胡 園，馬景新，楊發(fā)龍

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

牛支原體被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)與牛疾病相關(guān)的最重要及最常見的病原之一，可以引起牛的呼吸道疾病、生殖系統(tǒng)疾病、乳房炎及關(guān)節(jié)炎等。牛支原體最早于1961 年從美國患有乳房炎的奶牛中分離，1976年有研究報(bào)道其與各類牛呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)。隨即，牛支原體引起的相關(guān)疾病快速蔓延到多個(gè)國家及地區(qū)的牛群，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文就目前幾種實(shí)驗(yàn)室診斷牛支原體的方法進(jìn)行闡述，以期為臨床上牛支原體病的防控提供參考。

1 微生物學(xué)診斷

傳統(tǒng)的牛支原體種類鑒定和檢測是通過微生物培養(yǎng)進(jìn)行的。由于支原體的結(jié)構(gòu)簡單，不能合成氨基酸，也不能完全或部分合成脂肪酸。為了滿足這種高營養(yǎng)需求，通常選用富含牛心浸出液、血清、酵母提取物、蛋白胨和其他補(bǔ)充物的培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為7.3～7.8。為避免培養(yǎng)分離的支原體受到其他生長較快的細(xì)菌的影響，還應(yīng)在培養(yǎng)基中加入如乙酸鉈或抗生素之類的抗菌劑。

1.1 初步診斷 在牛支原體的分離培養(yǎng)時(shí)首先要進(jìn)行樣本采集，將患病動物的組織病料收集到無菌試管或容器中，冷藏保存，并盡快運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。無菌條件下將樣本接種于固體培養(yǎng)基上，于37 ℃且含5% CO2的條件下培養(yǎng)7～10 d，直到長出大多數(shù)支原體的菌落，在光學(xué)顯微鏡下觀察呈“煎蛋”狀；隨后接種于含有酚紅的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基顏色會由紅色變?yōu)辄S色，之后根據(jù)相關(guān)的生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定［1］。

1.2 鑒別診斷 由于支原體生長培養(yǎng)基有可能長出柔膜體綱的其他幾種微生物，添加的抗菌劑通常會抑制其他細(xì)菌的生長。鑒于大多數(shù)種類的無膽甾原體和支原體都具有“煎蛋”樣形態(tài)，故利用對洋地黃皂苷的敏感性來區(qū)分支原體和無膽甾原體。在含有飽和1.5%洋地黃皂苷的紙片上，支原體周圍存在一個(gè)大的抑菌圈，而無膽甾原體屬只有較小的抑菌圈，甚至不存在抑菌圈［2］。判定為支原體后，還應(yīng)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法來進(jìn)行物種鑒定。

病原分離培養(yǎng)作為檢測牛支原體的傳統(tǒng)方法，其準(zhǔn)確性較高，但實(shí)驗(yàn)操作煩瑣、穩(wěn)定性低、靈敏性低且難度大，培養(yǎng)周期較長，往往貽誤最佳治療時(shí)間，因而不適宜廣泛應(yīng)用。

2 分子診斷

2.1 常規(guī)PCR檢測 20世紀(jì)90年代，以16S rRNA基因?yàn)榘悬c(diǎn)的牛支原體常規(guī)PCR 檢測方法開始應(yīng)用［3］?；谂Ｖгw16S rRNA 的PCR 檢測雖然對大多數(shù)支原體的特異性較好，但對影響小反芻動物的無乳支原體的特異性卻較低［4］。為了檢測多個(gè)種屬的支原體，設(shè)計(jì)了一種以16S～23S rRNA間隔區(qū)為靶點(diǎn)的PCR 方法來區(qū)別支原體和無膽甾原體。也有采用類似的方法，使用支原體特異性引物靶向16S rRNA基因，然后使用變性梯度凝膠電泳（DGGE）分離PCR產(chǎn)物。這種方法能夠鑒別和區(qū)分67種具有公共衛(wèi)生學(xué)意義的支原體，并有助于檢測混合培養(yǎng)物［5］。

2.2 實(shí)時(shí)PCR檢測 雖然常規(guī)PCR檢測與病原分離培養(yǎng)相比具有多種優(yōu)點(diǎn)，但常規(guī)PCR要在循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測PCR產(chǎn)物的量，不能及時(shí)對病原體做出診斷。隨著實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用于支原體的檢測方法主要有SYBR Green染料法和熒光探針法。

