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        一種改性復(fù)合膠原止血材料的制備及試驗(yàn)

        2023-01-05 07:52:28王水文鄧厚斌劉曉雯
        粘接 2022年12期
        關(guān)鍵詞:透明質(zhì)膠原海綿

        王水文,鄧厚斌,劉曉雯

        (上海長(zhǎng)征醫(yī)院,上海 200003)

        在進(jìn)行手術(shù)時(shí),有一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是止血,止血對(duì)于患者的安危和手術(shù)的成功都起到了很大的作用[1]。在進(jìn)行腦、脾、腎、肝等臟器手術(shù),腫瘤等血管薄弱的病變組織手術(shù),凝血機(jī)能異常患者的手術(shù)時(shí),僅僅采用縫合、結(jié)扎、電烙等機(jī)械止血方法是不夠的,還需要配合使用一些止血材料才能達(dá)到良好的止血效果[2]。

        隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)水平的不斷進(jìn)步,止血方法和止血材料都有了很大的發(fā)展,醫(yī)用領(lǐng)域常用的止血材料有纖維蛋白膠,明膠海綿,凝血酶,氧化纖維素等[3-4],這些材料與結(jié)扎、紗布等傳統(tǒng)的止血方法和材料相比,止血效果明顯更好,但是這些止血材料還是存在一些副作用和缺點(diǎn),且止血速度不夠快。纖維蛋白膠屬于血液制品,有傳播血源性傳染病的風(fēng)險(xiǎn),并且為了防止產(chǎn)生過敏反應(yīng)或形成血栓不能直接注入血管內(nèi),另外纖維蛋白膠對(duì)于較大靜脈出血、動(dòng)脈出血的止血作用并不理想。使用明膠止血時(shí),明膠很可能造成傷口感染,并且由于粘附力較差比較容易脫落,用在內(nèi)臟止血時(shí)需要進(jìn)行縫合固定,另外明膠海綿的止血作用需要依靠體內(nèi)的凝血因子,所以如果患者存在凝血機(jī)制障礙時(shí),用這種止血材料止血并不能起到良好的止血效果[5-6]。凝血酶盡管能夠有效促進(jìn)血小板的聚集,但是其價(jià)格較為昂貴。氧化纖維素具有酸性,容易引起神經(jīng)纖維的變性,并且其具有很強(qiáng)大額吸水性,如果受潮了會(huì)對(duì)其止血作用造成影響。膠原止血材料則不存在這些缺點(diǎn),其止血效果好,止血時(shí)間短,且沒有明顯的副作用,是一種非常理想的止血材料[7]。膠原能夠減少血栓的形成時(shí)間,加速血小板的聚集,同時(shí)血小板在膠原的刺激下,會(huì)釋放各種凝血因子等分泌物以及亞細(xì)胞顆粒,血小板所釋放的凝血因子會(huì)附著在受損的血管上,對(duì)受傷血管進(jìn)行堵塞,從而起到止血的作用[8-9]。但是只單獨(dú)使用膠原對(duì)傷口進(jìn)行止血,會(huì)因?yàn)檩^差的吸水能力影響血液濃縮效果,進(jìn)而降低止血效率。所以現(xiàn)在使用的膠原止血材料都是和其他材料一起復(fù)合制備成的,由于鈣離子具有較為簡(jiǎn)單的空間結(jié)構(gòu),能夠很容易地控制和清除,并且鈣離子濃度的升高有利于血小板的活化,而血小板的活化、粘附、聚集和血栓形成的過程均需要鈣離子的參與。透明質(zhì)酸是一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)糖胺聚糖,透明質(zhì)酸的水溶液具有較強(qiáng)的粘性,可以對(duì)體內(nèi)分子和細(xì)胞的滲透起到控制作用,同時(shí)影響細(xì)胞的分化,同時(shí)其免疫原性低,顯著降低異體反應(yīng)和引發(fā)炎癥的可能性,同時(shí)透明質(zhì)酸還具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性[10]。這里我們用氯化鈣、透明質(zhì)酸和膠原制備復(fù)合膠原止血材料,同時(shí)對(duì)其使用效果進(jìn)行了研究分析。

        1 復(fù)合膠原止血材料的提取、制備

        1.1 膠原的提取

        將5 g風(fēng)干的牛跟腱剪碎,并溶于濃度0.5 mol/L的乙酸溶液,取胃蛋白酶2.5 g加入其中;之后將溶液攪拌均勻,使用離心機(jī)以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心,時(shí)間30 min。將上層清液取出,向其中加入50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的氯化鈉溶液,同樣以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min。然后,取其沉淀物大概100 mL,加入400 mL蒸餾水,15 mL乙酸,放入透析袋里面,透析4 d,并且每天都要換水,進(jìn)行透析;完成后進(jìn)行冷凍干燥處理,保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 膠原的制備

