田 家 英， 張 江 華， 崔 勵(lì)， 王 大 鷙

( 大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一類(lèi)能夠催化水解、酯化等多種反應(yīng)的高效生物催化劑，被廣泛應(yīng)用于食品加工[1]、乳制品[2]、飼料工業(yè)[3]、生物能源[4]、生物醫(yī)藥[5]、洗滌[6]、紡織[7]等領(lǐng)域。脂肪酶在催化反應(yīng)的過(guò)程中，具有較高的立體特異性和區(qū)域特異性及催化條件溫和、環(huán)境友好、能耗低、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。然而，游離脂肪酶在催化過(guò)程中普遍存在穩(wěn)定性、分離性、重復(fù)利用性差等缺點(diǎn)[8]，阻礙對(duì)其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。固定化脂肪酶被認(rèn)為是克服游離脂肪酶上述缺點(diǎn)的有效方法之一。目前，常用的固定化酶技術(shù)主要有吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法，其中交聯(lián)法得到廣泛應(yīng)用，主要因?yàn)槠洳僮骱?jiǎn)便，同時(shí)又能使酶與載體結(jié)合牢固，進(jìn)而提高固定化酶的重復(fù)利用性[9]。固定化酶的另一個(gè)技術(shù)要點(diǎn)為對(duì)固定化載體的選擇，而高分子聚合物因其優(yōu)異的穩(wěn)定性和可控制的孔結(jié)構(gòu)在固定化酶領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)，聚芳醚砜(PAES)因其良好的耐高溫、耐水解和尺寸穩(wěn)定性而被廣泛用作工程塑料[10-12]。PAES的剛性結(jié)構(gòu)，使其熱變形溫度相對(duì)較高，因而可在高溫下長(zhǎng)期使用[13]；此外，PAES表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)的特殊性，使其具有較大的比表面積、更快的吸附速度和良好的生物相容性[13]；再者，PAES具有對(duì)強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的耐受性高、可回收性好等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步表明其具有作為固定化酶優(yōu)良載體的應(yīng)用潛力[14-15]。本文以實(shí)驗(yàn)室自制含羧基側(cè)鏈的PAES多孔聚合物為載體，采用交聯(lián)法進(jìn)行固定化脂肪酶的制備，通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)探究固定化脂肪酶的最佳制備條件，并對(duì)該固定化脂肪酶進(jìn)行催化酯化反應(yīng)的應(yīng)用了初探。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PAES-C，實(shí)驗(yàn)室制備；米曲霉脂肪酶，阿拉丁化學(xué)試劑公司；FA25高剪切均質(zhì)乳化機(jī)，THZ-82A恒溫水浴搖床。

1.2 方 法

1.2.1 固定化脂肪酶的制備

將戊二醛溶解在0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中，得到1.0%的戊二醛溶液。用戊二醛溶液活化PAES-C，同時(shí)在體系中加入等質(zhì)量的脂肪酶。將混合物置于恒溫水浴搖床(200 r/min)中，并在30 ℃下孵育5 h。孵育結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液洗滌2～3次，去除載體表面的戊二醛及未固定的游離酶，室溫干燥后即得到固定化脂肪酶。

1.2.2 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

固定搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，依次改變戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)、戊二醛添加量、pH、固定化時(shí)間、固定化溫度等因素，研究不同變量對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響規(guī)律。各因素水平梯度：戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，戊二醛添加量為1、2、3、4、5 mL，pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，固定化時(shí)間為3、4、5、6、7 h，固定化溫度為20、30、40、50、60 ℃。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素對(duì)固定化脂肪酶的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、pH(B)、固定化溫度(C)3個(gè)影響較為顯著的單因素，并以酶活力為響應(yīng)面值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，從而得到固定化酶的最佳制備條件。試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平

1.2.4 脂肪酶酶活力的測(cè)定方法

參照GB/T 23535—2009的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定脂肪酶的水解活力。

底物溶液的制備：將橄欖油和4%聚乙烯醇溶液以體積比1∶3的比例混合，分兩次使用高剪切均質(zhì)乳化機(jī)進(jìn)行乳化處理，每次持續(xù)3 min，且中間間隔5 min。將所得底物溶液置于冰箱中4 ℃ 儲(chǔ)存，每次使用前需進(jìn)行乳化處理。