2.2.1 SYBR Green染料法SYBR Green 染 料能與所有雙鏈DNA 結(jié)合，在特定波長520 nm 處可進(jìn)行檢測。隨著PCR 循環(huán)的進(jìn)行，目標(biāo)雙鏈DNA數(shù)量的增加，染料發(fā)出的光數(shù)量也呈正比例遞增，從而實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測。這種方法不太常用于檢測牛支原體，但可用于檢測牛奶樣本中的其他支原體。

2.2.2 熒光探針法 為了獲得更高的特異性，實(shí)時(shí)PCR的熒光探針法采用降解探針，除了引物雜交，探針還與引物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)部的靶區(qū)結(jié)合［6］。由于降解探針對目標(biāo)序列具有特異性，大大降低了背景信號，提高檢測的特異性。盡管探針PCR具有更高的特異性，但當(dāng)以牛支原體16S rRNA基因?yàn)榘悬c(diǎn)時(shí)，仍可能發(fā)生無乳支原體的交叉擴(kuò)增。因此，對替代基因的使用進(jìn)行了研究。

已經(jīng)證明uvrC 基因是牛支原體較好的PCR靶點(diǎn)，與包括無乳支原體在內(nèi)的非牛支原體沒有交叉擴(kuò)增。uvrC 基因編碼中的脫氧核糖嘧啶光解酶，是一種與DNA 修復(fù)有關(guān)的復(fù)制所必需的酶，能夠使其成為一個(gè)高度穩(wěn)定的基因。它在牛支原體和無乳支原體中都是一個(gè)穩(wěn)定良好又顯著不同的基因，使其成為比16S rRNA更為特異的靶基因。oppD/F 基因和牛支原體特異性探針的使用已經(jīng)被證明了可以增加PCR 檢測的特異性。進(jìn)一步研究表明，將針對oppD基因的牛支原體特異性PCR與DNA微陣列技術(shù)結(jié)合使用，可以在小牛的鼻拭子和氣管分離物中鑒定出70 多種支原體［7］。

最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了3種基于探針的實(shí)時(shí)PCR方法，用于檢測牛乳和組織樣本中的牛支原體、加利福尼亞支原體和牛生殖道支原體［8］，并為這三種支原體選擇了三個(gè)不同的靶基因：牛支原體的靶基因是fusA，主要編碼mRNA 轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)過程中所必需的延伸因子G；加利福尼亞支原體的靶基因是編碼RNA聚合酶b亞單位的rpoB，該酶是一種在DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程中催化RNA合成的酶；牛生殖道支原體靶基因是16S～23S rRNA基因間隔區(qū)。特異性分析顯示，牛支原體與其他柔膜體綱微生物之間沒有交叉擴(kuò)增。據(jù)此，認(rèn)為新發(fā)現(xiàn)的3 種探針分析方法比部分16S rRNA 基因測序作為參照標(biāo)準(zhǔn)更為準(zhǔn)確。

2.3 其他分子診斷方法 現(xiàn)有脈沖場凝膠電泳（PFGE）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA）和多位點(diǎn)序列分型（MLST）等方法可以對牛支原體進(jìn)行遺傳鑒定。

2.3.1 脈沖場凝膠電泳 脈沖場凝膠電泳是20世紀(jì)80 年代初發(fā)展起來的一種用于支原體菌株分型和鑒定的電泳方法。曾有一項(xiàng)研究調(diào)查了6個(gè)牛養(yǎng)殖場的支原體疾病，通過檢測，發(fā)現(xiàn)39 個(gè)樣本的PFGE 結(jié)果相同，表明牛支原體菌株在牛群中水平傳播，在臨床癥狀消失后，同一菌株又能在牛群內(nèi)的小牛體內(nèi)持續(xù)存在［9］。

2.3.2 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性是一種基于PCR的DNA指紋分析技術(shù)，包括用限制性內(nèi)切酶消化DNA，選擇性擴(kuò)增一部分限制性片段，然后對這些片段進(jìn)行凝膠檢測。曾有人利用該技術(shù)分析了42 頭丹麥牛支原體分離株在1981～1998 年17 年間的遺傳變異，以監(jiān)測其遺傳相關(guān)性［10］。

