王冠玉，任 怡，孫桂菊

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室/營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，江蘇南京 210009）

0 引言

植物多糖（Plant Polysaccharide）就是植物細(xì)胞的代謝過程中所產(chǎn)生的一類生物大分子[1]。植物多糖成分常存在于藥食同源的植物和某些藥用植物或傳統(tǒng)中藥中[2]。有些植物多糖有較強的生物學(xué)活性，對人類的健康和一些疾病的預(yù)防有著重要作用[3]。植物多糖多具備降糖降脂[4]、抗氧化[5-6]、抗腫瘤[7-9]、抗輻射等功能，還有一些植物多糖可以調(diào)節(jié)人體免疫功能，有助于增強機體免疫力[10-12]。

枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharide，LBP）是提取自我國藥食兩用中草藥枸杞中的重要活性成分[13]。研究表明，枸杞多糖在抗癌、降糖降脂、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等方面都有著良好的效果[14]。課題組前期在枸杞多糖的降糖降脂功能方面已經(jīng)開展了大量研究，探討了LBP 在大鼠的體內(nèi)對其組織細(xì)胞的代謝的影響及相關(guān)分布，針對LBP 有著良好的研究基礎(chǔ)[15]。研究希望進(jìn)一步發(fā)掘LBP 在增強免疫力方面的作用，為深入研究和利用LBP 等多糖類物質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。靈芝孢子粉（Ganoderma lucidumSpore Powder，GLSP）是靈芝成熟了以后釋放的比較小的顆粒狀的物質(zhì)，其主要營養(yǎng)成分有靈芝多糖、三萜類成分等，具有抗癌、免疫增強、護(hù)肝等效應(yīng)[16]。通過查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，其生理機制可能是靈芝多糖可活化T 淋巴細(xì)胞，增強巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）等的產(chǎn)生和釋放[17]。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前市面上大部分增強免疫力的保健食品中都含有枸杞多糖和靈芝孢子粉這2 種成分，且枸杞多糖和靈芝孢子粉各自對人體免疫效應(yīng)有著顯著增強作用。為測定其聯(lián)合作用的最佳配比劑量，首先測定各有效成分的含量，再通過相應(yīng)的免疫效應(yīng)試驗[18]，探究枸杞多糖和靈芝孢子粉2 種成分在不同配比下免疫調(diào)節(jié)功能的強弱程度，找到增強免疫力的最佳劑量組合，為相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 枸杞多糖樣品中所含有的有效多糖的成分含量的測定

1.1.1 材料與儀器

枸杞多糖提取物；無水葡萄糖，苯酚，硫酸，乙醇，乙醚。

紫外-可見分光光度計、ME203E 型電子天平。

1.1.2 制備對照品溶液

稱25 mg 無水葡萄糖加到250 mL 的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的無水葡萄糖的水溶液[19]。

1.1.3 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取0.1 mg/mL 的所配葡萄糖溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加水至2.0 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的苯酚溶液1 m 和硫酸溶液5 mL，在室溫下靜置15 min，之后將其放于50 ℃的水浴鍋內(nèi)進(jìn)行保溫10 min，最后用紫外-可見分光光度法，于波長485 nm 處來測定各組溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。

1.1.4 測定方法

稱量本樣品0.5 g，往樣品中加入50 mL 乙醚，加熱回流，持續(xù)1 h，之后放冷，將乙醚液倒掉，殘渣放在水浴鍋內(nèi)將剩余的乙醚揮發(fā)掉。加入50 mL的乙醇，進(jìn)行加熱回流，持續(xù)1 h，再趁熱將溶液進(jìn)行濾過，濾渣使用20 mL 的乙醇，分多次（至少3 次）洗滌，之后濾渣放在燒瓶中，加水100 mL，進(jìn)行加熱回流，持續(xù)2 h。趁熱進(jìn)行濾過，放冷，將洗滌液一并移至250 mL的容量瓶中，加水定容，搖勻后再量取1 mL，置于具塞試管內(nèi)，加入1 mL水[21]，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，從加入5%的苯酚溶液1 mL起，測吸光度，計算含量。

1.2 靈芝孢子粉樣品中所含有的多糖、總?cè)萍扮薮己繙y定

1.2.1 材料與儀器

已破壁的靈芝孢子粉、無水葡萄糖、齊墩果酸、香草醛、乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、高氯酸、甲醇。

紫外-可見分光光度計、AL204-IC 型電子天平、SC-2546 型離心機、KQ5200 型超聲波清洗器等。

1.2.2 對照品溶液的制備

（1）多糖。無水葡萄糖加蒸餾水配成質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL 的無水葡萄糖的溶液[22]。