脂肪酶水解活力的測(cè)定：向錐形瓶中加4 mL底物溶液和5 mL磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH=7.5)。將該混合液置于37 ℃水浴中保溫5 min，向其中加入固定化酶或一定量游離酶，并在37 ℃、100 r/min反應(yīng)15 min，加入15 mL的95%乙醇終止反應(yīng)。向混合液中滴入3～4滴酚酞指示劑，采用氫氧化鈉溶液(0.05 mol/L)進(jìn)行脂肪酸釋放量的滴定。同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。所有反應(yīng)均采取三平行操作，并取其平均值。酶活力單位(U)是指在37 ℃、pH=7.5、100 r/min條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸(μmol/min)的游離酶量或固定化酶量[16]。

酶活計(jì)算公式[17]：

X=(V-V0)×c×10/tm

式中：V為滴定樣品所消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；V0為滴定空白所消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；c為氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；t為酶反應(yīng)的時(shí)間，15 min；m為加入酶(固定化酶或游離酶)的質(zhì)量，g。

1.2.5 固定化脂肪酶的催化應(yīng)用

所制備固定化脂肪酶具備低耗能、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行生物基衍生物2，5-四氫呋喃二甲醇(THFDM)與脂肪酸間催化酯化反應(yīng)研究具有重要意義。THFDM由5-羥甲基糠醛加氫還原產(chǎn)生，屬于綠色持續(xù)可再生資源，由于該固定化脂肪酶具有低溫下高活性的應(yīng)用特點(diǎn)，選用壬酸與THFDM在35 ℃低溫下、搖床(200 r/min)中反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后，首先將固定化脂肪酶進(jìn)行抽濾分離，并先后用去離子水和碳酸鈉溶液洗滌濾液以除去未反應(yīng)的反應(yīng)物；隨后采用乙酸乙酯萃取該濾液，分離有機(jī)相、旋蒸去除溶劑，所得樣品即為羧酸酯粗產(chǎn)物。對(duì)該粗產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行紅外、核磁表征，分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

如圖1所示，隨著戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，固定化脂肪酶酶活有先增加后減小的趨勢(shì)，且以1.5%戊二醛為交聯(lián)劑時(shí)相對(duì)活性最高。戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于1.5%時(shí)，聚合物載體表面活化不足而易導(dǎo)致酶活低；戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于1.5%時(shí)，戊二醛的過(guò)度自交聯(lián)可能對(duì)脂肪酶的固定化產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，最終導(dǎo)致固定化效率下降。因此，戊二醛對(duì)PAES-C表面活化的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%。

圖1 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

2.2 戊二醛添加量對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

從圖2可知，當(dāng)戊二醛添加量為1～3 mL時(shí)，固定化脂肪酶的酶活呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)，且當(dāng)添加量增至3 mL時(shí)，酶活達(dá)到峰值；當(dāng)戊二醛添加量大于3 mL時(shí)，酶活持續(xù)下降。這可能由于在酶的添加量一定的情況下，當(dāng)戊二醛增加到一定量時(shí)，脂肪酶剛好與戊二醛完全發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)；戊二醛添加量繼續(xù)增加時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)過(guò)剩的戊二醛則容易發(fā)生自交聯(lián)進(jìn)而產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，最終導(dǎo)致酶活出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，戊二醛添加量為3 mL時(shí)，脂肪酶的固定化效果最好。

圖2 戊二醛添加量對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

2.3 pH對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

如圖3所示，在pH 5.0～9.0，隨著pH的升高，脂肪酶活性先呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且當(dāng)pH升高到8.0時(shí)酶活達(dá)到峰值；當(dāng)pH大于8.0時(shí)，脂肪酶活性呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)槲於┰趶?qiáng)堿性環(huán)境中更容易與蛋白質(zhì)分子結(jié)合形成環(huán)狀吡啶的剛性結(jié)構(gòu)，從而抑制酶與底物的結(jié)合，最終導(dǎo)致脂肪酶的活性降低。因此，固定化脂肪酶的最佳pH環(huán)境為8.0。