        在0.5 mol/L乙酸溶液中溶入提取好的膠原冷凍產(chǎn)物,取透明質(zhì)酸0.2 g后攪拌均勻, 然后將溶液中的氣泡排出后倒入模具,控制溶液厚度1~5 mm,進(jìn)行冷凍干燥處理,即可獲得防粘連層。另外,再取相同質(zhì)量的膠原冷凍產(chǎn)物,將其在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的乙酸溶液中溶解,再向其中加入0.5 g甘油,氯化鈣0.1 g,攪拌均勻后倒在防粘連層表面,即可獲得厚度為2~10 mm的復(fù)合膠原止血材料(見圖1)。取50 mmol/L碳化二亞胺的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液,將凍干海綿浸入其中,常溫浸泡4 h,讓其反應(yīng)完全后使用離子水沖洗后凍干,再用60Co對(duì)其進(jìn)行輻照消毒,最后保存?zhèn)溆谩?/p>

        圖1 復(fù)合膠原海綿止血材料Fig.1 Composite collagen sponge hemostatic material

        2 試驗(yàn)材料與方法

        2.1 試驗(yàn)材料

        DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清、蘇木精、甲醛;伊紅等組織切片、染色用試劑、L-929小鼠成纖維細(xì)胞,普通級(jí)健康成年雄性新西蘭大白兔18只,質(zhì)量約2 kg/只。

        紫外分光光度計(jì)、冷凍干燥機(jī)、精密酸度計(jì)、電子天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥、多用振蕩器、水平搖床、磁力攪拌器和掃描電子顯微鏡。

        2.2 試驗(yàn)方法

        2.2.1對(duì)復(fù)合膠原止血材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)

        取3 cm×3 cm的復(fù)合膠原止血海綿浸入10 mL的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)低糖完全培養(yǎng)液;之后,在溫度37 ℃的孵箱內(nèi)孵育48 h。然后,取其上層清液,并進(jìn)行2倍稀釋。

        按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。取L-929細(xì)胞,然后將其胰蛋白酶?jìng)鞔囵B(yǎng)至第3代,細(xì)胞濃度4×107cfu/L鋪板,每孔100 μL,將其分為3組進(jìn)行培養(yǎng)。陰性對(duì)照組加入200 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液,陽性對(duì)照組加入200 μL的質(zhì)量濃度64 g/L的苯酚溶液,試驗(yàn)組加入200 μL復(fù)合膠原海綿止血材料浸提液。將3組進(jìn)行細(xì)胞貼壁培養(yǎng)1、3和6 d后,向其加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO),震蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)在波長(zhǎng)490 nm下的吸光值,并求平均值。在每孔中加入20 μL質(zhì)量濃度5 g/L的噻唑藍(lán)(MTT),在溫度37 ℃條件下孵育4 h,然后去除上層液體并控干,再向每孔中加入DMSO150 μL,均勻混合10 min。最后,對(duì)其進(jìn)行吸光值測(cè)定,將測(cè)定的吸光值記作A值。

        計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增值率,計(jì)算公式:

        a=實(shí)驗(yàn)組A-陽性對(duì)照組A

        b=陰性對(duì)照組A-陽性對(duì)照組A

        細(xì)胞相對(duì)增值率=a/b×100%

        經(jīng)過計(jì)算后,如果相對(duì)增值率大于等于100%,表明材料的等級(jí)為0級(jí),即材料沒有細(xì)胞毒性,材料合格;如果計(jì)算結(jié)果處于75%~99%,表明材料等級(jí)為1級(jí),即材料的細(xì)胞毒性極低,材料合格。

        檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)2、4和7 d后,試驗(yàn)組的A值與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P>0.05);與陽性對(duì)照組比較,其A值均高于陽性對(duì)照組(P<0.05),具體結(jié)果如表1所示。

        表1 MTT法檢測(cè)復(fù)合膠原止血材料的細(xì)胞毒性Tab.1 MTT assay was used to detect the cytotoxicity of composite collagen hemostatic materials

        由表1可知,在培養(yǎng)第2、4、7 d后的相對(duì)增值率分別為(98.0±8.2)%、(99.0±2.5)%和(96.0±3.4)%,表明該復(fù)合膠原止血材料的細(xì)胞毒性為1級(jí),屬于合格材料。

        2.2.2對(duì)復(fù)合膠原止血材料進(jìn)行體外凝血活性檢測(cè)