（2）三萜及甾醇。適量的齊墩果酸加入甲醇配成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 齊墩果酸溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

（1）多糖。精密吸取所配對照品溶液，分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，加入蒸餾水2 mL，硫酸蔥酮溶液6 mL，搖勻靜置15 min，冰浴冷卻15 min，然后用紫外-可見分光光度法，在適宜的波長處測定各組溶液的吸光度，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）三萜及甾醇。精密吸取所配的齊墩果酸溶液，分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，揮干后再將其放冷，分別加入香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，再分別加入高氯酸溶液0.8 mL，放于50 ℃的水浴鍋中10 min，再冰浴5 min，各加乙酸乙酯溶液2 mL，最后用紫外-可見分光光度法，于波長546 nm 處測定其吸光度，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線[23]。

1.2.4 供試品溶液的制備

（1）多糖。將2 g 樣品粉末放在250 mL 的圓底燒瓶中，加50 mL 水后，在室溫下靜置1 h，同時搭建加熱回流裝置，靜置結(jié)束后令其加熱回流持續(xù)4 h，之后過濾洗滌，再加50 mL 水加熱回流持續(xù)2 h，再過濾揮干，往殘渣里加入乙醇100 mL，然后搖勻，在25 ℃條件下放10 h，離心，把上清倒掉，加適量的熱水溶解后放到100 mL 的容量瓶中，定容后吸取適量該溶液，離心取上清2 mL，置于25 mL 的容量瓶中定容。

（2）三萜及甾醇。稱取5 g 樣品，加100 mL 乙醇，超聲1 h，過濾，之后將濾液置于200 mL 的量瓶，乙醇分多次（至少3 次）洗滌濾渣，洗滌液用引流棒全部倒入容量瓶，最后加入乙醇定容。

1.2.5 測定方法

（1）多糖。吸取2 mL 剛剛配制的供試品溶液，依據(jù)標(biāo)上述方法，從“加入6 mL 的硫酸蔥酮溶液”開始，試驗操作步驟完全一致，測定所配置的供試品溶液的吸光度，帶入公式計算含量。

（2）三萜及甾醇。精密地量取剛剛新配制0.5 mL所配供試品溶液，轉(zhuǎn)移到15 m：試管內(nèi)，依據(jù)上述方法，從“揮干”開始，試驗操作步驟完全一致，測定所配置的供試品溶液的吸光度，帶入公式計算含量。

1.3 試驗項目

單核-巨噬細(xì)胞功能的相關(guān)測定[24]：小鼠碳廓清試驗。

1.3.1 原理

在一定的范圍內(nèi)，經(jīng)小鼠尾靜脈注射擴散至全身的碳顆粒在一定時間內(nèi)含量會遞減，減少的速率通過內(nèi)眥靜脈血中的碳濃度反應(yīng)，減少得越快，光密度值相差越大，細(xì)胞吞噬能力越強。

1.3.2 試驗動物

18～22 g BALB/C 小鼠，SPF 級，雄性，每組10 只，共90 只，隨機分組。

1.3.3 劑量設(shè)計和選擇

根據(jù)文獻(xiàn)資料，選擇枸杞多糖和靈芝孢子粉的劑量范圍[25-32]。

枸杞多糖與靈芝孢子粉復(fù)方二因素六水平見表1。

表1 枸杞多糖與靈芝孢子粉復(fù)方二因素六水平/ mg·kg-1 BW

1.3.4 將試驗動物進(jìn)行隨機分組

采用均勻設(shè)計法，以枸杞多糖和靈芝孢子粉為組成，設(shè)計二因素六水平均勻設(shè)計表，同時設(shè)置陰性對照組。同時設(shè)置一組枸杞多糖700 mg/kg BW（不添加靈芝孢子粉），另一組靈芝孢子粉700 mg/kg BW（不添加枸杞多糖），共9 組。為期45 d。

枸杞多糖與靈芝孢子粉復(fù)方二因素六水平的均勻設(shè)計見表2。

表2 枸杞多糖與靈芝孢子粉復(fù)方二因素六水平的均勻設(shè)計/ mg·kg-1 BW

1.3.5 溶液配制

將現(xiàn)配5 mL 印度墨汁中加入提前準(zhǔn)好的生理鹽水20 mL。

配制Na2CO3溶液時，用天平準(zhǔn)確精密地稱取0.2 g Na2CO3粉末，轉(zhuǎn)移至200 mL 容量瓶中，然后加入蒸餾水至刻度線定容。

1.3.6 注射墨汁

找準(zhǔn)小鼠的尾部靜脈，按照規(guī)定的劑量注射（10 mL/kg BW）[33]，一旦成功注入了試驗小鼠的尾巴，進(jìn)入全身血液，則立即使用計時器開始計時。