圖3 pH對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

2.4 固定化時(shí)間對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

如圖4所示，固定化3～6 h固定化脂肪酶的活性呈現(xiàn)先穩(wěn)步上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)固定化時(shí)間增加到6 h時(shí)，酶活性達(dá)到峰值。這可能由于隨著固定化時(shí)間的不斷增加，脂肪酶分子持續(xù)進(jìn)入PAES-C孔洞結(jié)構(gòu)而被負(fù)載，當(dāng)時(shí)間增加到一定程度，PAES-C與酶之間的負(fù)載位點(diǎn)達(dá)到飽和，過(guò)量的脂肪酶則會(huì)發(fā)生聚集，最終導(dǎo)致脂肪酶暴露在表面的活性位點(diǎn)數(shù)量下降[18]。因此，當(dāng)固定化時(shí)間為6 h時(shí)，脂肪酶的固定化效果最佳。

圖4 固定化時(shí)間對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

2.5 固定化溫度對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

如圖5所示，在20 ℃時(shí)脂肪酶活性較低，這可能因?yàn)榈蜏貤l件下，席夫堿反應(yīng)的反應(yīng)速率較低，而載體表面的固定化脂肪酶尚未達(dá)到飽和；隨著溫度的升高，反應(yīng)速率提高，游離脂肪酶與載體結(jié)合更好。不斷升高的溫度會(huì)使脂肪酶失活，導(dǎo)致50 ℃以后脂肪酶活性急劇下降。因此，固定化脂肪酶的最佳制備溫度為40 ℃。

圖5 固定化溫度對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化固定化脂肪酶的制備條件

2.6.1 二次回歸模型擬合及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行回歸擬合。由表2可知，回歸模型具有高度的顯著性，P<0.000 1表明該模型極度顯著，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值比較相符，可以用來(lái)預(yù)測(cè)響應(yīng)值。失擬項(xiàng)為0.301 3(大于0.05)不顯著，說(shuō)明回歸方程擬合程度良好。離散系數(shù)(CV)為7.35%，說(shuō)明模型方程可以較好地反映真實(shí)值。

表2 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

由方差分析結(jié)果可知，固定化溫度對(duì)酶活的影響最大(小于0.000 1)，其次是pH(0.002 0<0.01)，二者都達(dá)到了極度顯著水平。戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活的影響較小，表現(xiàn)為差異顯著(0.039 0<0.05)。交互項(xiàng)中AC、BC差異顯著，表明戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)與固定化溫度、pH與固定化溫度的交互作用對(duì)酶活影響較大，在圖6響應(yīng)面圖中也可明顯看出。

(a) pH與戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.6.2 最佳反應(yīng)條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)得到PAES-C固定化脂肪酶的最佳制備條件：戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，pH為7.46，固定化溫度為40.89 ℃。此條件下，所制備固定化脂肪酶酶活的理論值最大，為1 267.22 U/g。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，各因素水平調(diào)整為戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，pH為7.5，固定化溫度為40 ℃，在此條件下通過(guò)3次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得固定化脂肪酶酶活為1 424.73 U/g。結(jié)果與模型預(yù)測(cè)的理論值相近，說(shuō)明該模型具有有效性。

2.7 固定化脂肪酶的催化應(yīng)用初探

圖7 酯化反應(yīng)粗產(chǎn)物的紅外表征

圖8 酯化反應(yīng)粗產(chǎn)物的碳核磁表征

3 結(jié) 論

以實(shí)驗(yàn)室自制帶羧基側(cè)鏈的PAES-C為載體進(jìn)行固定化脂肪酶的制備，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、固定化溫度為獨(dú)立自變量，固定化脂肪酶酶活為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面法得到固定化脂肪酶的最佳制備條件：戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，pH為7.46，固定化溫度為40.89 ℃。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得固定化脂肪酶酶活對(duì)應(yīng)為1 424.73 U/g，表明該模型可以較好地預(yù)測(cè)固定化脂肪酶酶活。該固定化脂肪酶可在低溫35 ℃ 下催化四氫呋喃二甲醇與壬酸反應(yīng)獲得具有雙酯結(jié)構(gòu)的酯化反應(yīng)產(chǎn)物。本研究為聚合物載體固定化酶的研究提供了一定理論基礎(chǔ)，并拓寬了聚合物在生物領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。