        選擇BIC凝血指數(shù)做體外測(cè)試,取3只相同的燒杯,分別加入相同量的進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)止血材料,抽取200 μL家兔抗凝全血,向燒杯中緩慢滴入,再向其中加入濃度0.2 mol/L的氯化鈣溶液20 μL;啟動(dòng)血液凝固,靜止5 min,取去離子水25 mL加入3個(gè)燒杯中,保持37 ℃恒溫條件下靜止5 min,然后將溶液取出,再用波長(zhǎng)540 nm的紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光值。另外,取血液0.1 mL,用水稀釋至25 mL,在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,A值設(shè)定為參考值100。根據(jù)計(jì)算公式即可獲得凝血數(shù)值BIC,BIC=100×樣品A/參考A,凝血效果越好則凝血指數(shù)BIC的數(shù)值越低,將每個(gè)樣品都進(jìn)行5次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

        結(jié)果發(fā)現(xiàn),復(fù)合膠原海綿止血材料的體外凝血指數(shù)為18.28±52.145,進(jìn)口止血材料和國(guó)產(chǎn)止血材料的凝血指數(shù)分別為23.145±1.142、3.126±2.275,表明復(fù)合膠原止血材料的凝血指數(shù)顯著低于國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口止血材料,說明復(fù)合膠原止血材料的體外凝血效果更好。

        2.2.3對(duì)復(fù)合膠原止血材料進(jìn)行體內(nèi)止血效果檢測(cè)

        選擇18只新西蘭大白兔,并隨機(jī)分為3組,對(duì)這3組新西蘭大白兔分別使用進(jìn)口、國(guó)內(nèi)止血材料和復(fù)合膠原止血材料。將新西蘭兔麻醉后仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上,然后一層一層地將其腹部縱向切開,用無菌紗布將組織液和血液吸干。暴露出其肝臟部位,在其右中葉進(jìn)行肝葉鉆透,等待25 s,讓其自由出血;然后將止血材料覆蓋在鉆孔上,并快速將已知質(zhì)量的無菌紗布鋪在止血材料上,再將鐵片壓在無菌紗布上,同時(shí)開始計(jì)時(shí),每隔40 s觀察1次;如果沒有血液滲出了,表示血已止住,將時(shí)間記錄下來,記作出血時(shí)間。最后,對(duì)紗布的質(zhì)量進(jìn)行稱量,將紗布的質(zhì)量差記作出血量。

        以新西蘭兔標(biāo)準(zhǔn)肝創(chuàng)模型中的止血時(shí)間和出血量作為考察指標(biāo),具體結(jié)果如表2所示。

        表2 復(fù)合膠原的止血效果比較Tab.2 Comparison of hemostatic effects of composite collagen

        由表2可知,相比國(guó)產(chǎn)止血材料和進(jìn)口止血材料組,試驗(yàn)組的止血時(shí)間和出血量都明顯更低(P<0.05),且BIC測(cè)試結(jié)果與此次試驗(yàn)結(jié)果一致;試驗(yàn)組的各項(xiàng)指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口止血材料組相比,其止血時(shí)間分別縮短了65.8%和27%,出血量分別減少了100%和25%,且差異均顯著(P<0.05)。結(jié)果表明,復(fù)合膠原止血材料不僅能夠顯著減少失血量,還可大大縮短傷口的止血時(shí)間,具有很高的臨床止血應(yīng)用價(jià)值。

        3 討論

        3.1 止血材料

        根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,絕大部分創(chuàng)傷患者都由于失血過多死亡,所以現(xiàn)在急需一種快速有效的止血材料,醫(yī)學(xué)家和材料學(xué)家們都在致力于研發(fā)出防粘連的新型止血材料[13]。如果止血材料在止血和防粘的同時(shí),可以有效促進(jìn)損傷組織的修復(fù),那么將更加適合于臨床應(yīng)用[14]。傳統(tǒng)的止血方法都有或多或少的缺陷,因此還需要進(jìn)一步研究開發(fā)出新型高效的止血材料和方法,優(yōu)良的止血材料需要止血迅速,并且無毒、無抗原性,對(duì)組織愈合不造成任何影響,同時(shí)不會(huì)增加感染風(fēng)險(xiǎn),并且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠[15]?,F(xiàn)有的國(guó)內(nèi)外止血材料都還沒有達(dá)到這個(gè)水平,還需要科研人員的進(jìn)一步開發(fā)研究。

