，膠原經(jīng)過人工處理后，在后期的自然狀態(tài)下很難保存，同時(shí)也會(huì)降低膠原的各項(xiàng)性能，因此近些年來由許多研究人員都嘗試通過改性研究提升膠原的性能，希望將其各項(xiàng)性能進(jìn)一步優(yōu)化。

圖2 一種具有孔隙大小自適應(yīng)調(diào)節(jié)的膠原海綿Fig.2 Collagen sponge with adaptive adjustment of pore size

3.3 復(fù)合膠原止血材料的制備

目前膠原的提取方法有2種：一種是生物化學(xué)工程合成法；還有一種是生物材料提取法，生物材料提取法的技術(shù)路線已經(jīng)相對(duì)成熟，比較常用的有堿法、酸法、酶法以及酶酸混合法等方法。酸法、堿法和酶法還存在一些缺陷，容易使膠原三螺旋結(jié)構(gòu)破壞，使膠原產(chǎn)生少量的變性；酶酸混合法則可以改善單一方法中存在的問題，而且酶酸混合法提取出來的膠原純度更佳。膠原都是從生物材料中提取的，會(huì)造成內(nèi)部共價(jià)鍵的破壞，影響膠原材料的力學(xué)強(qiáng)度，會(huì)使得其更快的分解，因?yàn)樾枰玫浇宦?lián)劑[19]。物理交聯(lián)盡管可以避免殘留外源有毒試劑，但是物理交聯(lián)法這種方法的交聯(lián)不夠徹底，交聯(lián)度低，化學(xué)交聯(lián)需要引入外源有毒試劑，交聯(lián)后會(huì)有有毒試劑的殘留，清除起來十分困難。

現(xiàn)有的且使用較多的都是一些高分子聚合物等物質(zhì)與膠原復(fù)合而成的止血材料。但還是存在一些問題，比如韌性不太理想，膠原在吸收了血液后有可能和與其混合的其他材料形成相互影響，進(jìn)而導(dǎo)致材料的止血效果減弱[7]。所以需要利用物理或者化學(xué)方法，使膠原材料與多種其他成分進(jìn)行復(fù)合，制成新型的止血材料。透明質(zhì)酸是類糖胺聚糖物質(zhì)，在組織工程中的應(yīng)用十分廣泛。有學(xué)者交聯(lián)了水溶碳化二酰亞胺與多孔的透明質(zhì)酸/膠原復(fù)合膜，透明質(zhì)酸和膠原之間由于碳化二酰亞胺的作用下可以形成酯鍵和酰胺鍵，進(jìn)而達(dá)到交聯(lián)的目的[20]。

3.4 復(fù)合膠原止血材料的應(yīng)用

透明質(zhì)酸可以控制膠原成纖維的形成，制備而成的膠原復(fù)合止血材料細(xì)胞毒性為1級(jí)，屬于合格產(chǎn)品。觀察發(fā)現(xiàn)復(fù)合膠原止血材料成疏松的多孔海綿狀，其微結(jié)構(gòu)均勻。通過對(duì)比與國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口止血材料，發(fā)現(xiàn)全血與復(fù)合膠原止血材料能夠進(jìn)行互相促進(jìn)，促進(jìn)形成交替而海綿狀，與血液形成了良好的關(guān)系。在體內(nèi)觀察試驗(yàn)中，使用復(fù)合膠原止血材料后，肝缺損的止血時(shí)間和出血量都有了很大的改善，同時(shí)止血材料與傷口的粘附更加緊密，有效地避免了其他組織與傷口的粘連。綜上所述，復(fù)合膠原止血材料具有良好的止血效果，解決了一些傳統(tǒng)止血材料所存在的問題，其在醫(yī)用領(lǐng)域中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)語

隨著現(xiàn)代科學(xué)和醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，對(duì)止血材料的要求在不斷提高，這就需要科研人員開發(fā)出止血效果更好的新型多功能止血材料，理想的止血材料首先需要具有優(yōu)良的止血效果，同時(shí)沒有明顯的副作用，成本低廉容易獲得。而復(fù)合膠原止血材料剛好符合這些要求，另外，膠原在體內(nèi)可以自行降解，不需要另外拆除，使用起來十分方便。隨著對(duì)復(fù)合膠原止血材料的進(jìn)一步研究開發(fā)，相信其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍會(huì)越來越廣泛。