1.3.7 測定

一共從小鼠的內(nèi)眥靜脈叢取2 次血，成功地注入印度墨汁后的2 min 為第一次取血，取血量為每次20 μL。使用分光光度計在適宜的波長600 nm 處測其OD1。在取完第1 次血后再計時8 min，到點重復(fù)上述操作測其OD2，兩者進(jìn)行比較。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

吞噬速率用K 表示，計算公式如下，若受試樣品組K 值顯著高過對照組K 值，則可以判斷這項試驗的結(jié)果陽性。因為動物本身的體重和肝脾質(zhì)量會影響小鼠清除體內(nèi)碳顆粒的速率，所以一般是采用校正的吞噬指數(shù)來表示小鼠碳廓清的能力（見下式）。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞多糖有效成分質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定結(jié)果

以葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法測枸杞多糖有效成分的質(zhì)量濃度，以5 組質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為橫坐標(biāo)，將其不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度作為縱坐標(biāo)，可以得到以下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所測得的樣品吸光度為0.412，計算可得樣品枸杞多糖有效成分質(zhì)量濃度為0.42 mg/mL。

枸杞多糖有效成分質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 枸杞多糖有效成分質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 靈芝孢子粉樣品中多糖、總?cè)萍扮薮假|(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定結(jié)果

以葡萄糖為對照品測靈芝孢子粉多糖的質(zhì)量濃度，以5 組標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，取其吸光度為縱坐標(biāo)，描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品吸光度為0.247，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣品靈芝孢子粉多糖質(zhì)量濃度為0.349 mg/mL。

靈芝孢子粉多糖質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 靈芝孢子粉多糖質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用齊墩果酸作為對照品來進(jìn)行靈芝孢子粉總?cè)萍扮薮假|(zhì)量濃度的檢測，以5 組不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為橫坐標(biāo)，取其吸光度為縱坐標(biāo)，描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品吸光度為0.576，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣品靈芝孢子粉總?cè)萍扮薮假|(zhì)量濃度為0.308 mg/mL。

靈芝孢子粉總?cè)萍扮薮己繙y定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 靈芝孢子粉總?cè)萍扮薮假|(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 小鼠碳廓清試驗結(jié)果

2.3.1 試驗結(jié)果

45 d 干預(yù)結(jié)束后，進(jìn)行碳廓清試驗。

各組吞噬指數(shù)、體重、肝指數(shù)和脾指數(shù)結(jié)果比較見表3。

表3 各組吞噬指數(shù)、體重、肝指數(shù)和脾指數(shù)結(jié)果比較

2.3.2 直觀分析法評價結(jié)果

吞噬指數(shù)能夠直觀反映吞噬細(xì)胞的吞噬活力，也即是機體非特異性免疫的能力，如果以吞噬指數(shù)作為評價免疫功能的標(biāo)準(zhǔn)，可知單獨700 mg/kg 的LPB 組為最優(yōu)組。

脾指數(shù)代表了小鼠免疫器官的相對大小，是衡量機體免疫功能的指標(biāo)之一，肝指數(shù)則可以反映小鼠的肝臟功能。如果以脾指數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，可知LBP 700 mg/kg GLSP 350 mg/kg 組為最優(yōu)組；如果以肝指數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，可知單獨700 mg/kg 的LPB 組為最優(yōu)組。

2.3.3 多元二項式回歸模型分析結(jié)果

考慮到LPB 和GLSP 之間可能存在的聯(lián)合作用和其他數(shù)學(xué)關(guān)系，結(jié)合研究實際，回歸模型確定為二次二項式回歸模型，依據(jù)二項式回歸模型，回歸方程為[34]：

在SPSS 統(tǒng)計軟件中采用逐步后退法，LBP 得到吞噬指數(shù)的回歸方程為：

偏回歸系數(shù)R=0.885，決定系數(shù)Rr=0.783，說明該模型對數(shù)據(jù)的擬合程度較高。

同樣，脾指數(shù)的回歸方程為：

偏回歸系數(shù)R=0.942，決定系數(shù)R2=0.888，說明該模型對數(shù)據(jù)的擬合程度較高。

肝指數(shù)與LBP 和GLSP 的關(guān)系不符合線性模型，無法求得回歸方程。

2.3.4 通過回歸方程尋找最佳因素水平組合

本均勻設(shè)計是36 個全面試驗的部分實施，其中最好的試驗點為單獨700 mg/kg 的LPB 組（吞噬指數(shù)最高、肝指數(shù)最低）或LBP 700 mg/kg GLSP 350 mg/kg組（脾指數(shù)最高）。但這種組合不一定是全局最優(yōu)，試圖通過回歸方程找到更好的組合。