        3.2 膠原海綿止血材料

        隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷提高,關(guān)于止血材料的研究也在飛速發(fā)展,也陸續(xù)研發(fā)出了多種不同的止血材料,目前常用的止血材料有氧化再生纖維素、膠原海綿、殼聚糖、可吸收明膠海綿等等。近些年來關(guān)于膠原蛋白止血材料的研究一直都是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn),并且取得了一定的研究成果,開發(fā)了諸如片狀、粉狀、棉絮狀、海綿狀及纖絲狀等多種劑型[16-17]。海綿狀的材料對(duì)于淺而寬的創(chuàng)面止血效果較好,而棉絮狀和粉末狀的材料對(duì)于深而窄的創(chuàng)面的止血效要更好一些。目前使用的膠原止血海綿多是通過冷凍干燥技術(shù)來制備的,其整體呈三維形態(tài),表面結(jié)構(gòu)完整,具有較好的止血效果,另外通過調(diào)節(jié)預(yù)凍溫度,能夠改變材料的孔徑結(jié)構(gòu)如圖2所示。實(shí)現(xiàn)對(duì)材料微結(jié)構(gòu)的控制[18]。當(dāng)然,也有一定缺陷,膠原經(jīng)過人工處理后,在后期的自然狀態(tài)下很難保存,同時(shí)也會(huì)降低膠原的各項(xiàng)性能,因此近些年來由許多研究人員都嘗試通過改性研究提升膠原的性能,希望將其各項(xiàng)性能進(jìn)一步優(yōu)化。

        圖2 一種具有孔隙大小自適應(yīng)調(diào)節(jié)的膠原海綿Fig.2 Collagen sponge with adaptive adjustment of pore size

        3.3 復(fù)合膠原止血材料的制備

        目前膠原的提取方法有2種:一種是生物化學(xué)工程合成法;還有一種是生物材料提取法,生物材料提取法的技術(shù)路線已經(jīng)相對(duì)成熟,比較常用的有堿法、酸法、酶法以及酶酸混合法等方法。酸法、堿法和酶法還存在一些缺陷,容易使膠原三螺旋結(jié)構(gòu)破壞,使膠原產(chǎn)生少量的變性;酶酸混合法則可以改善單一方法中存在的問題,而且酶酸混合法提取出來的膠原純度更佳。膠原都是從生物材料中提取的,會(huì)造成內(nèi)部共價(jià)鍵的破壞,影響膠原材料的力學(xué)強(qiáng)度,會(huì)使得其更快的分解,因?yàn)樾枰玫浇宦?lián)劑[19]。物理交聯(lián)盡管可以避免殘留外源有毒試劑,但是物理交聯(lián)法這種方法的交聯(lián)不夠徹底,交聯(lián)度低,化學(xué)交聯(lián)需要引入外源有毒試劑,交聯(lián)后會(huì)有有毒試劑的殘留,清除起來十分困難。

        現(xiàn)有的且使用較多的都是一些高分子聚合物等物質(zhì)與膠原復(fù)合而成的止血材料。但還是存在一些問題,比如韌性不太理想,膠原在吸收了血液后有可能和與其混合的其他材料形成相互影響,進(jìn)而導(dǎo)致材料的止血效果減弱[7]。所以需要利用物理或者化學(xué)方法,使膠原材料與多種其他成分進(jìn)行復(fù)合,制成新型的止血材料。透明質(zhì)酸是類糖胺聚糖物質(zhì),在組織工程中的應(yīng)用十分廣泛。有學(xué)者交聯(lián)了水溶碳化二酰亞胺與多孔的透明質(zhì)酸/膠原復(fù)合膜,透明質(zhì)酸和膠原之間由于碳化二酰亞胺的作用下可以形成酯鍵和酰胺鍵,進(jìn)而達(dá)到交聯(lián)的目的[20]。

        3.4 復(fù)合膠原止血材料的應(yīng)用

        透明質(zhì)酸可以控制膠原成纖維的形成,制備而成的膠原復(fù)合止血材料細(xì)胞毒性為1級(jí),屬于合格產(chǎn)品。觀察發(fā)現(xiàn)復(fù)合膠原止血材料成疏松的多孔海綿狀,其微結(jié)構(gòu)均勻。通過對(duì)比與國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口止血材料,發(fā)現(xiàn)全血與復(fù)合膠原止血材料能夠進(jìn)行互相促進(jìn),促進(jìn)形成交替而海綿狀,與血液形成了良好的關(guān)系。在體內(nèi)觀察試驗(yàn)中,使用復(fù)合膠原止血材料后,肝缺損的止血時(shí)間和出血量都有了很大的改善,同時(shí)止血材料與傷口的粘附更加緊密,有效地避免了其他組織與傷口的粘連。綜上所述,復(fù)合膠原止血材料具有良好的止血效果,解決了一些傳統(tǒng)止血材料所存在的問題,其在醫(yī)用領(lǐng)域中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

        3 結(jié)語

        隨著現(xiàn)代科學(xué)和醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展,對(duì)止血材料的要求在不斷提高,這就需要科研人員開發(fā)出止血效果更好的新型多功能止血材料,理想的止血材料首先需要具有優(yōu)良的止血效果,同時(shí)沒有明顯的副作用,成本低廉容易獲得。而復(fù)合膠原止血材料剛好符合這些要求,另外,膠原在體內(nèi)可以自行降解,不需要另外拆除,使用起來十分方便。隨著對(duì)復(fù)合膠原止血材料的進(jìn)一步研究開發(fā),相信其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍會(huì)越來越廣泛。

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