2.3.3 MLST和MLVA 多位點(diǎn)序列分型（MLST）是基于分離株基因組中的幾個(gè)可被分析出獨(dú)特序列的基因，根據(jù)這些獨(dú)特序列來確定其遺傳關(guān)系。多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA）使用PCR擴(kuò)增DNA的區(qū)域，這些區(qū)域包含重復(fù)序列，而這些重復(fù)序列往往不穩(wěn)定，因此可以根據(jù)所選位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)來區(qū)分不同的分離株。對牛支原體分離株的基因分型，一般把這兩種方法結(jié)合起來，首先用MLST對菌株進(jìn)行鑒定，然后用MLVA進(jìn)行準(zhǔn)確分型。

2.3.4 全基因組測序分析 現(xiàn)在也有研究使用全基因組測序（WGS）來分析比較大量分離株之間的遺傳多樣性。WGS 包括對選定菌株的全基因組進(jìn)行測序，然后用于臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查和控制抗生素耐藥性等。對分離株的完整測序分析也增加了對病原體的了解，并揭示和預(yù)測了一些毒力基因。

3 血清學(xué)診斷

微生物培養(yǎng)和PCR 檢測更多的是為了證明支原體的存在，而間接ELISA 是通過證明血漿、血清和牛奶樣本中存在抗支原體抗體來達(dá)到診斷的目的［11］。

3.1 間接ELISA 間接ELISA 是檢測動物對牛支原體免疫反應(yīng)的一種輔助手段，克服了微生物培養(yǎng)和PCR 檢測的一些不足［12］。雖然微生物培養(yǎng)和PCR 取決于采樣動物所分離的微生物，但ELISA 能夠以體液免疫抗體反應(yīng)的形式檢測病原感染后的情況，體液抗體反應(yīng)通常在感染后持續(xù)一段時(shí)間。當(dāng)這些診斷方法同時(shí)使用時(shí)，ELISA 檢測到的牛支原體陽性率通常要比PCR或分離培養(yǎng)法高得多。然而，牛支原體抗體的存在并不意味著動物一定有牛支原體病原。這一點(diǎn)在牛支原體乳房炎暴發(fā)的情況下得到了證實(shí)，在感染奶牛都被淘汰后，牛群中剩余的其他奶牛盡管沒有發(fā)病，但ELISA 結(jié)果仍呈陽性［13］。僅根據(jù)ELISA 結(jié)果來撲殺動物并不是控制疫情的合理手段，而且可能會導(dǎo)致?lián)錃⑦^度。因此，ELISA結(jié)果應(yīng)結(jié)合其他診斷方法來共同確定。

3.2 抗體水平監(jiān)測 關(guān)于抗體持續(xù)時(shí)間，一項(xiàng)關(guān)于小型奶牛場的研究發(fā)現(xiàn)，在牛支原體感染開始后27周和觀察到末例臨床病例后15周，94%留在牛群中的動物血清中的牛支原體抗體呈陽性。然而，雖然抗體在血清中的持續(xù)時(shí)間可能會很長，但在牛奶樣本中的情況可能并非如此。與血清樣品相比，牛奶樣品中的牛支原體抗體水平可能要低得多，甚至可能檢測不到，也許是由于血清抗體滲入乳房所致。乳清中的免疫球蛋白濃度明顯低于血清，一些免疫球蛋白（包括IgM和IgA）在乳房局部產(chǎn)生，但I(xiàn)gG 通常是ELISA 的靶點(diǎn)，在血液中產(chǎn)生并轉(zhuǎn)移到牛奶中［14］。因此，用ELISA 檢測到的牛支原體抗體在血清中的含量高于牛奶樣品并不奇怪。

4 小結(jié)

支原體能夠在牛群中引起嚴(yán)重疾病，對經(jīng)濟(jì)效益造成重大負(fù)面影響。面對疾病的暴發(fā)，做出快速而準(zhǔn)確的診斷來有效防控尤為重要。就微生物學(xué)診斷來看，盡管取得結(jié)果很慢，但卻培養(yǎng)出了一種確定的分離株，用于DNA 提取和分型，可以調(diào)查感染源和分離株與其他微生物的關(guān)系。PCR 檢測提供的快速診斷結(jié)果有助于及時(shí)提出針對感染牛群的解決方案，以降低疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。血清學(xué)診斷便于為不同畜群或畜群內(nèi)特定個(gè)體的近期感染情況做出評估。臨床上，應(yīng)從預(yù)算成本、診斷的緊迫性、檢測的實(shí)用性、樣本類型和處理?xiàng)l件等方面選用診斷方法。盡管每種診斷方法都有局限性，但聯(lián)合使用將會取長補(bǔ)短?！?/p>