由于在查閱文獻(xiàn)資料的過程中沒有找到吞噬系數(shù)和脾指數(shù)在評價小鼠免疫功能時的權(quán)重分布，所以將進(jìn)行分別討論。

使用Excel 提供的規(guī)劃求解工具，根據(jù)回歸方程計算出能夠獲得最大吞噬指數(shù)的最優(yōu)組合，即LBP 700 mg/kg GLSP 35 mg/kg 組。

吞噬指數(shù)的規(guī)劃求解結(jié)果見表4。

表4 吞噬指數(shù)的規(guī)劃求解結(jié)果

同時由于是優(yōu)化試驗，也用Surfer 11 畫出了吞噬指數(shù)的等值線圖。

吞噬指數(shù)的等值線圖見圖4。

圖4 吞噬指數(shù)的等值線圖

同理，使用Excel 規(guī)劃求解工具求得能夠獲得最大脾指數(shù)的最優(yōu)組合，即LBP 700 mg/kg GLSP 700 mg/kg。

脾指數(shù)的規(guī)劃求解結(jié)果見表5，脾指數(shù)的等值線圖見圖5。

表5 脾指數(shù)的規(guī)劃求解結(jié)果

圖5 脾指數(shù)的等值線圖

3 結(jié)論

均勻設(shè)計法主要考慮試驗點“均勻分散性”，而不是“整齊可比性”，因此它能大幅度減少試驗次數(shù)，提高試驗效率，但同時也因此使得組間可比性降低。均勻設(shè)計常使用多元回歸分析，通過擬合回歸模型預(yù)測最佳試驗結(jié)果，精確度較高但過程較為復(fù)雜，且目前均勻設(shè)計回歸分析的一般步驟與方法尚不明晰[35]。

試驗為配方優(yōu)化試驗，根據(jù)試驗結(jié)果可知，單純700 mg/kg 的LPB 組的吞噬指數(shù)平均得分為4.789＞4.758。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是：均勻設(shè)計法以及后續(xù)的回歸分析時沒有并且也不應(yīng)該包含單獨700 mg/kg 的LPB 組，因此擬合回歸方程的過程中不涉及單獨LBP 700 mg/kg 組，求得的最優(yōu)解LBP 700 mg/kg GLSP 350 mg/kg 組與單獨700 mg/kg的LPB 組不可比。根據(jù)回歸方程求得的脾指數(shù)最大組合為LBP 700 mg/kg GLSP 700 mg/kg，此時脾指數(shù)為4.851 大于9 組試驗點中的最大值4.788。

從產(chǎn)品研發(fā)的角度來說，并不需要一味追求吞噬指數(shù)或脾指數(shù)的最大化，相關(guān)保健食品應(yīng)該在綜合考慮LBP 和GLSP 的原料成本的基礎(chǔ)上，找到最合適的相對免疫促進(jìn)最大化的配比組合。從等值線圖的結(jié)果來看，LBP 180 mg/kg GLSP 80 mg/kg 就可以達(dá)到4.55 左右的吞噬指數(shù)水平，相比于空白對照組已經(jīng)提升了15%，應(yīng)該是最具性價比的配比方案。雖然存在邊際效益遞減，但如果研發(fā)商需要做出差異化、區(qū)分度，也可以選擇更高水平的LBP 和GLSP配比。

根據(jù)脾指數(shù)的回歸方程和等值線圖可以看出，相比于GLSP，LBP 對于脾指數(shù)的影響更大且更為均衡，因此在不考慮兩者原料價格的情況下，應(yīng)該首選增加LBP 含量來獲得的免疫效應(yīng)增加。肝指數(shù)可以衡量小鼠肝臟的健康程度，也會影響碳廓清試驗小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬速率，但是在回歸分析中肝指數(shù)沒有表現(xiàn)出與LBP 和GLSP 之間存在線性或非線性回歸關(guān)系，所以將其作為次級指標(biāo)，在主要指標(biāo)相同時輔助選擇。

吞噬指數(shù)反映機體單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能，脾指數(shù)反映脾臟的發(fā)育情況，與機體的細(xì)胞免疫能力有關(guān)，兩者代表機體免疫功能不同方面，因此無法通過權(quán)重法合并。綜合考慮兩者，免疫功能最大化的組合應(yīng)該為LBP 700mg/kg GLSP 700 mg/kg，考慮原料成本的最具性價比組合應(yīng)該在LBP 500 mg/kg GLSP 200 mg/kg 左右。